一种基于RGO-CMCS-Hemin/PdNPs电化学传感器检测GPC3的方法

测量装置的制造及其应用技术一种基于rgo-cmcs-hemin/pd nps电化学传感器检测gpc3的方法技术领域1.本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于适配体修饰石墨烯纳米复合材料检测gpc3的方法。背景技术：2.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3 , gpc3）是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素（hs）糖蛋白。目前常用的gpc3检测技术有酶联免疫分析法（el1sa），化学发光免疫分析法（clia），放射免疫法（ria），生物免疫传感器等。公开号为cn 107085109a的发明专利，涉及一种高正电荷绿色荧光蛋白（scgfp）在制备肝癌早期诊断gpc3试剂盒中的应用，其利用抗体与gpc3蛋白的专一性识别和scgfp与侧链的电荷结合作用，实现对gpc3的检测。公开号为 cn 109580951a的发明专利，涉及一种联合多抗体检测早期肝癌标志物的试剂盒及其使用方法，其利用带有颜色的包被抗体的荧光微球来捕获标志物，从而诊断早期肝癌。这2项专利所涉及的抗体本身还存在不足，如成本高、易降解、批间差异大、不易存储和运输等。因此，迫切需要开发一种新型的、方便、灵敏的gpc3检测方法。技术实现要素：3.本发明所要解决的技术问题是提供一种基于还原氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖-氯化血红素/纳米钯（rgo-cmcs-hemin/pd nps）的纳米复合材料，构建电化学适配体传感器，实现gpc3的检测，该方法最低检测限是9.898 ng/ml。4.本发明的检测原理为：利用rgo大的比表面积、羧甲基壳聚糖（cmcs）良好的生物相容性、pd nps的高电导率以及电活性物质hemin，合成了rgo-cmcs-hemin/pd nps纳米复合材料。rgo-cmcs-hemin/pd nps纳米复合材料中的pd nps与巯基化gpc3适配体（gpc3apt）形成配位键，使得gpc3apt牢固固定在电极表面；当gpc3存在时，单链的gpc3apt与gpc3特异性结合形成具有稳定的空间结构的适配体-蛋白复合物，阻碍着rgo-cmcs-hemin/pd nps中hemin（fe2+）/ hemin（fe3+）之间的氧化还原反应，导致电流信号降低，采用电化学工作站中的微分脉冲伏安法（dpv）技术记录着电流信号的变化，从而实现gpc3的浓度测定。一方面，rgo-cmcs-hemin/pd nps纳米复合材料可以放大电化学适配体传感器的检测信号，提高传感器的灵敏度；另一方面，该材料可以作为原位电活性探针，指示着电化学适配体传感器的电流信号，实现无标记的gpc3检测。5.本发明按照以下步骤进行：步骤1： rgo-cmcs-hemin/pd nps纳米复合材料的制备（1）还原性氧化石墨烯（rgo）的制备：往水中倒入氧化石墨烯（go），超声破碎后得到go悬浮液液，再加入抗坏血酸（aa）还原，得rgo悬浮液。6.（2）还原性氧化石墨烯-氯化血红素（rgo-hemin）的制备：用氨水溶解hemin后加入到rgo溶液，混合后超声破碎，得到rgo‑ꢀhemin分散液。7.（3）还原性氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖-氯化血红素（rgo-cmcs-hemin）的制备：将羧甲基壳聚糖（cmcs）用乙酸溶解后，将cmcs溶液加入到rgo‑ꢀhemin分散液，混匀超声破碎得到rgo-cmcs-hemin溶液。8.（4）还原氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖-氯化血红素/纳米钯（rgo-cmcs-hemin /pd）复合材料的制备：将六氯钯酸钠溶液和aa加入到rgo-cmcs-hemin溶液中，搅拌，离心去上清液，得到rgo-cmcs-hemin/pd nps溶液。9.步骤2：电极的修饰与传感界面的构建（1）au nps/spe的制备：将丝网印刷电极（spe）置于稀h2so4溶液中活化；将活化后的spe置入含有氯金酸（haucl4）溶液中，利用i-t进行恒电位沉积，得au nps/spe电极。10.（2）rgo-cmcs-hemin/pd nps/au nps/spe传感界面的制备：滴加rgo‑ꢀcmcs-hemin/pd nps悬浊液在au nps/spe上，孵育，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基琥珀酰亚胺（edc/nhs）的活化剂浸泡，自然晾干，得到rgo-cmcs-hemin/pd nps/au nps/spe。11.（3）gpc3apt/rgo-cmcs-hemin/pd nps/au nps/spe电化学适配体传感器的构建：将gpc3apt滴加在构建好的rgo-cmcs-hemin/pd nps/au nps/spe传感界面孵育，用水洗涤并晾干，再用牛血清蛋白（bsa）溶液封闭，得到gpc3apt/rgo-cmcs-hemin/pd nps/au nps /spe工作电极。12.步骤3：gpc3工作曲线的绘制（1）将步骤2的工作电极置于pbs缓冲溶液中，采用电化学工作站的dpv进行扫描，记录传感器的响应电流值。13.（2）检测不同浓度的gpc3，记录电流峰值，根据该浓度下的响应电流峰值和gpc3空白组响应电流峰值的差值与gpc3浓度的关系，绘制gpc3工作曲线。14.步骤4：实际血清样本中gpc3的检测（1）将待测样品与gpc3混合加入到步骤2的工作电极上，孵育一段时间后将电极浸入pbs缓冲溶液中，采用dpv检测技术进行扫描，同时设置空白组，记录电流响应峰值。15.（2）根据步骤3所得到的工作曲线，计算待测样品中gpc3的浓度。16.进一步，所述步骤1中rgo-cmcs-hemin/pd nps溶液的浓度为1.0 mg/ml；进一步，所述步骤2中稀h2so4溶液的浓度为0.5 mol/l，循环伏安法（cv）扫描电压为 0.4 v ~ 1.2 v；进一步，所述步骤2中haucl4溶液浓度为0.01%，恒电压为ꢀ‑ꢀ0.5 v，扫描时间为2 min；进一步，所述步骤2中纳米复合材料的孵育时间是2 h，孵育温度为25°c，用量为3.0 μl，活化剂edc/nhs浓度为10.0 mmol/l，浸泡时间为15 min，用量为4.0 μl；进一步，所述步骤2中gpc3apt孵育时间是1 h，用量为4.0 μl，bsa溶液浓度为0.5%，封闭时间30 min；进一步，所述步骤3中pbs缓冲溶液的浓度为0.2 mol/l；进一步，所述步骤3、步骤4中dpv扫描，电压范围0.2 v ~ 1.0 v；优选步骤3和步骤4中所述电极在孵育温度为25°c，孵育时间为30 min，pbs缓冲液ph值为6.5时，传感器响应电流与空白对照组响应电流差值最大。17.其中，步骤1制备了一种rgo-cmcs-hemin/pdnps复合材料，为步骤2中gpcapt的固定提供了良好生物传感界面，提高整个体系的导电性能；同时作为原位电活性探针，指示着步骤3和步骤4中电化学适配体传感器的电流信号。步骤2构建了特异性识别gpc3的传感界面，并利用复合材料中的电活性物质hemin提供电化学信号；其中步骤2（2）中的活化剂使得pd和-sh结合形成配位键为适配体提供结合位点，有利于适配体更好的固定于传感界面，从而提高适配体和蛋白的结合率。步骤2中生物传感界面的构建是步骤3和步骤4中gpc3的检测必不可少的关键步骤。步骤3的gpc3的工作曲线为步骤4的实际样本中gpc3浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能利用基于rgo-cmcs-hemin/pdnps复合材料的电化学适配体传感器实现对gpc3的检测。18.本发明与现有技术相比具有如下优点：本专利形成的rgo-cmcs-hemin/pdnps纳米复合材料具有独特的形貌和功能。由于该纳米复合材料中的hemin（fe2+）/hemin（fe3+）之间的氧化还原反应引起电流信号的变化，成功制备基于rgo-cmcs-hemin/pdnps复合材料的gpc3适配体传感器，为gpc3的检测提供了一个简单且成本较低的方法，最低检测限为9.898ng/ml。附图说明19.图1基于rgo-cmcs-hemin/pdnps复合材料的电化学适配体传感器检测gpc3的原理图；图2rgo-hemin（a）、rgo-cmcs-hemin（b）和rgo-cmcs-hemin/pdnps（c）复合材料的透射电镜图；图3rgo-cmcs-hemin/pdnps的x射线衍射光谱图；图4电极表面不同修饰过程的扫描电镜图；图5基于rgo-cmcs-hemin/pdnps的gpc3适配体传感器检测不同浓度的gpc3的dpv工作曲线。具体实施方式20.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。21.一种基于rgo-cmcs-hemin/pdnps复合材料的电化学适配体传感器检测gpc3的方法，检测原理见图1。将丝网印刷电极（spe）进行活化处理；将aunps电沉积在spe上以增强导电性；将制备的rgo-cmcs-hemin/pdnps纳米复合材料修饰在aunps/spe上；以rgo作为基底制作的纳米复合材料用来修饰电极能维持被负载的生物材料的活性，hemin是电活性物质可作为电子介质为传感器提供信号；同时，hemin的加入防止rgo团聚，有利于后续材料的结合；cmcs具有优良的生物相容性以及黏附力进一步增强了复合材料的结合，金属pd纳米粒子的加入进一步增强了纳米复合材料的导电性能。此外，纳米复合材料中的pd和-sh结合形成配位键为随后添加的gpc3apt提供了结合位点，进一步加大了gpc3apt的结合率；当gpc3存在时，单链的gpc3apt与gpc3特异性结合形成具有稳定的空间结构的适配体-蛋白复合物，阻碍着rgo-cmcs-hemin/pdnps中hemin（fe2+）/hemin（fe3+）之间的氧化还原反应，导致电流信号降低，采用电化学工作站中的微分脉冲伏安法（dpv）技术记录着电流信号的变化，从而实现gpc3的浓度测定。实施步骤如下：步骤1：rgo-cmcs-hemin/pd nps复合材料的制备（1）称30.0 mg单层氧化石墨烯go，倒入装有30.0 ml的超纯水的烧杯，超声破碎2 h，功率设为70%，转速是5 sed；破碎后得到浓度为1.0 mg/ml的go悬浮液。加入90.0 mg的aa对go溶液进行还原，让溶液均匀混合搅拌12 h，得到rgo悬浮液。22.（2）取10.0 ml 1.0 mg/ml的rgo悬浮液，加入10.0 ml hemin溶液，将两者混合均匀之后，用细胞破碎仪超声破碎30 min，功率设为50%，转速设为3 sed，得到rgo-hemin分散液，图2a是rgo-hemin的tem图，呈现出褶皱絮状，颜色黑暗。取10.0 ml 羧甲基壳聚糖cmcs溶液加入到rgo-hemin分散液中，混匀后用细胞破碎仪破碎30 min，图2b是rgo-cmcs-hemin的tem图，呈平整的膜状形态。23.（3）取2.0ml 20.0mmol/l的六氯钯酸钠溶液加入到10.0 ml rgo-cmcsꢀ‑hemin溶液中；一边搅拌一边加入10.0 mg抗坏血酸aa，放在磁力搅拌器上搅拌16 h后取出。把得到的分散液以转速8000 r/min离心15 min。离心完成后，用移液枪去掉上清液，洗涤后留下黑色沉淀，干燥得到rgo-cmcs-hemin/pd nps，如图2c即为rgo-cmcs-hemin/pd nps的tem，可以看出有很多深颜色的小颗粒物，形貌独特，整体更清晰，表明rgo-cmcs-hemin/pd nps复合材料制备成功。24.对rgo-cmcs-hemin/pd nps复合材料（固体）进行x射线衍射，如图3所示，2θ = 25.62°时的衍射峰对应c（002）晶面，金属钯属于铂族类金属，在2θ= 40.11°、68.11°时分别有衍射峰（111）、（220），说明pd nps已经成功附着在石墨烯复合材料上，再次证明rgo-cmcs-hemin/pd nps复合材料制备成功。25.步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建（1）将裸spe放入0.5 mol/l稀硫酸溶液中活化，在0.4 v ~ 1.2 v进行cv扫描，以 0.5 v/s扫描20 圈。活化完成后放入装有0.01% haucl4溶液的小烧杯并置于磁力搅拌器上，利用i-t扫描在‑ꢀ0.5 v恒电压下扫描2 min，超纯水洗涤三次，吹干得到au nps /spe。26.（2）滴加3.0 μl 的rgo-cmcs-hemin/pd nps悬浊液到au nps/spe上，将电极置于25ꢀ°c孵育2 h，滴加4.0 μl 10.0 mmol/l的edc/nhs在电极上并浸泡15 min，自然晾干，得到rgo-cmcs-hemin/pd nps/au nps/spe传感界面。27.（3）在构建好的rgo-cmcs-hemin/pdnps/au nps/spe传感界面滴加3.0 μl巯基化的gpcapt，25ꢀ°c恒温孵育1 h后，用纯水洗去未固定在传感界面的适配体，再用4.0 μl 0.5%的bsa封闭适配体的非特异性结合位点，孵育30 min，洗涤吹干得到gpcapt/rgo-cmcs-hemin/pdnps/aunps/spe传感界面。28.（4）采用扫描电镜（sem）对不同修饰过程的电极表面进行表征，如图4所示，图4a是仅做活化处理的裸spe，电极整体表面较灰暗；图4b是au nps/spe，整体上更亮，且存在大量的亮点分散在电极上，说明au nps成功沉积在spe上；图4c为rgo-cmcs-hemin/pd nps/au nps/spe传感界面，有中心较亮的团状物是由于cmcs的成膜性，中心凸起且较明亮，可以判断是钯纳米粒子，团状物之间颜色较暗，是由于黑色的石墨烯复合材料，表明rgo-cmcs-hemin/pd nps复合材料已经附着在传感界面上，图4d是gpcapt/rgo-cmcs-hemin/pdnps /au nps/spe呈现出褶皱的包裹形态，表面形态明显区别于图4c，且分散不均匀，这是由于适配体的加入使得电极表面薄厚不一。图4e为gpc3/gpc3apt/rgo‑ꢀcmcs-hemin/pd nps/au nps/spe有凸起的亮处，即是纳米钯粒子，左中部有小块状，可能是裸露的spe，gpc3与适配体特异性结合形成更明显的包裹状态，说明该传感器制备成功。29.步骤3：gpc3工作曲线的绘制（1）在gpc3apt/rgo-cmcs-hemin/pdnps/aunps/spe的传感界面上分别滴加3.0 μl不同浓度的gpc3 （10.0 ng/ml，25.0 ng/ml，50.0 ng/ml，65.0 ng/ml，85.0 ng/ml，100.0 ng/ml），在25ꢀ°c的孵育箱孵育30 min,并设置gpc3空白组。30.（2）将上述所得的工作电极放到0.2 mol/l的 pbs缓冲液溶液（ph = 6.5）中，采用chi660e电化学工作站的dpv扫描，记录电流峰值。不同gpc3浓度的dpv曲线图见图5。gpc3浓度在10.0 ~ 100.0 ng/ml内，该浓度下的响应电流峰值与gpc3空白组响应电流峰值的差值（y）与gpc3浓度（x）之间的关系呈线性，其线性方程为y = 0.0551 x + 0.7297，相关系数r2 = 0.9814。根据公式clod = 3.0 sb/b（sb代表六次gpc空白组所得标准偏差，b表示标准曲线的斜率），计算出最低检测限度为9.898 ng/ml。31.步骤4：实际血清样本中gpc3的检测采用加标法检测含不同浓度gpc3的人血清样本。将afp浓度为3.53 ng/ml、34.97 ng/ml以及大于500.0 ng/ml的血清和三种不同浓度（25.0 ng/ml、65.0 ng/ml、85.0 ng/ml）的gpc3溶液以1:1的比例震荡5 min混合均匀，滴加3.0 μl在gpc3apt/rgo-cmcs-hemin/pd nps/au nps /spe上，在25ꢀ°c恒温条件下孵育30 min，同时设置血清空白对照组，将电极置于0.2 mol/l的 pbs缓冲溶液（ph = 6.5）中，利用dpv扫描记录电流响应峰值，记录不同浓度混合液对应的电流峰值和空白对照组电流峰值的差值。根据步骤3所得到的工作曲线y = 0.0551 x + 0.7297，计算可得到对应的实际血清样本中gpc3的浓度，检测结果见表1。可以得出，该传感器回收率为93.73 ~ 118.83%，rsd在1.45 ~ 14.27%之间，该传感器具有良好应用前景。32.表1实际血清样本中gpc3的检测结果。33.（注：血清样本由中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院提供）。









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