一种高灵敏度病毒核酸提取试剂盒的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种高灵敏度病毒核酸提取试剂盒。背景技术：2.在分子生物学实验中，核酸提取是一项最基本且最重要的环节，核酸提取的产量、纯度及完整性直接关系到下游核酸检测、生物学研究或其他新产品开发的成败。磁珠法核酸提取方法是指以超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠(以下简称磁珠)为载体，通过磁珠在高盐溶液中吸附核酸，经过磁性分离和漂洗杂质后，在低盐溶液中核酸从磁珠表面解吸附的原理进行核酸提取的方法。该方法不需离心，操作简单，便于高通量、自动化操作，可以使核酸提取效率显著升高，已成为目前主流的核酸提取技术。3.目前市面上磁珠法的核酸提取试剂盒已经较为成熟，普遍具备高通量、自动化、提取时间短等优势，但存在提取灵敏度较低的弊端。cn102220310b提供了一种提取纯化人体唾液dna的方法，但是其组份含有蛋白酶k，成本较高，且需要冰袋运输，增加了运输成本，增加了应用场景的限制，且该配方预处理时，需要进行56℃温浴30min，对设备要求较多。cn108330127b提供了一种磁珠混合液、核酸保存方法、核酸提取试剂及试剂盒，但其仍具有蛋白酶k。cn109022420a提供了一种用于基于磁珠的dna提取方法的裂解液，但是其组份也含有蛋白酶k，且裂解温度需要为56℃至65℃。cn110684764b提供一种用于核酸提取的裂解液、核酸提取试剂盒及核酸提取方法，虽然不需要蛋白酶k，常温裂解，但提取的灵敏度较低，无法做到低浓度样本的提取。市面上的核酸提取试剂盒大多数只能做到500copies/ml的提取下限，面对更低浓度的样本提取效果较差甚至提取不出来，导致假阴性误判。4.基于此，有必要针对上述问题，提供一种核酸提取试剂盒，能够有更高的灵敏度，针对低浓度样本可以准确提取出来，极大的提高检测效率。技术实现要素：5.发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种高灵敏度病毒核酸提取试剂盒，以提高病毒检测灵敏度，提高检测效率。6.技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：7.本发明提供了一种高灵敏度核酸提取试剂盒，能够快速提取病毒核酸，通过裂解、漂洗、洗脱等一系列流程，使得核酸从样本中提取出来，裂解液中含有的胍盐、表面活性剂、金属离子等将样本的蛋白质外壳裂解，使核酸暴露出来，通过纳米磁珠的特异性结合作用，将核酸结合在磁珠上，然后经过两种不同的漂洗液，将核酸上携带着的蛋白质和金属离子等杂质清洗干净，最后将磁珠上的核酸溶解于洗脱液中，得到纯净、高浓度的核酸。通过上述各组分的协同作用，本发明的核酸提取试剂可以将样品中的核酸在室温下直接提取出，避免因加热产生气溶胶导致的样品污染问题，更重要的是提取出来的核酸纯度和浓度较高，最低提取下限100copies/ml，提取低浓度样本能力较强，能有效避免假阴性问题。8.一种高灵敏度的病毒核酸提取试剂盒，该试剂盒包括病毒裂解液、磁珠缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、洗脱液；9.所述病毒裂解液，包括1-5m的异硫氰酸胍，1-5m的碘化钠，10-100g/l的sls，10-100ml/l的曲拉通-100，10-200mm的edta-2na，200-500ml/l的异丙醇，所述病毒裂解液的ph值为7.0-8.0；优选3m的异硫氰酸胍、3m的碘化钠、50g/l的sls、100ml/l的曲拉通-100、100mm的edta-2na、200ml/l的异丙醇，所述病毒裂解液的ph值优选为7.4；10.所述磁珠缓冲液，其含有浓度为50mg/ml的磁珠，0.1ml/l的防腐剂proclin300；优选50mg/ml的磁珠，0.1ml/l的防腐剂proclin 300。11.所述漂洗液1，其含有0.1-1m的氯化钠和300-700ml/l的异丙醇；优选1m的氯化钠和600ml/l的异丙醇。12.所述漂洗液2，其含有0.1-0.5m的氯化钠和600-900ml/l的乙醇，优选0.1m的氯化钠和800ml/l的乙醇。13.所述洗脱液，其含有1ml/l的depc，优选1ml/l的depc水溶液。14.所述含病毒核酸的生物样本与所述病毒裂解液以1:1的体积比混合。15.上述高灵敏度的病毒核酸提取试剂盒在病毒核酸提取中的应用在本发明的保护范围之内。16.应用上述高灵敏度的病毒核酸提取试剂盒提取病毒核酸的方法，包括如下步骤：17.(1)预处理：用病毒裂解液裂解含病毒核酸的生物样本，得到粗裂解液；18.(2)核酸吸附：将步骤1)得到的粗裂解液与磁珠缓冲液混合，形成含有磁性纳米微球-核酸的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球-核酸的复合体；19.(3)洗涤：将步骤2)得到的磁性纳米微球-核酸复合体依次用漂洗液1、漂洗液2洗涤，然后用洗脱液溶出核酸，得到纯化的核酸。20.有益效果：21.(1)操作简单，不需预处理，不需要加蛋白酶k，直接进行样本的提取；22.(2)灵敏度高，最低可提取100copies/ml浓度的样本，有效避免假阴性问题；23.(3)对实验室和实验操作人员的污染风险小：整个核酸提取的过程均在室温下进行，可有效降低气溶胶的污染，能有效的保护实验操作人员。附图说明24.图1本发明的核酸提取试剂提取500copies/ml的样本荧光定量pcr扩增曲线(orf1ab基因)。25.图2本发明的核酸提取试剂提取500copies/ml的样本荧光定量pcr扩增曲线(n基因)。26.图3本发明的核酸提取试剂提取100copies/ml的样本荧光定量pcr扩增曲线(orf1ab基因)。27.图4本发明的核酸提取试剂提取100copies/ml的样本荧光定量pcr扩增曲线(n基因)。具体实施方式：28.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。29.以下实施例中涉及的试剂均是市场购买的常规试剂。30.实施例1：31.一种高灵敏度的核酸提取试剂盒，包括以下组分：32.病毒裂解液：浓度为3m的异硫氰酸胍，3m的碘化钠，50g/l的sls，100ml/l的曲拉通-100，100mm的edta-2na，200ml/l的异丙醇；33.磁珠缓冲液：浓度为50mg/ml的磁珠，0.1ml/l的proclin 300；34.漂洗液1：1m的氯化钠，600ml/l的异丙醇；35.漂洗液2：0.1m的氯化钠，800ml/l的乙醇；36.洗脱液：1ml/l的depc。37.准备3份装甲rna呼吸道病毒咽拭子模拟样本，分别取200μl样本，加入到裂解液中，根据如下方法进行核酸提取：38.(1)预处理：用病毒裂解液裂解含病毒核酸的生物样本，病毒裂解液与生物样本的体积比为(0.5～2)：1，得到粗裂解液；39.(2)核酸吸附：将步骤(1)得到的粗裂解液与磁珠缓冲液按照体积比为1:1混合，形成含有磁性纳米微球-核酸的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球-核酸的复合体；40.(3)洗涤：将步骤2)得到的磁性纳米微球-核酸复合体依次用漂洗液1(500ul)、漂洗液2(700ul)洗涤，然后用洗脱液(80μl)溶出核酸，得到纯化的核酸溶液。41.取5μl核酸溶液与20μlpcr反应液混合进行实时荧光定量pcr扩增。42.pcr扩增试剂使用购自宝锐的5×neoscript fast rt rremix-ung(probe qrt-pcr)(货号：m5244)和百利格合成的新冠引物探针，配置方式如表1所示。43.表1实时荧光定量pcr扩增体系44.试剂使用量5x neoscript fast rt buffer5μl25x neoscript fast rtase/ung mix1μlorf1ab-f0.5μlorf1ab-r0.5μlorf1ab-p0.5μln-f1.25μln-r1.25μln-p1.25μlddh2o8.75μltemplate rna5μltotal25μl45.表2实时荧光定量pcr程序[0046][0047][0048]实施例2：[0049]病毒裂解液：浓度为1.5m的异硫氰酸胍，2.5m的碘化钠，10g/l的sls，10g/l的曲拉通-100，100mm的edta-2na，400ml/l的异丙醇，ph7.4；[0050]磁珠缓冲液：浓度为50mg/ml的磁珠，0.1ml/l的proclin 300；[0051]漂洗液1：1m的氯化钠，600ml/l的异丙醇；[0052]漂洗液2：0.1m的氯化钠，800ml/l的乙醇；[0053]洗脱液：1ml/l的depc。[0054]实施例3[0055]病毒裂解液：浓度为2m的异硫氰酸胍，2m的碘化钠，10g/l的sls，50g/l的曲拉通-100，10mm的edta-2na，200ml/l的异丙醇，ph7.4；[0056]磁珠缓冲液：浓度为50mg/ml的磁珠，0.1ml/l的proclin 300；[0057]漂洗液1：1m的氯化钠，600ml/l的异丙醇；[0058]漂洗液2：0.1m的氯化钠，800ml/l的乙醇；[0059]洗脱液：1ml/l的depc。[0060]对比例1：[0061]市购的西安某科技有限公司的核酸提取试剂盒(对照试剂盒，内含裂解液、磁珠缓冲液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液)。[0062]表3实施例1～3与对比例1的实时荧光定量pcr结果[0063][0064]结果显示，实施例1核酸提取试剂的提取效果明显要优于实施例2-3和对比例1的核酸提取试剂，相同样本ct值靠前超1个ct。[0065]实施例4[0066]病毒裂解液：浓度为3m的异硫氰酸胍，3m的碘化钠，50g/l的sls，100g/l的曲拉通-100，100mm的edta-2na，200ml/l的异丙醇，ph7.4；[0067]磁珠缓冲液：浓度为50mg/ml的磁珠，0.1ml/l的proclin 300；[0068]漂洗液1：1m的氯化钠，700ml/l的异丙醇；[0069]漂洗液2：0.1m的氯化钠，900ml/l的乙醇；[0070]洗脱液：1ml/l的depc。[0071]实施例5：[0072]病毒裂解液：浓度为3m的异硫氰酸胍，3m的碘化钠，50g/l的sls，100g/l的曲拉通-100，100mm的edta-2na，200ml/l的异丙醇，ph7.4；[0073]磁珠缓冲液：浓度为50mg/ml的磁珠，0.01％的proclin 300；[0074]漂洗液1：0.1m的氯化钠，700ml/l的异丙醇；[0075]漂洗液2：0.1m的氯化钠，600ml/l的乙醇；[0076]洗脱液：1ml/l的depc。[0077]实施例6：[0078]病毒裂解液：浓度为3m的异硫氰酸胍，3m的碘化钠，50g/l的sls，100g/l的曲拉通-100，100mm的edta-2na，200ml/l的异丙醇，ph7.4；[0079]磁珠缓冲液：浓度为50mg/ml的磁珠，0.1ml/l的proclin 300；[0080]漂洗液1：0.1m的氯化钠，300ml/l的异丙醇；[0081]漂洗液2：0.5m的氯化钠，900ml/l的乙醇；[0082]洗脱液：1ml/l的depc。[0083]表4实施例4～6的实时荧光定量pcr结果[0084][0085][0086]结果显示，实施例1核酸提取试剂的提取效果明显要优于实施例4-6的核酸提取试剂，相同样本ct值靠前约2个ct，说明漂洗液1和漂洗液2中氯化钠、异丙醇、乙醇的浓度对核酸提取效果有影响。[0087]对比例2：[0088]病毒裂解液：浓度为0.5m的异硫氰酸胍，0.5m的碘化钠，0.50g/l的sls，0.50g/l的曲拉通-100，400mm的edta-2na，600ml/l的异丙醇；[0089]磁珠缓冲液：浓度为50mg/ml的磁珠，0.1ml/l的proclin 300；[0090]漂洗液1：1.5m的氯化钠，200ml/l的异丙醇；[0091]漂洗液2：1.5m的氯化钠，500ml/l的乙醇；[0092]洗脱液：1ml/l的depc。[0093]对比例3：[0094]病毒裂解液：浓度为5.2m的异硫氰酸胍，5.5m的碘化钠，0.50g/l的sls，0.50g/l的曲拉通-100，100mm的edta-2na，100ml/l的异丙醇；[0095]磁珠缓冲液：浓度为50mg/ml的磁珠，0.1ml/l的proclin 300；[0096]漂洗液1：1.5m的氯化钠，200ml/l的异丙醇；[0097]漂洗液2：1.5m的氯化钠，500ml/l的乙醇；[0098]洗脱液：1ml/l的depc。[0099]表5对比例2～3的实时荧光定量pcr结果[0100][0101]结果显示，实施例1核酸提取试剂的提取效果明显要优于对比例2～3的核酸提取试剂，相同样本ct值靠前约5个ct，说明优选浓度范围以外的配方提取结果较差。[0102]实施例7：[0103]以康彻思坦新型冠状病毒质控品为样本，s2级别浓度(约10000copies/ml)，分别稀释至500copies/ml和100copies/ml，使用实施例1的核酸提取试剂进行提取，分别向不同体积的病毒裂解液内加入样本，做3次平行。[0104]表6裂解液的使用量对核酸提取效果的影响[0105][0106]结果显示，当裂解液与样本量比例为1:1时，提取效果最好。[0107]实施例8：[0108]以康彻思坦新型冠状病毒质控品为样本，s2级别浓度(约10000copies/ml)，分别稀释至500copies/ml和100copies/ml，使用实施例1的核酸提取试剂进行提取，分别向400μl病毒裂解液中加入200μl，400μl，800μl样本(800μl样本分成两份分别加入400μl病毒裂解液中)，做3次平行。[0109]表7样本量对核酸提取效果的影响[0110][0111][0112]结果显示，样本量越多，同浓度下提取效果越好，且100copies/ml浓度的样本检出率明显提高。[0113]实施例9：[0114]以康彻思坦新型冠状病毒质控品为样本，s2级别浓度(约10000copies/ml)，分别稀释至500copies/ml和100copies/ml，使用实施例1的核酸提取试剂进行提取，分别向400μl病毒裂解液中加入200μl，800μl样本(800μl样本分成两份分别加入400μl病毒裂解液中)，做16次平行。[0115]表8样本量对核酸提取效果的影响[0116][0117][0118]500copies/ml浓度的样本荧光定量pcr扩增曲线如图1、图2所示，图1为orf1ab基因，图2为n基因。[0119]100copies/ml浓度的样本荧光定量pcr扩增曲线如图3、图4所示，图3为orf1ab基因，图4为n基因。[0120]结果显示，800μl样本量时，实施例1的核酸提取试剂可以100％提取100copies/ml的样本。[0121]实施例10：[0122]以康彻思坦新型冠状病毒质控品为样本，s2级别浓度(约10000copies/ml)，分别稀释至100copies/ml和50copies/ml，使用实施例1的核酸提取试剂进行提取，向400μl病毒裂解液中加入800μl样本(800μl样本分成两份分别加入400μl病毒裂解液中)，做16次平行。[0123]表9实施例1的核酸提取试剂对低浓度病毒样本的提取效果[0124][0125]结果显示，当加样量800μl样本量时，实施例1的核酸提取试剂可以100％提取100copies/ml的样本，50copies/ml的样本提取成功率达到50％左右。[0126]实施例11：[0127]以康彻思坦新型冠状病毒质控品为样本，s2级别浓度(约10000copies/ml)，分别稀释至100copies/ml和50copies/ml，使用实施例2、实施例5、对比例2的核酸提取试剂进行提取，分别向400μl病毒裂解液中加入200μl，800μl样本(800μl样本分成两份分别加入400μl病毒裂解液中)，做16次平行。[0128]表10实施例2、实施例5、对比例2的核酸提取试剂对低浓度对病毒样本的提取效果[0129][0130][0131]结果显示，800μl样本量时，实施例2和实施例5的核酸提取试剂虽然比实施例1的稍差，但提取100copies/ml的样本检出率≥90％，符合要求，而对比例2的核酸提取试剂提取结果不符合要求。说明在优选浓度范围内的核酸提取试剂可以做到提取100copies/ml的样本检出率≥90％，而浓度范围外的核酸提取试剂不能做到。[0132]实施例12：[0133]为了验证核酸提取试剂与市面上不同厂家新型冠状病毒pcr检测试剂盒的适配性，分别测试与达安、圣湘、卓诚惠生、硕世、迈克新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光pcr法)检测试剂盒匹配情况。[0134]1、达安新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)匹配实验方案：[0135]核酸提取试剂：取200μl样本按说明书进行提取，提取出的核酸取5μl进行扩增检测。[0136]实验样本：达安新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)阳性质控品、阴性质控品以及模拟样本(将新型冠状病毒装甲rna颗粒加入到拭子采样管中，终浓度为10^4copies/ml)[0137]判定标准：[0138][0139]配置达安qrt-pcr扩增体系[0140]试剂使用量反应液a17反应液b3total rna5total25μl[0141]程序：[0142][0143]结果：[0144][0145][0146]使用达安阳性质控品，核酸提取试剂提取结果fam和vic通道ct值均小于32，符合达安新冠检测试剂盒的质控标准，使用新冠模拟样本，核酸提取试剂提取结果fam和vic通道ct值均小于40，内标有ct值，符合达安新冠检测试剂盒的阳性判定标准，可以匹配达安新冠检测试剂盒。[0147]2、圣湘新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)匹配实验方案：[0148]核酸提取试剂：取200μl样本按说明书进行提取，提取出的核酸取20μl进行扩增检测。[0149]实验样本：圣湘新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒阳性质控品、阴性质控品以及模拟样本(将新型冠状病毒装甲rna颗粒加入到拭子采样管中，终浓度为10^4copies/ml)[0150]判定标准：[0151][0152]配制圣湘qrt-pcr扩增体系[0153][0154][0155]圣湘扩增程序：[0156][0157]结果：[0158][0159]使用圣湘阳性质控品，核酸提取试剂提取结果均符合圣湘新冠检测试剂盒的判定标准，可以匹配圣湘新冠检测试剂盒。[0160]3、卓诚惠生新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)匹配实验方案：[0161]核酸提取试剂：取200μl样本按说明书进行提取，提取出的核酸取5μl进行扩增检测。实验样本：卓诚惠生新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)阳性质控品、阴性质控品以及模拟样本(将新型冠状病毒装甲rna颗粒加入到拭子采样管中，终浓度为10^4copies/ml)[0162]判定标准：[0163][0164]配制卓诚惠生qrt-pcr扩增体系[0165]试剂使用量无核酸酶水2μl核酸扩增反应液10μll20×逆转录酶1μl10×反应液2μl模板5μl总体积20μl[0166]程序：[0167][0168]结果：[0169][0170][0171]核酸提取试剂的提取结果符合卓诚惠生结果判定的标准，说明可以匹配卓诚惠生新冠检测试剂盒。[0172]4、硕世新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)匹配实验方案：[0173]核酸提取试剂：取200μl样本按说明书进行提取，提取出的核酸取5μl进行扩增检测。实验样本：硕世新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)阳性质控品、阴性质控品以及模拟样本(将新型冠状病毒装甲rna颗粒加入到拭子采样管中，终浓度为10^4copies/ml)[0174]判定标准：[0175][0176]配制硕世qrt-pcr扩增体系[0177][0178][0179]程序：[0180][0181]结果[0182][0183]核酸提取试剂提取结果符合硕世新冠检测试剂盒结果判定的标准，说明样本释放剂可以匹配硕世新冠检测试剂盒。[0184]5、迈克新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)匹配实验方案：[0185]核酸提取试剂：取200μl样本按说明书进行提取，提取出的核酸取20μl进行扩增检测。实验样本：迈克新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)阳性质控品、阴性质控品以及模拟样本(将新型冠状病毒装甲rna颗粒加入到拭子采样管中，终浓度为10^4copies/ml)[0186]判定标准：[0187][0188]配制迈克qrt-pcr扩增体系[0189]试剂使用量qrt-pcr反应液17μlqrt-pcr酶混合液3μltemplate20μltotal40μl[0190]程序：[0191][0192]结果[0193][0194][0195]使用迈克新冠检测试剂盒，对于阴阳性质控品，核酸提取试剂提取结果fam、rox以及cy5通道ct值均小于32，内标hex通道ct值小于38，符合迈克新冠检测试剂盒的质控标准；对于模拟样本，核酸提取试剂提取结果符合迈克新冠检测试剂盒结果判定的标准，说明核酸提取试剂可以匹配迈克新冠检测试剂盒。









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