五种来源于红小豆蛋白的胰脂肪酶抑制剂及其应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本技术属于蛋白领域，具体地，本技术提供了五种来源于红小豆蛋白的胰脂肪酶抑制剂及其应用。背景技术：2.膳食脂肪主要以甘油三酯的形式存在，但这种分子不能在肠道中吸收，除非被水解成更小的分子，例如甘油单酯和游离脂肪酸。胰脂肪酶是一种由胰腺分泌的水溶性脂肪分解酶，在甘油三酯的消化中发挥着重要作用，它可以消化食物中50％-70％的膳食脂肪，是人体主要的脂肪分解酶。膳食摄入的脂质先经过胰脂肪酶水解，分解成乳糜微粒后与胆固醇、胆盐等形成胶团，最后在肠道内被细胞吸收，但过度水解会导致高脂血症等疾病的发展。3.高脂血症主要体现为体内甘油三酯或胆固醇水平过高。近年来，随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，高脂血症患者人群比例急剧上升。根据《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》，我国成年人血脂异常总体患病率高达40.40％，已经成为现代社会高发病率之一的疾病。目前，研发治疗高脂血症的药物和辅助性功能性食品已成为医药界、食品生物技术界和营养学界的研究热点。作为脂质消化吸收的关键酶，胰脂肪酶在维持体内脂代谢平衡中发挥着极其重要的作用，其活性在很大程度上决定了高脂血症的发生。胰脂肪酶抑制剂通过抑制胰脂肪酶的活性可有效抑制膳食中脂肪的吸收，从而达到治疗高脂血症的目的。奥利司他是市场上被广泛认同和购买使用的胰脂肪酶抑制剂类药物，但具有失眠、乏力、恶心、呕吐、肠胃气胀，甚至心律失常、心力衰竭、猝死等副作用。因此，有必要从天然产物中找到更有效、更安全的胰脂肪酶抑制剂，尤其是从食物蛋白中获得具有降脂活性的多肽作为预防和治疗高脂血症的替代药物具有较好发展前景。先前的研究发现红小豆蛋白水解物能够显著抑制胰脂肪酶的活性。基于此，我们通过超滤、质谱测序等技术筛选出红小豆蛋白水解物中的降脂肽并进行功能验证，为开发安全有效的胰脂肪酶抑制剂提供技术支持。技术实现要素：4.一方面，本技术提供了具有胰脂肪酶抑制剂效果的肽，其特征在于，所述肽的序列选自seq id no.1-5。5.进一步地，所述肽的序列为seq id no.4或seq id no.5。6.另一方面，本技术提供了组合物，其特征在于，所述组合物包含上述肽以及药学、食品或保健品上可接受的辅料。7.另一方面，本技术提供了上述肽或者组合物在制备胰脂肪酶抑制剂中的用途。8.另一方面，本技术提供了上述肽或者组合物在制备治疗高脂血症的药物中的应用。9.另一方面，本技术提供了上述肽或者组合物在制备适用于高脂血症人群的食品或保健品中的应用。10.另一方面，本技术提供了筛选上述肽的方法，其特征在于，所述方法包括：11.(1)体外模拟消化：使用酶法对红小豆蛋白进行水解以得到蛋白水解物；12.(2)降脂肽的筛选：以胰脂肪酶活性抑制率为评价指标，在红小豆蛋白水解物的不同超滤级分中筛选出具有最佳降脂活性的部分。然后通过质谱测序和虚拟筛选技术找出与胰脂肪酶对接效果较好的肽段；13.(3)抑制效果及机理分析：以胰脂肪酶活性抑制率为评价指标，对采用fmoc固相合成方法制备的降脂肽进行抑制效果评价，并进一步通过分子对接阐明其抑制作用机理。为了解降脂肽更多的特性，最后基于计算机软件评估其毒性、等电点、空间位阻、总平均亲水性和人体肠道吸收性。14.进一步地，所述水解使用胃蛋白酶和胰酶。15.进一步地，所述超滤级分为＜3kda、3-10kda和＞10kda级分。16.有益效果：17.本发明所述从红小豆蛋白中首次发现的五种降脂肽(ylqgfgknil、lkqahgqeflpnp、fpfklpaweqghd、llggldssllph、ifnndpnnhp)是植物源的、无毒无害的天然物质，并且具备显著的降脂功效。胰脂肪酶在维持体内脂代谢平衡中发挥着极其重要的作用，其活性在很大程度上决定了高脂血症的发生。ylqgfgknil、lkqahgqeflpnp、fpfklpaweqghd、llggldssllph、ifnndpnnhp通过抑制胰脂肪酶的活性从而达到降脂的作用，并且这也得到体外酶活性抑制实验和分子对接的证实。因此，本发明所述ylqgfgknil、lkqahgqeflpnp、fpfklpaweqghd、llggldssllph、ifnndpnnhp作为降脂活性成分，具有良好的降脂作用，无毒，并且其作用机理清楚、靶点明确，有望成为预防和治疗高脂血症的替代药物，在医药和功能性食品行业具有良好的市场前景。附图说明18.图1为不同超滤级分对胰脂肪酶活性的抑制结果；19.图2为筛选肽段对胰脂肪酶活性的抑制结果；20.图3为筛选肽段与胰脂肪酶在活性位点处对接后的最佳位置概述和细节(a:ylqgfgknil；b:lkqahgqeflpnp；c:fpfklpaweqghd；d:llggldssllph；e:ifnndpnnhp)；其中胰脂肪酶残基用黄棒模型表示。蓝色、灰色、黄色和绿色虚线分别表示氢键、疏水相互作用、盐桥和π-π堆积。具体实施方式21.实施例1红小豆蛋白的提取22.采用碱溶酸沉的方法提取红小豆蛋白。具体而言，脱脂红小豆粉和蒸馏水以料液比1:10(w/v)混合，并调节溶液ph值至8.5。在40℃条件下水浴震荡1h后，收集上清液，并在上清液ph值调至4.5后，于室温下静置1h使蛋白沉淀。收集沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀3次，并将蛋白质的ph值调节至7.0。最后，冷冻干燥并保存在-20℃。23.实施例2体外模拟消化24.采用双酶(胃蛋白酶和胰酶)法对红小豆蛋白进行水解以得到蛋白水解物。具体而言，首先在5％的红小豆蛋白溶液中加入4％(w/w)胃蛋白酶，酶解ph为2.0，酶解温度为37℃，酶解时间为2h；随后将酶解液ph值调至5.3，再将ph值维持在7.5，加入4％胰酶(w/w)，酶解温度为37℃，酶解时间为2h。酶解结束后，沸水浴灭酶10min，酶解液离心取上清。25.实施例3降脂肽的筛选26.通过使用10kda和3kda离心过滤器对步骤(2)收集的上清液进行超滤以得到不同级分(》10kda、3-10kda和《3kda)。以胰脂肪酶活性抑制率为评价指标，在4mg/ml浓度下观察各个级分对胰脂肪酶活性的影响，结果表明《3kda级分对胰脂肪酶活性抑制效果最好(见图1)。胰脂肪酶活性抑制实验具体过程为：27.在96孔酶标板中，将50μl的样品、40μl的2.5mg/ml胰脂肪酶溶液和50μl的10mm对硝基苯丁酸酯作为底物，在ph 7.3的磷酸缓冲液中37℃孵育30min。酶标仪在405nm处记录吸光度。使用奥利司他作为阳性对照，并根据公式(1)进行计算。[0028][0029]式(1)中：a：对照的吸光度；b：对照空白的吸光度；c：样品的吸光度；d：样品空白的吸光度。[0030]采用液相色谱-串联质谱对《3kda级分进行质谱测序，并利用dock 6.9对得到的肽序列进行虚拟筛选，根据肽段的对接打分(《-110kcal/mol)筛选得到与胰脂肪酶对接效果较好的肽段ylqgfgknil、lkqahgqeflpnp、fpfklpaweqghd、llggldssllph、ifnndpnnhp(见表1)表1.虚拟筛选中与胰脂肪酶对接效果较好的肽段[0031][0032]实施例4抑制效果及机理分析[0033]采用fmoc固相合成法制备降脂肽，并通过高效液相色谱和质谱分析，确定每种肽纯度均大于95％。经胰脂肪酶活性抑制实验发现，在4mg/ml的浓度下，ylqgfgknil、lkqahgqeflpnp、fpfklpaweqghd、llggldssllph、ifnndpnnhp的胰脂肪酶抑制率分别是40.33％、46.01％、46.49％、60.26％和62.60％(见图2)。[0034]从rcsb protein data bank数据库(http://www.rcsb.org/)获取胰脂肪酶(pdb编号：1eth)的晶体结构，采用dock 6.9分别将ylqgfgknil、lkqahgqeflpnp、fpfklpaweqghd、llggldssllph、ifnndpnnhp与胰脂肪酶进行半柔性对接，确定其与胰脂肪酶作用的关键氨基酸残基及相互作用力(见图3)。由图3可知，ylqgfgknil肽可与9个氨基酸残基相互作用，并且相互作用包括氢键和疏水相互作用。ylqgfgknil肽能与底物结合残基(phe78、ile79、trp253、phe216)形成疏水相互作用(见图3a)。lkqahgqeflpnp肽可与7个氨基酸残基相互作用，并且相互作用只包括疏水相互作用(见图3b)。fpfklpaweqghd肽可与8个氨基酸残基相互作用，并且相互作用包括疏水相互作用和盐桥。fpfklpaweqghd肽能与底物结合残基(phe216、ile79、trp253)形成疏水相互作用(见图3c)。llggldssllph肽可与11个氨基酸残基相互作用，并且相互作用包括氢键、疏水相互作用和盐桥。llggldssllph肽能与催化残基(ser153和his264)形成氢键和盐桥，以及和底物结合残基(phe78、phe216、his152)形成疏水相互作用和盐桥(见图3d)。ifnndpnnhp肽可与9个氨基酸残基相互作用，并且相互作用包括氢键、疏水相互作用、盐桥和π-π堆积。ifnndpnnhp肽能与催化残基(ser153和his264)形成氢键和盐桥，以及和底物结合残基(phe216、arg257、his152)形成疏水相互作用、盐桥和π-π堆积(见图3e)。总之，降脂肽主要通过占据催化或底物结合位点来抑制胰脂肪酶的活性。[0035]计算机软件被用来对ylqgfgknil、lkqahgqeflpnp、fpfklpaweqghd、llggldssllph、ifnndpnnhp进行特性预测，其中毒性和空间位阻通过toxinpred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/index.html)，总平均亲水性通过expasy(https://web.expasy.org/protparam/)，人体肠道吸收通过admetsar(http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/home/)，等电点通过pepdraw(http://www.tulane.edu/～biochem/ww/pepdraw/)评估。如表2所示，五种降脂肽均是无毒的。ylqgfgknil和lkqahgqeflpnp的等电点大于7，表明它呈碱性，而fpfklpaweqghd、llggldssllph和ifnndpnnhp呈酸性。总平均亲水性可以用来表征蛋白质的亲疏水性，其中正值越大表明疏水性越强，负值越大表明亲水性越强，故lkqahgqeflpnp、fpfklpaweqghd和ifnndpnnhp具有更好的亲水性，而ylqgfgknil和llggldssllph具有更好的疏水性。5个降脂肽的空间位阻值在0.52-0.66之间，其中llggldssllph具有最低的空间位阻值，这有利于增强对胰脂肪酶的抑制。[0036]表2.筛选肽段的特性预测[0037]









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!