一种加载梯度密度粒子的神经导管及制备方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及生物材料技术领域，进一步地说，是涉及一种加载梯度密度活性粒子的神经导管及制备方法。背景技术：2.由于我国目前临床上周围神经损伤病例已达2000万例，且每年以大约200万例的速度增加，周围神经损伤的修复已成为神经修复领域研究的重大科学问题。临床上的“金标准”为自体移植；然而，自体移植物的来源有限、对供区损害、尺寸不匹配和二次手术等限制了其应用。因此，亟待开发人造神经导管修复神经损伤，以解决自体移植物缺乏的问题。3.目前临床上可用的神经导管材料主要起引导周围神经修复完成后降解的作用，但其生物活性低且鲜有活性粒子的加载，导致周围神经损伤的修复速度较慢。因此，开发能够模拟细胞外基质组成与结构并且提供修复周围神经损伤所需的微环境的神经导管，对于人工合成的神经导管修复周围神经损伤极为重要。技术实现要素：4.为解决现有技术中出现的问题，本发明提供了一种加载梯度密度活性粒子的神经导管及制备方法。在本发明中，通过调控纺丝纤维拓扑结构，同时结合梯度活性粒子结构，实现活性粒子的前期释放、时空可控释放等功能，可解决目前研究存在的难点，从而高效地结合各项促进周围神经修复的诱导信号，调控引导周围神经再生过程中活性粒子从近端向远端释放，促进轴突从近端向远端伸展，有效地加快周围神经修复并提高修复效果。5.本发明的目的之一是提供一种加载梯度密度活性粒子的神经导管。6.所述神经导管包括内层和外层，外层为静电纺丝纤维层；内层为具有梯度密度的生物活性粒子的静电喷雾颗粒层。7.本发明的一种优选的实施方式中，8.所述生物活性粒子在内层结构表面上的沉积密度呈梯度分布。9.本发明的一种优选的实施方式中，10.神经导管的内径范围为0.5-2.0mm。11.本发明的目的之二是提供一种加载梯度密度活性粒子的神经导管的制备方法。12.所述方法包括：13.步骤(1)、将可溶解的脂肪族聚酯或者可溶解脂肪族聚酯和天然高分子聚合物加入到溶剂a中，充分溶解，得到溶液d；14.步骤(2)、将溶液d使用高速转动的辊筒作为接收器进行静电纺丝，得到取向结构的电纺纤维膜；15.步骤(3)、天然高分子聚合物加入溶剂b得到壳层溶液e；生长因子加入溶剂c得到核层溶液f；16.步骤(4)、壳层溶液e和核层溶液f使用移动挡板同轴喷雾到步骤(2)得到的取向结构的电纺纤维膜上，沉积梯度密度的生物活性粒子，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的电纺纤维膜；17.步骤(5)、负载核壳结构静电喷雾颗粒的电纺纤维膜静置，沿垂直于取向方向卷曲成管，使用溶液d粘接，制得所述加载梯度密度活性粒子的神经导管。18.本发明的一种优选的实施方式中，19.步骤(1)，所述溶液d的质量浓度为3～20％；优选为4～18％；。20.本发明的一种优选的实施方式中，21.步骤(1)，22.以脂肪族聚酯为1重量份计，天然高分子聚合物的用量为0～100重量份；23.所述溶剂a选自六氟异丙醇、三氟乙醇、三氯甲烷、甲醇、二氯甲烷、n，n'-二甲基甲酰胺中的至少一种；24.所述可降解脂肪族聚酯为：聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物中的一种或组合；25.所述天然高分子聚合物为：胶原、明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素、弹性蛋白中的一种或组合。26.本发明的一种优选的实施方式中，27.步骤(3)，28.所述溶剂b选自乙酸、六氟异丙醇、三氟乙醇、三氯甲烷、甲醇、二氯甲烷中的至少一种；29.所述溶剂c选自乙酸、水、乙醇、甲醇、生理盐水中的至少一种；和/或，30.所述天然高分子聚合物选自胶原、明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素、弹性蛋白中的至少一种；31.所述的生长因子选自神经生长因子、血管内皮生长因子、脑源性神经生长因子、人酸性成纤维细胞生长因子中的至少一种。32.本发明的一种优选的实施方式中，33.步骤(3)，34.所述壳层溶液e的浓度为5～100mg/ml；优选为10～50mg/ml；35.所述核层溶液f的浓度为0.1～100ug/ml，优选为10～60ug/ml36.本发明的一种优选的实施方式中，37.步骤(4)，38.壳层溶液和核层溶液的用量比为(2～5)：1；39.电纺纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为：1g:(5～50ml)；优选为1g:(15～50ml)。40.本发明的一种优选的实施方式中，41.步骤(2)，42.溶液d推进速率为0.1-10ml/h，电压8～25kv，接收器辊筒转动速度为100-3000rpm，接收距离为10～30cm，纺丝60～1000min。43.本发明的一种优选的实施方式中44.步骤(4)，45.壳层电喷溶液推进速率为0.1～10ml/h，核层电喷溶液推进速率为0.1～8ml/h，电压10～30kv，接收距离为10～25cm，喷雾1～360min；46.移动挡板的长1-20cm，宽为0.5-10cm；移动挡板的移动速度为0.1-10cm/h。47.本发明具体可采用以下技术方案：48.本发明所述的加载活性粒子的神经导管包括内层和外层，所述内层为含梯度浓度的生物活性粒子；所述的生物活性粒子在内层结构表面沉积浓度由近到远依次递减，呈梯度分布。49.本发明所述的制备方法具体包括以下步骤：50.步骤(1)、将可溶解的脂肪族聚酯或者可溶解脂肪族聚酯和天然高分子聚合物加入到溶剂a中，充分溶解，得到溶液d；51.步骤(2)、将溶液d，使用具有转速范围为100-3000rpm高速转动的滚辊筒进行静电纺丝后，得到的取向结构的电纺纤维膜；52.步骤(3)、天然高分子聚合物加入溶剂b得到壳层溶液e；生长因子加入溶剂c得到核层溶液f；53.步骤(4)、使用移动转速为1-10cm/h的挡板，长1-20cm，宽为0.5-10cm，0.1-100mg/ml壳层溶液e、0.1-100ug/ml核层溶液f，同轴静电喷雾到步骤(2)得到的取向结构的电纺纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的电纺纤维膜；54.步骤(5)、电喷结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。将加载梯度密度活性粒子的纤维膜卷曲成管，使用溶液d粘接，制得所述加载梯度密度活性粒子的神经导管，神经导管的内径范围为0.5-2.0mm。55.所述神经导管包括内层和外层，外层为静电纺丝纤维层；内层为具有梯度密度的生物活性粒子的静电喷雾颗粒层。56.本发明的再一目的是提供本发明所述的梯度密度活性粒子的神经导管作为修复周围神经损伤的材料的应用。57.本发明提供的梯度密度活性粒子的神经导管中含有沉积密度梯度增加的生物活性物质粒子，以促进细胞招募与迁移；含有促进周围神经修复的微粒，以通过时空可控递送调控不同细胞的行为。本发明提供的神经导管具有优异的生物相容性和降解性能，可介导细胞的迁移、增殖、分化及轴突伸展，能加快轴突由近端向远端，并提高周围神经损伤的修复效果。附图说明58.图1是本发明的神经导管的取向纤维内层负载梯度浓度的生物活性物质粒子的示意图；从图1中可以看出，通过静电喷雾技术在内部取向纤维表面沉积的活性物质粒子密度呈梯度分布的，沉积密度逐渐降低。59.图2是实施例1的步骤(2)制得的取向纤维的sem图。具体实施方式60.下面结合具体附图及实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。61.实施例中所用原料均为市售。62.实施例163.步骤(1).取聚己内酯溶于二氯甲烷中，室温磁力搅拌24h，得到质量浓度为15％的溶液d；64.步骤(2).用溶液d进行静电纺丝，用转速为1000rpm的辊筒作为接收器，溶液d推进速率为8.0ml/h，电压19kv，接收距离为18cm，纺丝1000min，得到单轴取向的聚己内酯纳米纤维膜；65.步骤(3).取层粘连蛋白、纤连蛋白溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌24h后充分混合，得到壳层溶液e，浓度为15mg/ml；取血管内皮生长因子加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液f，浓度为10ug/ml，聚己内酯纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为：1g:40ml；壳层溶液和核层溶液的用量比为2：1；66.步骤(4)、使用移动转速为10cm/h的挡板，长20cm，宽为3cm，更换纺丝液为壳层溶液e和核层溶液f，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(2)中得到的单轴取向的聚己内酯纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为3.0ml/h，核层电喷溶液推进速率为1.0ml/h，电压25kv，接收距离为12cm，喷雾60min，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的聚己内酯纤维膜；同轴静电喷雾到步骤(2)得到的取向结构的电纺纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的电纺纤维膜；67.步骤(5)、电喷结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。将加载梯度密度活性粒子的纤维膜卷曲成管，使用溶液d粘接，制得所述加载梯度密度活性粒子的神经导管，神经导管的内直径为0.8mm。68.实施例269.步骤(1).取聚乳酸溶于三氟乙醇中，室温磁力搅拌20h，得到质量浓度为5％的溶液d；70.步骤(2).用溶液d进行静电纺丝，用转速为2000rpm的辊筒作为接收器，溶液d推进速率为5.0ml/h，电压16kv，接收距离为13cm，纺丝1000min，得到单轴取向的聚乳酸纳米纤维膜；71.步骤(3).取层纤连蛋白溶解于三氟乙醇中，室温磁力搅拌24h后充分混合，得到壳层溶液e，浓度为35mg/ml；取血管内皮生长因子、神经生长因子加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液f，浓度为50ug/ml，聚乳酸纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为：1g:30ml；壳层溶液和核层溶液的用量比为3：1；72.步骤(4)、使用移动转速为5cm/h的挡板，长15cm，宽为5cm，更换纺丝液为壳层溶液e和核层溶液f，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(2)中得到的单轴取向的聚乳酸纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为5ml/h，核层电喷溶液推进速率为2.5ml/h，电压30kv，接收距离为12cm，喷雾30min，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的聚乳酸纤维膜；同轴静电喷雾到步骤(2)得到的取向结构的电纺纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的电纺纤维膜；73.步骤(5)、电喷结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。将加载梯度密度活性粒子的纤维膜卷曲成管，使用溶液d粘接，制得所述加载梯度密度活性粒子的神经导管，神经导管的内直径范围为0.45mm。74.实施例375.步骤(1).取聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于三氯甲烷、n，n'-二甲基甲酰胺中，室温磁力搅拌8h，得到质量浓度为8％的溶液d；76.步骤(2).用溶液d进行静电纺丝，用转速为1500rpm的辊筒作为接收器，溶液d推进速率为4.0ml/h，电压26kv，接收距离为28cm，纺丝840min，得到单轴取向的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米纤维膜；77.步骤(3).取层粘连蛋白溶解于无菌水溶液中，室温磁力搅拌24h后充分混合，得到壳层溶液e，浓度为30mg/ml；取脑源性神经生长因子、人酸性成纤维细胞生长因子加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液f，浓度为50ug/ml，聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为：1g:20ml；壳层溶液和核层溶液的用量比为4：1；78.步骤(4)、使用移动转速为4cm/h的挡板，长15cm，宽为3cm，更换纺丝液为壳层溶液e和核层溶液f，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(2)中得到的单轴取向的聚己内酯纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为1.6ml/h，核层电喷溶液推进速率为0.4ml/h，电压25kv，接收距离为12cm，喷雾50min，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜；同轴静电喷雾到步骤(2)得到的取向结构的电纺纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的电纺纤维膜；79.步骤(5)、电喷结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。将加载梯度密度活性粒子的纤维膜卷曲成管，使用溶液d粘接，制得所述加载梯度密度活性粒子的神经导管，神经导管的内径范围为0.6mm。80.实施例481.步骤(1).取聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于甲醇、二氯甲烷中，室温磁力搅拌18h，得到质量浓度为5％的溶液d；82.步骤(2).用溶液d进行静电纺丝，用转速为1800rpm的辊筒作为接收器，溶液d推进速率为4.0ml/h，电压20kv，接收距离为22cm，纺丝1200min，得到单轴取向的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米纤维膜；83.步骤(3).取胶原、层粘连蛋白溶解于无菌水溶液中，室温磁力搅拌20h后充分混合，得到壳层溶液e，浓度为40mg/ml；取神经生长因子、人酸性成纤维细胞生长因子加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液f，浓度为60ug/ml，聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为：1g:40ml；壳层溶液和核层溶液的用量比为2.5：1；84.步骤(4)、使用移动转速为3cm/h的挡板，长15cm，宽为3cm，更换纺丝液为壳层溶液e和核层溶液f，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(2)中得到的单轴取向的聚己内酯纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为6.0ml/h，核层电喷溶液推进速率为3.0ml/h，电压28kv，接收距离为16cm，喷雾50min，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜；同轴静电喷雾到步骤(2)得到的取向结构的电纺纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的电纺纤维膜；85.步骤(5)、电喷结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。将加载梯度密度活性粒子的纤维膜卷曲成管，使用溶液d粘接，制得所述加载梯度密度活性粒子的神经导管，神经导管的内直径范围为0.75mm。86.实施例587.步骤(1).取聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物溶于二氯甲烷、n，n'-二甲基甲酰胺中，室温磁力搅拌24h，得到质量浓度为7％的溶液d；88.步骤(2).用溶液d进行静电纺丝，用转速为3000rpm的辊筒作为接收器，溶液d推进速率为3.0ml/h，电压25kv，接收距离为29cm，纺丝840min，得到单轴取向的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纳米纤维膜；89.步骤(3).取明胶、胶原溶解于无菌水溶液中，室温磁力搅拌20h后充分混合，得到壳层溶液e，浓度为20mg/ml；取血管内皮生长因子、脑源性神经生长因子、人酸性成纤维细胞生长因子加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液f，浓度为45ug/ml，聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为：1g:21ml；壳层溶液和核层溶液的用量比为3.5：1；90.步骤(4)、使用移动转速为8cm/h的挡板，长8cm，宽为5cm，更换纺丝液为壳层溶液e和核层溶液f，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(2)中得到的单轴取向的聚己内酯纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为3.5ml/h，核层电喷溶液推进速率为2.0ml/h，电压25kv，接收距离为13cm，喷雾40min，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜；同轴静电喷雾到步骤(2)得到的取向结构的电纺纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的电纺纤维膜；91.步骤(5)、电喷结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。将加载梯度密度活性粒子的纤维膜卷曲成管，使用溶液d粘接，制得所述加载梯度密度活性粒子的神经导管，神经导管的内直径范围为1.6mm。92.实施例693.步骤(1).取聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物溶于六氟异丙醇、三氟乙醇中，室温磁力搅拌30h，得到质量浓度为9％的溶液d；94.步骤(2).用溶液d进行静电纺丝，用转速为3000rpm的辊筒作为接收器，溶液d推进速率为2.5ml/h，电压24kv，接收距离为13cm，纺丝900min，得到单轴取向的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纳米纤维膜；95.步骤(3).取明胶、胶原溶解于无菌水溶液中，室温磁力搅拌20h后充分混合，得到壳层溶液e，浓度为20mg/ml；取神经生长因子、脑源性神经生长因子、人酸性成纤维细胞生长因子加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液f，浓度为45ug/ml，聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为：1g:21ml；壳层溶液和核层溶液的用量比为4.5：1；96.步骤(4)、使用移动转速为6cm/h的挡板，长11cm，宽为4cm，更换纺丝液为壳层溶液e和核层溶液f，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(2)中得到的单轴取向的聚己内酯纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为2.5ml/h，核层电喷溶液推进速率为0.8ml/h，电压21kv，接收距离为17cm，喷雾25min，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物纤维膜；同轴静电喷雾到步骤(2)得到的取向结构的电纺纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载核壳结构静电喷雾颗粒的电纺纤维膜；97.步骤(5)、电喷结束后，将纺丝膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。将加载梯度密度活性粒子的纤维膜卷曲成管，使用溶液d粘接，制得所述加载梯度密度活性粒子的神经导管，神经导管的内直径范围为1.8mm。









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