一种二维氢硅烯-微生物复合材料及其制备方法和应用

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于生物纳米材料技术领域，具体涉及一种具有肠道微环境响应特性的二维氢硅烯-微生物复合材料及其制备方法和在益生菌肠道递送以及炎症性肠病治疗方面的相关应用。背景技术：2.人类的肠道菌群由众多细菌及其他微生物组成，具有着非常复杂的生理功能，并且与多种疾病的发生和发展有着密切的关系(science 2018,362,776-780)。如何通过安全有效的方式调节肠道菌群进而实现疾病的治疗是广受关注的问题之一。益生菌疗法是近些年来领域内的研究热点。与传统的治疗方法相比，益生菌疗法具有安全性高、不易产生耐药性等优势，并且可以辅助肠道菌群稳态的重建，对于多种疾病都可以起到治疗的效果。其中，对于肠炎的治疗也已经受到了广泛的关注(nat.rev.gastroenterol.hepatol.2019,16,605-616)。益生菌疗法不仅可以通过直接或间接的方式对肠上皮产生有益的影响，并且也可以在肠道进一步繁殖改善肠道菌群稳态，从而起到长期治疗的作用。然而，益生菌在实际使用中依旧面临着许多困难，其中最重要的一点就是益生菌容易在胃部的酸性条件和酶的冲击下失去活性，难以顺利抵达肠道进行定植，并发挥治疗作用。3.因此，亟需发展一种高效的微生物肠道递送策略，在胃部极端环境中对微生物起到有效的保护作用，促进益生菌的肠道定植，改善肠炎治疗效果。技术实现要素：4.针对现有技术的局限性，本发明旨在提供一种具有肠道微环境响应特性的二维氢硅烯-微生物复合材料及其制备方法和在益生菌肠道递送以及炎症性肠病治疗方面的相关应用，解决了微生物在胃部存活率低、肠道定植效率不足、治疗效果有限的问题。5.第一个方面，本发明提供一种二维氢硅烯-微生物复合材料，包括：微生物载体和负载在所述微生物载体上的二维氢键合硅烯纳米片，其中每个微生物载体负载的所述二维氢键合硅烯纳米片的总量为10–6-10–11μg。6.较佳地，所述微生物载体为真菌或细菌，优选为益生菌，包括酵母菌、里氏木霉菌、大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和变形杆菌中的一种或几种，优选为大肠杆菌属nissel 1917亚型。7.较佳地，所述二维氢键合硅烯纳米片为层状片层结构，横向尺寸优选为300～500nm，厚度优选为0.5-10nm。8.较佳地，还包括用于促进所述二维氢键合硅烯纳米片负载的高分子表面修饰剂。9.较佳地，所述高分子表面修饰剂为带正电两亲性高分子，优选为维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺。10.较佳地，在所述维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺中，聚乙二醇的分子量为500-10000，优选为2000；聚乙烯亚胺的分子量为400-10000，优选为600。11.第二个方面，本发明还提供一种如上所述的二维氢硅烯-微生物复合材料的制备方法，包括如下步骤：12.步骤(1)，提供二维氢键合硅烯纳米片；13.步骤(2)，将二维氢键合硅烯纳米片与高分子修饰剂在溶剂中混合，然后用惰性气体吹干溶剂，将产物分散在水中，离心清洗；14.步骤(3)，将步骤(2)得到的产物与微生物载体在低温下共孵育，离心、洗涤后得到所述二维氢硅烯-微生物复合材料。15.较佳地，步骤(1)中，所述二维氢键合硅烯纳米材料的制备方法包括如下步骤：将casi2粉体浸入浓盐酸溶液中，在-30℃～-10℃下搅拌混合，离心、移除上清液，然后洗涤离心产物，得到所述的二维氢键合硅烯纳米材料。16.较佳地，所述casi2粉体的粒径为5～10μm，所述casi2的浓度为5-20mg/ml；在-30℃～-10℃下搅拌混合为磁力搅拌，所述磁力搅拌的磁子转速为500～1000转/分子，所述磁力搅拌的时间为3-10天，并在惰性气体保护下磁力搅拌混合，所述惰性气体优选为氩气；所述离心处理的转速为13000rpm～20000rpm，时间为15～20分钟；所述洗涤所采用的溶液为无水乙醇或者去离子水，所述洗涤的次数为3～4次；还包括将洗涤离心产物后的材料在无水乙醇中进行超声破碎的步骤，所述超声破碎的功率为500～800w，所述超声破碎的时间为8-15h。17.较佳地，步骤(2)中，所述溶剂选自水、乙醇、丙酮和氯仿中的一种或几种，优选为无水乙醇，所述惰性气体为氮气；所述高分子修饰剂为维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺，所述维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺与所述二维氢键合硅烯纳米片的质量比优选为(1-20)：1。18.较佳地，步骤(3)中，所述微生物载体的浓度为106-1012cfu/ml，经过高分子修饰剂修饰的二维氢键合硅烯纳米片的浓度为5-200μg/ml，共孵育的温度为0-10℃，优选为4℃。19.第三个方面，本发明还提供一种如上所述的二维氢硅烯-微生物复合材料作为肠道递送载体和自由基清除剂用于制备治疗炎症性肠病药物中的应用。20.根据本发明，本发明涉及一种二维氢硅烯-微生物复合材料，将二维氢键合硅烯纳米片负载在益生菌微生物载体上，经过二维氢键合硅烯纳米片包裹的益生菌微生物载体可以保护益生菌微生物免受胃酸及酶的供给，提高益生菌微生物在胃部的存活时间和存活率。经过二维氢键合硅烯纳米片包裹的益生菌微生物具有良好的微环境响应特性，二维氢硅烯-微生物复合材料在抵达肠道后能够迅速地降解并且释放内部包裹的益生菌微生物，不影响微生物的代谢和增殖，大大提高了微生物的肠道定植效率。在本发明中，二维氢硅烯-微生物复合材料中还包括了用于促进二维氢键合硅烯纳米片负载的高分子表面修饰剂，进一步提高二维氢键合硅烯纳米片负载在益生菌微生物载体上的负载率，同时优选维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺作为高分子表面修饰剂，确保修饰过程不会导致微生物活性的下降。21.本发明的有益效果：22.本发明提供的一种二维氢硅烯-微生物复合材料及其制备方法，制备条件温和、操作简便，修饰过程不会导致微生物活性的下降；本发明提供的二维氢硅烯-微生物复合材料在胃部酸性条件下稳定性极好，能够长时间有效地包裹于微生物表面，保护微生物免受胃酸及酶的攻击，极大地提高了微生物在胃部的存活时间和存活率；本发明提供的二维氢硅烯-微生物复合材料具有良好的微环境响应特性，在抵达肠道后能够迅速地降解并且释放内部包裹的微生物，不影响微生物的代谢和增殖，大大提高了微生物的肠道定植效率。附图说明23.图1示出了根据本发明的一个实施方式的制备二维氢硅烯-微生物复合材料的流程图。24.图2示出了根据本发明实施例1制备的二维氢硅烯纳米片(sih)和经维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺(sih@tpgs-pei)修饰后的氢硅烯纳米片在透射电子显微镜下的形貌。25.图3示出了根据本发明实施例1制备的二维氢硅烯-微生物复合材料的扫描电镜图。26.图4示出了根据本发明实施例2中经维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺修饰后的氢硅烯纳米片在人工胃液中的紫外-可见吸收光谱随时间的变化图。27.图5示出了根据本发明实施例2中经维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺修饰后的氢硅烯纳米片在人工肠液中的紫外-可见吸收光谱随时间的变化图。28.图6示出了根据本发明实施例3中的二维氢硅烯-微生物复合材料在人工胃液中的细菌存活情况。29.图7示出了根据本发明实施例4中的二维氢硅烯-微生物复合材料在人工胃液中的存活时间评价图。具体实施方式30.以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。31.根据本发明的第一个方面，提供了一种二维氢硅烯-微生物复合材料，包括：微生物载体和负载在所述微生物载体上的二维氢键合硅烯纳米片，可选地还包括用于促进所述二维氢键合硅烯纳米片负载的高分子表面修饰剂。32.根据本发明，所述微生物载体为真菌或细菌，在本发明实施例中为益生菌，包括酵母菌、里氏木霉菌、大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和变形杆菌中的一种或几种，在本发明实施例中为大肠杆菌属nissel 1917亚型。33.益生菌是对人体或动物体内有益的真菌或细菌，益生菌通过定植在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。34.然而，益生菌在实际使用中依旧面临着许多困难，其中最重要的一点就是益生菌容易在胃部的酸性条件和酶的冲击下失去活性，难以顺利抵达肠道进行定植，并发挥治疗作用。因此，本发明在原有益生菌微生物载体的基础上，还在该益生菌微生物载体上负载二维氢键合硅烯纳米片。经过二维氢键合硅烯纳米片包裹的益生菌微生物载体可以保护益生菌微生物免受胃酸及酶的供给，提高益生菌微生物在胃部的存活时间和存活率。经过二维氢键合硅烯纳米片包裹的益生菌微生物具有良好的微环境响应特性，二维氢硅烯-微生物复合材料在抵达肠道后能够迅速地降解并且释放内部包裹的益生菌微生物，不影响微生物的代谢和增殖，大大提高了微生物的肠道定植效率。35.根据本发明，所述二维氢键合硅烯纳米片为层状片层结构，横向尺寸优选为300～500nm，厚度优选为0.5-10nm。36.为促进二维氢键合硅烯纳米片的负载，本发明还可选地包括高分子表面修饰剂，用于修饰二维氢键合硅烯纳米片的表面。所述高分子表面修饰剂为带正电两亲性高分子，在本发明实施例中采用维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺。37.根据本发明的二维氢硅烯-微生物复合材料还包括了用于修饰二维氢键合硅烯纳米片表面、以促进二维氢键合硅烯纳米片负载在益生菌微生物载体上的高分子表面修饰剂，进一步提高二维氢键合硅烯纳米片负载在益生菌微生物载体上的负载率，同时优选维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺作为高分子表面修饰剂，确保修饰过程不会导致微生物活性的下降。38.在一个优选实施方式中，在所述维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺中，聚乙二醇的分子量为500-10000，例如2000；聚乙烯亚胺的分子量为400-10000，例如600。39.本发明还提供一种如上所述的二维氢硅烯-微生物复合材料的制备方法，所述制备方法主要分为三部分，包括氢硅烯纳米片的制备、氢硅烯纳米片的修饰、以及修饰后的氢硅烯纳米片与微生物的组装。具体制备方法包括如下步骤：40.步骤1，二维氢硅烯纳米片的制备：将casi2粉体浸入浓盐酸溶液中，在-30℃～-10℃下、在惰性气体保护下磁力搅拌混合，离心、移除上清液，然后洗涤离心产物，得到所述的二维氢键合硅烯纳米材料。41.在该步骤1中，所述casi2粉体的粒径为5～10μm，浓度为5-20mg/ml，例如10mg/ml；所述磁力搅拌的磁子转速为500～1000转/分子，时间为3-10天，例如7天；所述惰性气体优选为氩气；所述离心处理的转速为13000rpm～20000rpm，时间为15～20分钟；所述洗涤所采用的溶液为无水乙醇或者去离子水，所述洗涤的次数为3～4次。42.在所述二维氢硅烯纳米片的制备过程中，还包括将洗涤离心产物后的材料在无水乙醇中进行超声破碎的步骤，超声破碎的功率为500～800w，超声破碎的时间为8-15h。43.步骤2，二维氢硅烯纳米片的修饰：将二维氢键合硅烯纳米片与高分子修饰剂在溶剂中混合，然后用惰性气体吹干溶剂，将产物分散在水中，离心清洗。44.在该步骤2中，所述溶剂选自水、乙醇、丙酮和氯仿中的一种或几种，优选为无水乙醇，所述惰性气体为氮气；在本发明实施例中，所述高分子修饰剂为维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺，所述维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺与所述二维氢键合硅烯纳米片的质量比优选为(1-20)：1，例如10：1。45.步骤3，修饰后的二维氢硅烯纳米片与益生菌微生物载体的组装：将步骤2得到的产物与益生菌微生物载体在例如4℃的低温下共孵育，离心、洗涤后得到所述二维氢硅烯-微生物复合材料。46.在该步骤3中，所述微生物载体的浓度为106-1012cfu/ml，例如108cfu/ml；经过高分子修饰剂修饰的二维氢键合硅烯纳米片的浓度为5-200μg/ml，例如30μg/ml。47.本发明还提供一种如上所述的二维氢硅烯-微生物复合材料作为肠道递送载体和自由基清除剂用于制备治疗炎症性肠病药物中的应用。根据本发明，本发明提供的二维氢硅烯-微生物复合材料在胃部酸性条件下稳定性极好，能够长时间有效地包裹于微生物表面，保护微生物免受胃酸及酶的攻击，极大地提高了微生物在胃部的存活时间和存活率；本发明提供的二维氢硅烯-微生物复合材料具有良好的微环境响应特性，在抵达肠道后能够迅速地降解并且释放内部包裹的微生物，不影响微生物的代谢和增殖，大大提高了微生物的肠道定植效率。48.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并不一定要限定与下文示例的具体数值。49.实施例1：50.二维氢硅烯-微生物复合材料的制备：制备步骤主要分为三部分，包括氢硅烯纳米片的制备，氢硅烯纳米片的修饰，以及修饰后的氢硅烯纳米片与益生菌微生物的组装。具体制备流程如图1所示，以下对三个步骤分别进行阐述：51.氢硅烯纳米片的制备：将1g硅化钙加入100ml预冷的浓盐酸，在-20℃、氩气保护的条件下剧烈搅拌7天。反应结束后12000rpm离心10min，沉淀经丙酮和无水乙醇依次洗涤后重悬于无水乙醇中。再经过冰浴探头超声8h后，得到氢硅烯纳米片，透射电镜结果如图2所示。52.氢硅烯纳米片的修饰：将1mg氢硅烯纳米片与10mg维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺共同分散于无水乙醇中，经过氮气吹干后用超纯水重悬，离心洗涤2次后得到维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺修饰的氢硅烯纳米片，透射电镜结果如图2所示。53.修饰后的氢硅烯纳米片与益生菌微生物的组装：将修饰后的氢硅烯纳米片重悬于超纯水中，并稀释为不同浓度的氢硅烯悬液。将益生菌微生物在转速为7000rpm下离心5min，洗涤两次后分散于超纯水中。将氢硅烯悬液与益生菌微生物悬液混合，在4℃条件下共孵育20-30min，离心洗涤3次后得到二维氢硅烯-微生物复合材料。扫描电镜结果见图3。54.实施例2：55.将经维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺修饰的氢硅烯纳米片分散于人工胃液和人工肠液中，通过对其紫外-可见吸收光谱的变化进行监测来判断维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺修饰的氢硅烯纳米片在不同生理环境下的稳定性和响应性。由图4、5可以看出，该材料在人工胃液(图4)中有着良好的稳定性，紫外-可见吸收光谱几乎没有变化。而在人工肠液(图5)中，紫外-可见吸收值迅速降低，表明该材料可以在人工肠液中迅速降解。56.实施例3：57.二维氢硅烯-微生物复合材料在胃液中的细菌存活率评价。将1ml处于对数生长期的益生菌离心后重悬于100μl超纯水中，并与不同浓度的经维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺修饰的氢硅烯纳米片在无菌水中混合，最终氢硅烯的含量为0、3、15和30μg。共孵育半小时后离心清洗得到二维氢硅烯-益生菌复合材料。将得到的复合材料分散于人工胃液中，孵育15min后通过平板涂布法对其存活率进行统计。如图6，未经过修饰的益生菌在与胃液作用后无细菌存活，而氢硅烯-益生菌复合材料展现出了很好的益生菌保护效果，大大地提升了益生菌在胃液中的存活率。58.实施例4：59.二维氢硅烯-微生物复合材料在胃液中的存活时间评价。将1ml处于对数生长期的益生菌离心后重悬于100μl超纯水中，并与经维生素e-聚乙二醇-聚乙烯亚胺修饰的氢硅烯纳米片在无菌水中混合，最终氢硅烯的含量为30μg。共孵育半小时后离心清洗得到二维氢硅烯-益生菌复合材料。将得到的复合材料分散于1ml人工胃液中，在孵育15min、30min和60min后通过平板涂布法对其存活率进行统计，统计结果如图7所示，该复合材料可以在长达1小时的时间内大大提高益生菌的存活效率。60.产业应用性：61.本发明提供的一种二维氢硅烯-微生物复合材料及其制备方法，制备条件温和、操作简便，修饰过程不会导致微生物活性的下降；本发明提供的二维氢硅烯-微生物复合材料在胃部酸性条件下稳定性极好，能够长时间有效地包裹于微生物表面，保护微生物免受胃酸及酶的攻击，极大地提高了微生物在胃部的存活时间和存活率；本发明提供的二维氢硅烯-微生物复合材料具有良好的微环境响应特性，在抵达肠道后能够迅速地降解并且释放内部包裹的微生物，不影响微生物的代谢和增殖，大大提高了微生物的肠道定植效率。









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