ROR1特异性嵌合抗原受体及其治疗应用的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术ror1特异性嵌合抗原受体及其治疗应用技术领域1.本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，具体涉及一种ror1特异性嵌合抗原受体及其治疗应用。背景技术：2.近年一种称为过继细胞转移(adoptive cell transfer,act)的新兴免疫疗法快速发展，该疗法利用免疫细胞来消灭癌症，其中一些方法涉及获取天然免疫细胞并直接扩大其数量，而其他方法涉及对免疫细胞进行基因工程以增强其抗癌能力。3.就癌症而言，被称为杀伤性t细胞的免疫细胞由于能够与癌细胞表面的标记物(即抗原)结合，对癌症治疗特别有效，细胞免疫疗法即以不同方式利用这种天然能力，包括肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,til)疗法、工程t细胞受体(engineered t cell receptor,tcr)疗法、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)t细胞疗法、自然杀手(nk)细胞疗法等。尽管有多种类型的act疗法，迄今为止在临床开发中进展最大的是car-t细胞疗法。4.越来越多的car-t细胞疗法被开发以应用于临床研究，尽管这些疗法之间存在很多差异，但它们都有相似的组成部分。细胞表面的car由合成抗体的片段或结构域组成，该结构域会影响受体识别或结合肿瘤细胞抗原的能力；受体依赖来自细胞内部的刺激信号完成其工作，因此，每个car-t细胞都有细胞内信号结构域和“共刺激”结构域，从表面受体向细胞发出信号，使用不同结构域会影响细胞的整体功能。随着car-t细胞胞内工程改造技术的进步，t细胞在患者体内的扩增能力和存活时间逐步提高。5.ror1是孤儿受体家族成员之一，在物种间高度保守，参与控制细胞生长和上皮间质转化等多种信号通路(shabani m,naseri j,shokri f.receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1:a novel target for cancer immunotherapy.expert opin ther targets.2015jul；19(7):941-55)。wnt5a是ror1的配体之一(fukuda t,chen l,endo t,tang l,lu d,castro je,et al.,antisera induced by infusions of autologous ad-cd154-leukemia b cells identify ror1 as an oncofetal antigen and receptor for wnt5a.proc natl acad sci u s a.2008；105(8):3047–52)。6.ror1被认为是多种恶性肿瘤的生存影响因子，包括慢性淋巴细胞白血病(cll)、乳腺癌、肺腺癌、卵巢癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤(hojjat-farsangi m,moshfegh a,daneshmanesh ah,khan as,mikaelsson e,osterborg a,et al.,the receptor tyrosine kinase ror1—an oncofetal antigen for targeted cancer therapy.semin cancer biol.2014；29:21–31)。7.ror1的氨基末端是一个细胞外免疫球蛋白样结构域、一个富含半胱氨酸的结构域，也称为卷曲(frizzled)结构域，以及一个高度折叠并且富含半胱氨酸的克林格(kringle)跨膜结构域。ror1的细胞内部分包含一个激酶活性存在争议的酪氨酸激酶结构域、一个富含丝氨酸/苏氨酸的结构域、一个富含脯氨酸的结构域，以及另一个位于羧基末端的富含丝氨酸/苏氨酸的结构域，其可能参与蛋白质相互作用(shabani m.,naseri j,shokri f.receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1:a novel target for cancer immunotherapy.expert opin ther targets.2015jul；19(7):941-55)。wnt5a是ror1已知唯一的配体，通过卷曲结构域与ror1结合。克林格结构域负责与cll细胞中另一个ror家族蛋白ror2异二聚化，这导致rho家族的小g蛋白(small gtpase)激活，癌细胞随之增殖和迁移。8.ror1在中枢神经系统、心脏、骨骼肌和肺脏系统的胚胎发育过程中高度表达，除了脂肪组织、少量的早期b细胞亚群和上消化道细胞外，成人的正常组织不表达ror1(balakrishnan et al.,analysis of ror1 protein expression in human cancer and normal tissues.clin cancer res.2016.epub 2016/11/18)。9.ror1通过pi3k/akt/mtor通路和egfr介导的信号传导在肿瘤的发生中发挥重要作用。10.靶向ror1治疗癌症的一个重要方法就是过继转移靶向ror1的car-t细胞，car-t细胞是表达car的工程化t细胞，该car由结合结构域或对肿瘤抗原(如ror1)具有特异性的单链抗体组成，制备的ror1特异性car在体外和体内均显示出对表达ror1的肿瘤细胞的有效识别，这些ror1特异性car-t细胞的过继转移已被证明可以安全有效地清除灵长类动物的ror1+b细胞，但目前针对ror1的car-t效果仍然不尽如人意。11.双阴性t细胞(dnt细胞)是表达cd3-tcr复合物但不表达cd4、cd8或nkt细胞标志物αgalcer-cd1d和jα24-vα14的成熟外周t淋巴细胞，在人类外周血单核细胞(pbmc)中占比1-5％(zhang et al.,2000)。这种治疗方法可以将系统或局部接种致死剂量a20淋巴瘤细胞(young et al.,2001；young et al.,2003)的死亡率降低75％以上。此外，从化疗完全缓解期间aml患者提取扩增dnt细胞的方案已被公开，并且已经证实aml患者来源的dnt细胞对自体原代aml细胞具有显着的抑制活性(young et al.,2003)。与cd4或cd8 t细胞不同，输入体外活化的同种异体dnt细胞不会引起移植物抗宿主病(gvhd)，除此之外，注射同种异体dnt细胞还可以防止cd8 t受者产生gvhd。12.dnt细胞具有非常好的抗肿瘤特性，还可以预防gvhd，因此dnt细胞非常适合用来制备同种异体car-t细胞。13.因此，本领域迫切需要开发一种有效靶向ror1的免疫细胞，该细胞能够有效且特异性地靶向并杀死ror1阳性肿瘤细胞，同时对人体的不良反应达到最低。技术实现要素：14.本发明的目的在于提供一种有效靶向ror1的免疫细胞，有效地、特异性地清除ror1阳性肿瘤细胞，同时将对人体产生的不良反应最小化。15.第一部分，本发明提供了一种嵌合抗原受体(car)，其包括：16.(1)胞外结构域，至少包含一个特异性结合ror1的抗原结合结构域(或scfv)；17.(2)铰链区；18.(3)跨膜区；19.(4)胞内信号域；20.其中，抗原结合结构域包含具有重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2和hcdr3的重链可变区，以及具有轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3的轻链可变区；21.其中，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的多肽序列选自：22.a.seq id nos：2、3、4、6、7、8；或23.b.seq id nos：16、17、18、20、21、22；或24.c.seq id nos：30、31、32、34、35、36；25.或者，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的多肽序列选自：26.a.seq id nos：9、10、11、12、13的第1-2位氨基酸(da)、14；或27.b.seq id nos：23、24、25、26、27的第1-2位氨基酸(da)、28；或28.c.seq id nos：37、38、39、40、41的第1-2位氨基酸(da)、42；29.在优选的实施方案中，抗原结合结构域或scfv特异性结合受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)，优选人ror1；以及30.任一上述多肽序列还包括由1-5(或1、2、3)个氨基酸任选地添加、删除、修饰和/或取代形成，并且能够保留ror1结合亲和力的衍生序列。31.在特定的实施方案中，ror1抗原结合结构域是单链可变片段(scfv)。32.在优选的实施方案中，抗原结合结构域包含：33.a.具有seq id no：1的多肽序列的重链可变区和具有seq id no：5的多肽序列的轻链可变区；或34.b.具有seq id no：15的多肽序列的重链可变区和具有seq id no：35.19的多肽序列的轻链可变区；或36.c.具有seq id no:29的多肽序列的重链可变区和具有seq id no:33的多肽序列的轻链可变区。37.在优选的实施方案中，scfv进一步包含位于重链可变区和轻链可变区之间的连接肽。38.在优选的实施方案中，scfv由式a或式b表示：[0039]vh-vlꢀꢀꢀꢀꢀ(a)；[0040]vl-vhꢀꢀꢀꢀꢀ(b)；[0041]其中，“vh”为抗体重链可变区，“vl”为抗体轻链可变区，“‑”是连接肽或肽键。[0042]在优选的实施方案中，vh和vl之间的连接肽是(ggggs)n，其中n为1、2、3或4。[0043]在优选的实施方案中，vh和vl之间的连接肽是(ggggs)3(seq id no：47)。[0044]在优选的实施方式中，car的结构如式i所示：[0045]l-scfv-h-tm-c-cd3δ(i)[0046]其中，[0047]“l”代表无或信号肽序列；[0048]“scfv”代表如上文所定义的ror1抗原结合结构域；[0049]“h”代表无或铰链；[0050]“tm”代表跨膜结构域；[0051]“c”代表共刺激信号结构域；[0052]“cd3δ”代表源自cd3δ的细胞内信号序列；[0053]每个“‑”代表独立的连接肽或肽键。[0054]在优选的实施方案中，“l”是选自cd8、cd28、gm-csf、cd4、cd137等蛋白质及其组合的信号肽。[0055]在优选的实施方案中，“l”是源自cd8的信号肽。[0056]在优选的实施方案中，“l”具有如seq id no:43所示的氨基酸序列。[0057]在优选的实施方案中，“h”是选自cd8、cd28、cd137等蛋白质及其组合的铰链区。[0058]在优选的实施方案中，“h”是源自cd8的铰链区。[0059]在优选的实施方案中，“h”具有如seq id no:44中第1-44位所示的氨基酸序列。[0060]在优选的实施方案中，“tm”是选自cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154等蛋白质及其组合的跨膜区。[0061]在优选的实施方案中，“tm”是源自cd8或cd28的跨膜区。[0062]在优选的实施方案中，源自cd8的跨膜区具有如seq id no:44中第45-69位所示的氨基酸序列。[0063]在优选的实施方案中，“c”是选自ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2及其组合的共刺激信号结构域。[0064]在优选的实施方案中，“c”是源自cd28和/或4-1bb的共刺激信号结构域。[0065]在优选的实施方案中，4-1bb衍生的共刺激信号分子具有如seq id no:45所示的氨基酸序列。[0066]在优选的实施方案中，cd3δ具有如seq id no:46所示的氨基酸序列。[0067]在一优选的实施方案中，ror1特异性car与seq id no:48、49或50的氨基酸序列具有至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少99％的序列同一性。[0068]在优选的实施方案中，vh链和vl链分别与seq id no：1、15、29(vh)和seq id no：5、19、33(vl)的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少99％的序列同一性。[0069]第二部分，本发明提供了一种双特异性car，其靶向第一靶标和第二靶标，其中第一靶标为ror1。[0070]在优选的实施方案中，第二靶标选自cd19、cd20或其组合。[0071]在优选的实施方案中，scfv是人的、嵌合的或全人源化的。[0072]第三部分，本发明提供了编码本发明第一部分car或第二部分双特异性car的核酸分子。[0073]在优选的实施方案中，核酸分子是dna或rna。[0074]第四部分，本发明提供一种含有本发明第三部分核酸分子的载体。[0075]在优选的实施方案中，载体选自质粒、病毒载体(如慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体)及其组合。[0076]在优选的实施方案中，载体是慢病毒载体。[0077]第五部分，本发明提供一种工程化宿主细胞，其包含本发明第四部分的载体、或将本发明第三部分的核酸分子整合到染色体或基因组中、或表达本发明第一部分的car或表达第二部分的双特异性car。[0078]第六部分，本发明提供一种工程化免疫细胞，其包含本发明第四部分的载体、或将本发明第三部分的核酸分子整合到染色体或基因组中、或表达本发明第一部分的car或表达第二部分的双特异性car。[0079]在优选的实施方案中，修饰的免疫细胞是自体或同种异体细胞。[0080]在优选的实施方案中，工程化免疫细胞选自：[0081](1)嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)；或[0082](2)嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)。[0083]在优选的实施方案中，修饰的免疫细胞是细胞毒性t淋巴细胞。[0084]在优选的实施方案中，修饰的免疫细胞是双阴性t细胞(dnt细胞)。[0085]在优选的实施方案中，修饰的免疫细胞在细胞表面表达ror1特异性car。[0086]第七部分，本发明提供一种药物组合物或制剂，其含有本发明第一或第二部分的car、第四部分的载体、或第六部分的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。[0087]在优选的实施方案中，药物组合物是液体制剂。[0088]在优选的实施方案中，药物组合物是注射剂。[0089]在优选的实施方案中，药物组合物中工程化免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，优选为1×104-1×107个细胞/ml。[0090]第八部分，提供了本发明第一或第二部分的car、第四部分的载体、或第六部分的工程化免疫细胞，其用于制备预防和/或治疗癌症的药物或制剂的用途。[0091]第九部分，本发明提供一种制备工程化免疫细胞的方法，其中工程化免疫细胞表达本发明第一部分或第二部分的car。该方法包括以下步骤：将本发明第三部分的核酸分子或第四部分的载体转导至免疫细胞中，从而获得工程化免疫细胞。[0092]在优选的实施方案中，免疫细胞是t细胞或nk细胞。[0093]在优选的实施方案中，免疫细胞是dnt细胞。[0094]第十部分，本发明提供一种用于制备本发明第六部分工程化免疫细胞的试剂盒，其包括带有本发明第三部分核酸分子或第四部分载体的容器。[0095]第十一部分，提供了本发明第四部分的载体或第六部分的工程化免疫细胞用于预防和/或治疗癌症或肿瘤的用途。[0096]第十二部分，本发明提供一种治疗疾病的方法，包括向有需要的受试者施用第四部分的载体、第六部分的工程化免疫细胞、或第七部分的制剂或组合物。[0097]在优选的实施方案中，治疗的疾病是癌症。[0098]在优选的实施方案中，受试者是人类。[0099]在优选的实施方案中，癌症是以ror1表达细胞为特征的癌变前或恶性肿瘤。[0100]在一优选的实施方案中，癌症包括非实体瘤。[0101]在一优选的实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤。[0102]在特别优选的实施方案中，血液恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(cll)、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、套细胞淋巴瘤(mcl)或急性淋巴细胞白血病(all)。[0103]在一优选的实施方案中，癌症包括实体瘤。[0104]在特别优选的实施方案中，实体瘤是乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌或肾癌。[0105]第十三部分，本发明提供一种工程化修饰的免疫细胞的方法，包括：[0106](1)提供免疫细胞；[0107](2)表达至少一个ror1特异性car。[0108]在另一实施例中，工程化方法包括：[0109](1)提供免疫细胞；[0110](2)将至少一种编码ror1特异性car的多核苷酸导入修饰的免疫细胞；[0111](3)在修饰的免疫细胞表面表达至少一种多核苷酸。[0112]在另一个实施例中，工程化方法包括：[0113](1)提供免疫细胞；[0114](2)将至少一种car表达载体引入修饰的免疫细胞中；[0115](3)修饰的免疫细胞表面表达至少一种多核苷酸。[0116]本发明的修饰的免疫细胞特别适用于疾病治疗，在一实施例中，修饰的免疫细胞用于生产并治疗癌症。附图说明[0117]图1a显示慢病毒载体；图1b显示了抗ror1嵌合抗原受体(car)的结构。[0118]图2显示了人外周血pbmc的表型测试结果。[0119]图3显示抗ror1-c3-car慢病毒感染t细胞和表型测试的结果。[0120]图4显示抗ror1-g3-car慢病毒感染t细胞的结果，nt是指非慢病毒感染的t细胞。[0121]图5显示了抗ror1-g3-car-t细胞体外增殖的结果。[0122]图6显示了增殖的抗ror1-g3-car-t细胞亚群和表型的结果。[0123]图7显示了肿瘤细胞系ror1表达的结果。[0124]图8显示与ror1阳性靶细胞共培养的抗ror1-c3-car-t细胞其细胞因子释放结果。[0125]图9显示与过表达ror1的sk-ov-3细胞和过表达ror1的u87mg细胞共培养的抗ror1-g3-car-t细胞的细胞因子释放结果。[0126]图10显示抗ror1-c3-car-t细胞对ror1阳性靶细胞裂解杀伤的结果。[0127]图11显示抗ror1-c3-car-t细胞对ror1阳性靶细胞的体外细胞杀伤结果。[0128]图12显示抗ror1-g3-car-t细胞对过表达ror1的sk-ov-3和u87mg细胞共培养的细胞杀伤结果。[0129]图13显示抗ror1-c3-car-t细胞在mda-mb-231异种移植小鼠肿瘤模型中的体内抗肿瘤活性结果。[0130]图14显示抗ror1-g3-car-t细胞在jeko1异种移植小鼠肿瘤模型中的体内抗肿瘤活性结果。[0131]图15显示抗ror1-g3-car-t细胞在jeko1异种移植小鼠中的体内抗肿瘤活性结果。[0132]图16显示抗ror1-g3-car-t细胞在sk-ov-3-ror1异种移植小鼠肿瘤模型中的体内抗肿瘤活性结果。[0133]图17显示抗ror1-g3-car-t细胞在u87mg-ror1异种移植小鼠肿瘤模型中的体内抗肿瘤活性结果。[0134]图18显示了抗ror1-g3-car-dnt研究策略。[0135]图19显示了人外周血dnt表型检测结果。[0136]图20显示抗ror1-g3-car慢病毒感染dnt细胞的结果。[0137]图21显示增殖后抗ror1-g3-car-dnt细胞的亚群和表型结果。[0138]图22显示抗ror1-g3-car-dnt细胞体外增殖的结果。[0139]图23显示抗ror1-g3-car-dnt细胞与过表达ror1的u87mg细胞共培养的细胞因子释放结果。[0140]图24显示通过facs方法检测抗ror1-g3-car-dnt细胞对过表达ror1的u87mg细胞共培养的细胞杀伤结果。具体实施方式[0141]发明人通过深入研究和广泛筛选意外获得了一组具有全新氨基酸序列的全人源ror1抗体，该ror1抗体与人ror1蛋白具有极高的亲和力，并且对人的免疫原性极低甚至无免疫原性，因此特别适合构建ror靶向嵌合抗原受体用于治疗肿瘤等ror1相关疾病，本发明是在此基础上完成的。[0142]具体来说，发明人利用不同ror1抗体的scfv构建了car-t细胞，并比较其效果。出乎意料的是，其中一些scfv具有更良好的效果，包括对ror1过表达细胞和ror1阳性肿瘤靶细胞的高杀伤能力。本发明的ror1特异性嵌合抗原受体(car)包含：信号肽、包含抗ror1抗体vh和vl的细胞外ror1抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、共刺激域和细胞内信号结构域(图1b)，这类ror1特异性car具有意想不到的优异抗肿瘤效果。[0143]定义：[0144]除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有被本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。在其他情况下，本文使用的某些术语会在说明书中阐明其含义。[0145]须注意，除非上下文另外明确指出，在本发明的说明书和权利要求书中所使用单数的“一个”、“一种”和“该”包括其复数含意。[0146]除非另有说明，任何数值如本文所述的浓度或浓度范围，在所有情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，数值通常包含所述值的±10％。例如，1mg/ml的浓度包括0.9mg/ml至1.1mg/ml。同理，浓度范围为1％至10％(w/v)便包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。本文的数值范围明确地包括所有可能的子范围、范围内的所有单个数值，以及该范围内的整数和分数。[0147]除非另有说明，在一系列要素中的术语“至少”应理解为包含该系列中的每个要素。本领域技术人员能够认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所述的发明具体实施方式或许多等同方案。本发明涵盖这样的等同内容。[0148]本文中所使用的术语“包括”、“包含”、“具有”或任何其他相似词将被理解为包括所陈述的整数或整数组合，但不排除任何其他整体或整体的组合，并且意为非排他性的或开放式的。例如，组合物、混合物、制成、方法、物品或设备，这些词不需要仅限于字词上的元素，而是可以在这些词语上包括未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确指出相反的意思，否则“或”是指包含的“或”而非排他的“或”。举例来说，条件a或b满足以下任一条件：a为真(或存在)且b为假(或不存在)、a为假(或不存在)且b为真(或存在)、a和b都为真(或存在)。[0149]本文中所使用多个列举的元素之间的结合术语“和/或”，应理解为涵盖单独元素和组合元素。例如，在两个元素由“和/或”连接的情况下，第一种适用选项是指有第一个元素而没有第二个元素；第二种适用选项是指有第二个元素但没有第一个元素的情况；第三种适用选项是指第一和第二元素皆有。这些任一选项或适用一个以上选项的状况应被认定在上述含义内，并且满足本文使用术语“和/或”的标准。[0150]在本说明书和权利要求书中使用的术语“由……组成”或其他相似词，表示包括任何所述元素的整体或整体的组合，但不能将额外的元素或整体的组合添加到指定的方法、结构或组合中。[0151]在本说明书和权利要求书中所使用“基本上由……组成”或其他相似词，表示包括任何列举的整体或整体的组合，并且可选择地包含任何不会实质改变特定方法、结构或组成的基本或新颖性质的整体或整体的组合。[0152]本文中的“受试者”是指任何动物，较佳选择为哺乳动物，最合适者为人类。如本文所示，术语“哺乳动物”泛指任何哺乳动物，例子包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠、猴子、人类等，但最佳的选择为人类。[0153]本文所使用的术语“右”、“左”、“下”和“上”表示参考附图中的方向。[0154]当提及该发明要件的尺寸或特性时，与本领域的技术人员普遍所理解的一致，本文所使用的术语“大约”、“大致”、“基本上”、“实质上”和相似术语，这些词语并非严格限定所描述的尺寸/特性范围或参数，但不排除其在功能上相同或相似的微小变动。至少在本领域公认的数学和工业原理(例如四舍五入、测量或其他系统误差、制造公差等)使用数字参数的此类引用包含变量，但并不会改变最低有效数字。[0155]在两个或多个核酸或多肽序列(例如抗ror1抗体和编码它们的多核苷酸、ror1多肽和编码它们的ror1多核苷酸)的上下文中，术语“相同的”或“同一性”百分比是指当使用序列比对算法或目视检查进行比较和对齐以获得最大一致时，两个或多个序列或子序列其相同或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的特定百分比。[0156]序列比对通常用一个序列充当参考序列与测试序列进行比较。使用序列比对算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时设定子序列坐标，并设定算法程序参数，然后，序列比对算法基于设定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。[0157]可用于进行比较的最佳序列比对方法包括smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源算法、needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源比对算法、pearson&lipman,proc.nat'l.acad.sci.usa85:2444(1988)的搜索相似性法，通过计算机实现这些算法(gap,bestfit,fasta,and tfasta in the wisconsin genetics software package,genetics computer group,575science dr.,madison,wi)，或通过目视检查实现(参见generally,current protocols in molecular biology,f.m.ausubel et al.,eds.,current protocols,a joint venture between greene publishing associates,inc.and john wiley&sons,inc.,(1995supplement)(ausubel))。[0158]适合用来确定序列同一性百分比和序列相似性的实施例是blast和blast 2.0算法，其在altschul et al.(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschul et al.(1997)nucleic acids res.25:3389-3402中分别有描述。执行blast分析的软件可由国家生物技术信息中心(ncbi)公开获得，该算法首先通过识别查询序列中长度为w的短片段(word)来识别高分值片段对(high scoring sequence pairs,hsps)，当与数据库序列中相同长度的片段对齐时，这些片段匹配或满足某个正阈值分数t，t被称为邻域片段(neibourhood words)得分阈值(altschul et al.，同上)，这些初始邻域片段命中(hits)作为启动搜索寻找包含它们在内更长的hsp的种子(seeds)，然后沿着每个序列向两个方向扩展片段命中，直到累积对齐分值增加。[0159]对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励分数；》0)和n(错配残基的惩罚分数；《0)计算累积分值。对于氨基酸序列，使用打分矩阵来计算累积分值。在下列情况下，片段命中在各个方向的扩展将停止：累积对齐分值从其最大实现值下降了数量x；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积分值变为零或更低；或到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定比对的灵敏度和速度，blastn程序(用于核苷酸序列)默认使用片段长度(w)为11，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4，以及两条链的对照。对于氨基酸序列，blastp程序默认使用片段长度(w)为3、期望值(e)为10，以及bloseim62打分矩阵(参见henikoff&henikoff,proc.natl.acad.sci.etsa 89:10915(1989))。[0160]除了计算序列同一性百分比外，blast算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见如karlin&altschul,proc.natt.acad.sci.etsa 90:5873-5787(1993))，blast算法提供的一相似性计算是最小总概率(p(n))，它指示了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率，例如假设测试核酸与参考序列的比较中，最小总概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。[0161]如下所述，两个核酸序列或多肽基本相同的进一步指示是由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽在免疫学上交叉反应，由此，该多肽通常与第二多肽基本相同，例如两个肽仅在保守取代上不同。两个核酸序列基本相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。[0162]本文中所用的术语“多核苷酸”定义为核苷酸链，并且核酸是核苷酸的聚合物，因此本文使用的核酸和多核苷酸是可互换使用的。本领域技术人员公知核酸是多核苷酸，其可以水解成单体“核苷酸”，单体核苷酸可以水解成核苷。本文所称的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何方式获得的所有核酸序列，包括但不限于重组方式，即从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列、使用普通克隆技术和pcrtm等，以及通过合成手段。[0163]本文中所用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的氨基酸最大数目没有限制。本文所使用的上述术语包含长链和短链，短链在本领域通常也称为肽、寡肽和寡聚体；而对于较长的链，在本领域通常被称为蛋白质，其包含许多类型，例如，“多肽”包括生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。[0164]如本文所用的术语“抗原结合片段”是指包含与目标抗原结合的免疫球蛋白重链和/或轻链至少一个cdr的多肽片段，在本文特别优选的实施方案中，上述抗原是受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)。本文所述抗体的抗原结合片段可包含来自结合ror1的抗体vh和/或vl序列上的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个cdr。本文所述的ror1特异性抗体的抗原结合片段能够结合ror1，在其他实施方案中，抗原结合片段的结合阻止或抑制ror1配体与ror1受体结合，中断原本由配体与受体结合而导致的生物反应。在某些实施方案中，抗原结合片段特异性结合和/或抑制或调节ror1的生物活性。[0165]术语“抗原”是指能够被选择性结合剂(例如抗体)结合的分子或蛋白分子的一部分，并且还能够施用于动物以产生能够结合该抗原表位的抗体。一个抗原可能具有一个或多个表位。[0166]术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或t细胞受体特异性结合的任何决定簇，优选为多肽决定簇。表位是被抗体结合的抗原区域，在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的目标抗原时，该抗体被称为特异性结合抗原。根据某些实施方案，当抗体-抗原结合的平衡解离常数小于或等于10-6m，或小于或等于10-7m，或小于或等于10-8m时，可以说抗体特异性的结合抗原。在一些实施例中，平衡解离常数可以小于或等于10-9m，或小于或等于10-10m。[0167]术语“载体”指用于将编码信息转移到宿主细胞的任何分子(例如核酸、质粒或病毒)。术语“表达载体”是指适合转化宿主细胞，并带有直接和/或控制插入的异源核酸序列表达的核酸序列的载体，如果存在内含子，表达包括但不限于转录、转译和rna剪接等过程。[0168]术语“自体”是指将来自同一个体的任意材料重新导入该个体。[0169]术语“同种异体”是指源自同一物种不同动物的移植物。[0170]术语“异种移植”是指源自不同物种不同动物的移植物。[0171]本文所用的术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独一无二的，它能够感染非分裂细胞；其可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的dna中，是基因传递载体最有效的方法之一，hiv、siv和fiv都是慢病毒的实例。源自于慢病毒的载体提供了在体内实现显着水平基因转移的手段。[0172]本文所用的术语“癌症”是指以异常细胞快速且不受控制生长为特征的疾病。癌细胞可以在局部扩散或通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位，各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。[0173]如本文所用的术语“抗肿瘤效果”可表现为肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加，或改善与癌症相关的各种生理症状。“抗肿瘤效果”还可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体预防肿瘤首次发生的能力来体现。[0174]如本文所用的术语“治疗”疾病是指降低受试者经历的疾病或病症至少一种体征或症状的频率或严重性。[0175]抗体和scfv[0176]本文所用的术语“抗体”是广义的用法，包括免疫球蛋白或抗体分子，抗体分子包括人抗体、人源化抗体、复合抗体和嵌合抗体以及单克隆或多克隆抗体片段。通常，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白质或肽链，其结构是众所周知的。根据具体实施方案，本发明的抗体包括来自人抗体的重链和/或轻链恒定区，除了重链和轻链恒定域外，抗体还包含一个抗原结合区，由轻链可变区和重链可变区组成，每个重链可变区都包含三个结构域(即互补决定区1-3；cdr1、cdr2和cdr3)，轻链可变区结构域也称为lcdr1、lcdr2和lcdr3，重链可变区结构域也称为hcdr1、hcdr2和hcdr3。[0177]本文所用的术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与ror1特异性结合的分离的抗体基本上不含不与ror1结合的抗体)，并且，分离的抗体基本上不含其他细胞材料和/或化学品。[0178]本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，意即除了可能少量存在的天然突变之外，构成群体的单个体抗体是相同的。本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或重组dna法制备，例如，单克隆抗体可以通过杂交瘤产生，该杂交瘤包括从转基因非人动物如转基因小鼠或大鼠获得的b细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。[0179]本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如双特异性抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv1)、二硫键稳定的双特异性抗体、单链抗体分子(scfv)、单域抗体(single domain antibody,sdab)、scfv二聚体(二价双特异性抗体)、由包含一个或多个cdr的抗体其一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)、纳米抗体、域抗体、二价域抗体或任何其他与抗原结合但不包含完整抗体结构的抗体片段。抗原结合片段能够结合亲本抗体或亲本抗体片段所结合的相同抗原。根据特定实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和重链的fd区段。根据其他特定实施方案，抗原结合片段包含fab和f(ab')。[0180]本文所用的术语“单链抗体”是指本领域常规的单链抗体，其包含由约15至20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用的术语“单域抗体”是指本领域常规的单域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区，或仅包含重链可变区。[0181]本文所用的术语“人抗体”是指人产生的抗体或使用本领域已知的任何技术制备具有与人产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体，人抗体的定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一条人重链和/或轻链多肽的抗体。[0182]本文所用的术语“人源化抗体”是指经修饰增加人抗体同源性序列的非人抗体，从而保留抗体的抗原结合特性，同时降低其在人体内的抗原性。[0183]本文所用的术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子氨基酸序列源自两种以上物种的抗体。轻链和重链的可变区通常对应源自一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和亲和能力的抗体的可变区，而恒定区对应源自另一种哺乳动物(例如人类)的抗体序列，以避免在该物种中引发免疫反应。[0184]本文所用的“特异性结合ror1”的抗体是指结合ror1的抗体，优选人ror1，具有1×10-7m或更小，优选1×10-8m或更小，更优选5×10-9m或更小、1×10-9m或更小、5×10-10m或更小、1×10-10m或更小的kd值。术语“kd”是指解离常数，是从kd和ka的比率(即kd/ka)获得，并以摩尔浓度(m)表示。本技术可以使用本领域的方法确定抗体kd值，举例来说，抗体的kd可以通过使用表面等离子体共振来确定，例如通过使用生物传感器系统(系统)，或通过使用生物层干涉技术，例如octet red96系统。[0185]抗体的kd值越小，抗体与目标抗原结合的亲和力越高。[0186]本文所用的抗体术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中其他分子的抗体。例如，和来自一物种的抗原特异性结合的抗体也可以和来自一种或多种物种的抗原结合，但是这种跨物种反应性本身不会改变抗体的特异性分类。在另一实施方式中，特异性结合抗原的抗体也可以结合不同等位基因形式的抗原，但这种交叉反应本身不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性的结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，表示相互作用取决于化学物质上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；举例来说，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是蛋白质的一般结构。如果抗体对表位“a”具有特异性，则在含有标记“a”和抗体的反应中，含有表位a(或游离的、未标记的a)的分子的存在会减少标记a与抗体结合的量。[0187]在某些实施方案中，如本文所述的抗体及其抗原结合片段包括重链和轻链cdr集合，分别插入重链和轻链框架区(fr)集合之间，该集合为cdr提供支持并定义了cdr相对于彼此的空间关系。如本文所用的术语“cdr集合”是指重链或轻链可变区的三个高变区，从重链或轻链的n端开始，这些区域分别表示为“cdr1”、“cdr2”和“cdr3”，因此，抗原结合位点包括六个cdr，包括来自重链和轻链可变区中的每一个的cdr集合。包含单个cdr(例如cdr1、cdr2或cdr3)的多肽在本文中被称为“分子识别单元”。许多抗原-抗体复合物的晶体学分析表明，cdr的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中与抗原最广泛接触的是重链cdr3。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。[0188]如本文所用的术语“fr集合”是指构成重链或轻链可变区的四个位于cdr侧翼的氨基酸序列。一些fr残基可能会接触结合的抗原，然而，frs主要负责将可变区折叠到抗原结合位点，尤其是与cdrs直接相邻的fr残基。在frs中，某些氨基酸残基和某些结构特征是极高度保守的，在这点上，所有可变区序列都包含一个约90个氨基酸残基的内部二硫环。当可变区折叠成结合位点时，cdr呈现为突出的环状模体(motif)，形成抗原结合面。人们普遍认为，无论确切的cdr氨基酸序列为何，fr的保守结构区会影响cdr环折叠成某些“规范的”结构。此外，已知某些fr残基参与稳定抗体重链和轻链相互作用的非共价域间接触。[0189]免疫球蛋白可变区的结构和位置可以通过参考kabat,e.a.et.al.,sequences of proteins of immunological interest,4th edition,us department of health and human services,1987，以及其更新来确定，现在可在互联网(immuno.bme.nwu.edu)上获得。[0190]如本文所用的“抗体重链”是指以其天然结构存在于所有抗体分子中的两种类型多肽链中的较大的一种。任何脊椎动物物种的重链都可以归入以下五种不同类别(或同种型)中的一种：iga、igd、ige、igg和igm，这些类别也分别指定为α、δ、ε、γ和μ。igg和iga类别根据序列和功能的差异进一步区分亚类，人类表达以下亚类：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。[0191]如本文所用的“抗体轻链”是指以其天然结构存在于所有抗体分子中的两种类型多肽链中较小的一种，κ和λ轻链是两种主要抗体轻链同种型。[0192]本文所用的术语“合成抗体”是指使用重组dna技术产生的抗体，例如由本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为通过合成编码抗体dna分子生成的抗体，并且该dna分子表达抗体蛋白，或指定抗体的氨基酸序列，其中dna或氨基酸序列是使用本领域惯用且众所周知的合成dna或氨基酸序列的技术所获得。[0193]在优选的实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段(或scfv)包含重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3，其多肽序列选自以下组别：[0194]a.seq id nos：2、3、4、6、7、8；或[0195]b.seq id nos：16、17、18、20、21、22；或[0196]c.seq id nos：30、31、32、34、35、36；[0197]其中抗体或其抗原结合片段特异性结合ror1，优选人ror1。[0198]在优选的实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段(或scfv)包含重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3，其多肽序列选自以下组别：[0199]a.seq id nos：9、10、11、12、13的第1-2位氨基酸(da)、14；或[0200]b.seq id nos：23、24、25、26、27的第1-2位氨基酸(da)、28；或[0201]c.seq id nos：37、38、39、40、41的第1-2位氨基酸(da)、42；[0202]其中抗体或其抗原结合片段特异性结合ror1，优选人ror1。[0203]在一优选的实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合片段(如scfv)包含具有与seq id no：1、15或29其中之一至少85％、优选90％、更优选95％或以上，例如95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽序列的重链可变区；或具有与seq id no：5、19或33其中之一至少85％、优选90％、更优选95％或以上，例如95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽序列的轻链可变区。[0204]在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段(如scfv)还包括保守突变体，意即与本发明抗体的氨基酸序列相比，有最多10个，优选最多8个，更优选最多5个，最优选最多3个氨基酸被具有相同或相似特性的氨基酸替换形成的多肽，这些保守突变体多肽优选根据表a的氨基酸置换产生。[0205]表a[0206][0207][0208]嵌合抗原受体、编码序列和载体[0209]本发明还提供了靶向ror1的嵌合抗原受体，以及相应的编码序列或多核苷酸和载体。[0210]本文所用的术语“嵌合抗原受体(car)”是指具有结合域的分子，该结合域能够针对目标细胞上表现的元件，例如基于针对目标抗原(如肿瘤抗原)抗体特异性与t细胞受体激活细胞内结构域产生的表现出特异性抗靶细胞免疫活性的嵌合蛋白。[0211]本发明的嵌合抗原受体(car)包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，胞外结构域包括靶特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)，胞内结构域包括一个共刺激信号区域和一个zeta(δ)链部分。[0212]通常，car由与t细胞抗原受体复合物zeta链的细胞内信号结构域融合的胞外单链抗体组成，并在t细胞中表达时具有根据抗体特异性重定向抗原识别的能力。[0213]优选地，本发明的car包含：信号肽、包含抗ror1抗体vh和vl的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号结构域。[0214]如本文所用的术语“细胞外抗原结合结构域”是指能够与配体结合的寡肽或多肽。优选地，该结构域将能够与细胞表面的分子相互作用，例如可以选择细胞外抗原结合结构域来识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标志物的配体。[0215]举例来说，可以选择细胞外抗原结合结构域来识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标志物的配体。抗ror1 car的胞外抗原结合结构域可以是与组织外抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体，以及其功能片段。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含单链抗体片段(scfv)，其包含通过连接肽连接的靶抗原特异性抗ror1抗体轻链(vl)和重链(vh)可变片段。优选地，单链抗体或scfv是由核苷酸序列编码的氨基酸链序列。[0216]优选地，vl和vh选自表2所示的抗体克隆c3、g3或g6。[0217]关于跨膜结构域，car可以设计为包含与car的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一实施方案中，使用与car的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可以通过氨基酸置换来筛选或修饰，以避免该结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合物其他部件的相互作用。[0218]跨膜结构域可以源自天然或合成来源，天然来源的结构域可以来自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。本发明中使用的跨膜区可源自(即至少包含其跨膜区)t细胞受体、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154，或者跨膜结构域可以是合成的，这种来源下其将主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成跨膜结构域的两端有苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，长度在2至10个氨基酸之间的连接短寡肽或多肽可以形成car的跨膜结构域和细胞内信号结构域间的连接，甘氨酸-丝氨酸双联体为特别合适的连接肽。[0219]优选地，本发明的car中跨膜结构域为cd8α跨膜结构域。在一些情况下，本发明的car中跨膜结构域包含cd8α铰链结构域。在一实施例中，cd8α跨膜结构域和cd8α铰链结构域包含seq id no：2的氨基酸序列。[0220]本发明car的细胞内结构域或其他细胞内信号结构域负责激活表达car的免疫细胞至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指细胞的特殊功能，例如t细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。术语“细胞内信号结构域”是指转导效应功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质部分，虽然通常可以使用整个细胞内信号结构域，但在许多情况下没有必要使用整条链，就使用细胞内信号结构域的截断部分而言，只要其转导效应功能信号即可用于代替完整链。因此，术语“细胞内信号结构域”包括能够转导效应功能信号的细胞内信号结构域中任何截断部分。[0221]用于本发明的car其细胞内信号结构域的优选实例包括t细胞受体(tcr)和协同受体的细胞内序列，其在抗原受体结合后协同作用以启动信号转导，上述序列的任何衍生物或变体以及合成序列均具有相同的功能。[0222]众所周知，仅通过tcr产生的信号不足以完全激活t细胞，还需要二次或共刺激信号，因此，可以说t细胞活化是由两种不同类型的细胞内信号序列介导的：通过tcr(初级细胞内信号序列)启动抗原依赖性初级激活的序列，以及透过不依赖抗原的方式作用，提供次级或共刺激信号(次级细胞内信号序列)的序列。[0223]初级细胞内信号序列以刺激或抑制方式调节tcr复合物的初级激活。以刺激方式作用的初级细胞内信号序列可能包含信号模体，这些模体为基于免疫受体酪氨酸的激活模体或itam。[0224]本发明所用含有初级细胞内信号序列的itam包括源自tcrδ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的序列。特别优选地，本发明的car中的细胞内信号分子包含源自cd3δ的细胞内信号序列。[0225]在一优选的实施方案中，car的细胞内结构域可以被设计为包含cd3δ信号结构域本身或与本发明car的上下文中任何其他有用的细胞内结构域组合，例如car的细胞内结构域可包含cd3δ链部分和共刺激信号区，共刺激信号区是指car中包含共刺激分子胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原有效反应所需的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3以及与cd83特异性结合的配体等。因此，虽然本发明主要以4-1bb作为共刺激信号部分来举例说明，但其他共刺激分子也在本发明的范围内。[0226]更具体地，本发明的ror1特异性car包含cd8α信号肽、细胞外ror1结合域、cd8α铰链、cd8α跨膜结构域、细胞内cd3δ信号结构域和来自4-1bb的共刺激结构域。[0227]在一实施方案中，本发明car中的细胞内结构域被设计为包含4-1bb的共刺激结构域和cd3δ的信号结构域。[0228]car免疫细胞[0229]本发明还提供经工程化改造能够表达car的修饰的免疫细胞(例如t细胞)，其中car免疫细胞(例如car-t细胞或car-nk细胞)表现出抗肿瘤特性。[0230]本文所用的术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是指参与免疫反应的细胞，例如参与促进免疫效应应答，免疫细胞包括t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、肥大细胞和髓源性吞噬细胞。根据具体实施方案，工程化免疫细胞是t细胞，并且被称为car-t细胞，其被工程化以表达本发明的car。[0231]本文所用的术语“修饰的免疫细胞”是指包含编码car的外源多核苷酸序列并表达至少一种如上所述的car的细胞。根据具体的实施方案，工程化的免疫细胞已被遗传修饰以表达本发明的car构建体。[0232]免疫细胞可以是树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、nk细胞、b细胞或t细胞，上述t细胞选自炎性t淋巴细胞、细胞毒性t淋巴细胞、调节性t淋巴细胞或辅助t淋巴细胞。细胞可以来自由cd4+ t淋巴细胞和cd8+ t淋巴细胞的组合。[0233]免疫细胞及其前体细胞可以通过本领域已知的方法分离，包括使用现有商品的方法(参见rowland jones et al.,lymphocytes:a practical approach,oxford university press,ny 1999)，免疫细胞或其前体的来源包括但不限于外周血、脐带血、骨髓或其他造血细胞来源。多种技术可以用来分离或富集所需的免疫细胞，例如，可以使用负筛选方法去除非目标的免疫细胞，此外，可以使用正筛选方法来分离或富集所需的免疫细胞或其前体，或者可以使用正筛选和负筛选方法的结合。如果要分离特定类型的细胞，例如特定的t细胞，可以使用其细胞表面标志物或标志物的组合(例如cd3、cd4、cd8、cd34)来分离细胞。[0234]在本发明的治疗方法中给受试者施用的免疫细胞或其前体细胞可以是自体或非自体的，自体细胞是从欲施用重组表达car的工程化免疫细胞的受试者体内分离出来的。细胞可通过白细胞清除术获得，其从抽取的血液中选择性地去除白细胞，进行重组，然后再输给供血者。或者，可以使用来自非受试者的非自体捐赠者的同种异体细胞，在非自体捐赠者的情况下，将细胞进行分型以及人类白细胞抗原(hla)匹配以确认兼容性水平。对于自体和非自体细胞，可以选择将细胞冷冻保存直至准备使用。[0235]在本发明中，细胞可以优选地从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤，还可以来自本领域技术人员可用和已知的t细胞系，或来自健康捐赠者、诊断患有癌症的患者。[0236]根据特定的实施方案，制造工程化免疫细胞的方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达本发明实施方案的一种或多种car。wo2014/130635公开了制备用于免疫疗法的免疫细胞的方法，wo2014/039523、wo2014/184741公开了可用于制备工程化免疫细胞的各个步骤，前述文献通过全文引用并入本技术文件中。[0237]在一具体实施方案中，免疫效应细胞(例如t细胞)用本发明的car进行遗传修饰(例如用包含编码car核酸的病毒载体转导)，然后在体外激活和增殖。在各种实施方案中，可以在基因修饰之前或之后使用如us6352694、u57144575和us7067318中所述的方法激活和扩增t细胞以表达car，这些文献通过全文引用并入本技术文件中。t细胞可以在体外或体内增殖，通常来说，本发明的t细胞可以通过刺激cd3/tcr复合物相关信号的试剂以及刺激t细胞表面共刺激分子的配体而增殖。作为刺激t细胞增殖的非限制性实施例，可以通过与抗cd3抗体或其抗原结合片段接触、或固定在细胞表面的抗cd3抗体接触、或通过与蛋白激酶c激活剂(例如苔藓抑素)结合钙离子载体接触、或通过激活car本身。为了共刺激t细胞表面的辅助分子，使用与辅助分子结合的配体，例如可以将t细胞与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触，在适当条件下刺激t细胞增殖。t细胞培养的适当条件包括：含有增殖和活化所需因子的适当培养基(例如minimal essential media、rpmi media 1640或x-vivo 5(lonza))，其包含血清(例如胎牛或人血清)、细胞因子(例如il-2、il-7、il-15和/或il-21、胰岛素、ifn-g、gm-csf、tgfβ3)，和/或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。在其他实施方案中，也可以使用诸如us6040177、us5827642和wo2012129514中公开的方法，该方法使用培养细胞和合适的抗体和细胞因子活化并刺激t细胞增殖，前述文献通过全文引用并入本技术文件中。[0238]当本发明的car在t细胞中表达时，car能够基于抗原结合特异性定向识别抗原。当本发明的car-t细胞与同源抗原结合时，会抑制肿瘤细胞生长、促使肿瘤细胞死亡或受到其他影响，从而减轻或消除患者的肿瘤负担。[0239]药物组合物[0240]本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的分离多核苷酸、分离多肽、宿主细胞和/或工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体。本文所用的术语“药物组合物”是指包含本发明的分离多核苷酸、分离多肽、宿主细胞和/或工程化免疫细胞以及药学上可接受的载体的产品，本发明的多核苷酸、多肽、宿主细胞和/或工程化免疫细胞以及其组合物也可用于制造上文提及的治疗应用的药物。[0241]本文所用的术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含脂质的囊泡、微球、脂质体包封或本领域公知用于药物制剂的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特性将取决于特定应用的给药途径。本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指不干扰本发明组合物的有效性或生物活性的无毒材料。根据特定的实施方案，任何适用于多核苷酸、多肽、宿主细胞和/或工程化免疫细胞药物组合物的药学上可接受的载体均可适用于本发明。[0242]药物活性成分与药学上可接受的载体组成的制剂是本领域公知常识，例如remington：the science and practice of pharmacy(2005年第21版以及任何更新的版本)。附加成分的非限制性实施例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张力调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。可使用一种或多种药学上可接受的载体配制本发明的药物组合物。[0243]优选地，本发明的组合物是液体制剂，例如水性制剂或注射剂。[0244]本发明的药物组合物配制与其预期的给药途径相容，给药的方法是本领域已知的，可以是静脉、腹膜、肌肉、皮下、皮内、经粘膜或肿瘤内给药。[0245]适合用于注射的药物组合物包括无菌水溶液或分散体，以及用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末，举例来说，可以通过无菌过滤膜过滤来完成灭菌。对于静脉给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el(basf,parsippany,n.j.)或磷酸缓冲生理盐水(pbs)。在许多情况下，组合物中优选包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇和氯化钠。[0246]治疗应用[0247]car、表达载体和修饰的免疫细胞可用于治疗患有以ror1表达细胞，尤其是ror1表达过多为特征的恶变前或恶性肿瘤的患者，此类疾病常见于血液恶性肿瘤，例如白血病。[0248]白血病可以是急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和骨髓增生异常综合征。[0249]根据一优选的实施方案，提供本发明修饰的免疫细胞用于治疗慢性淋巴细胞白血病(cll)或急性淋巴细胞白血病(all)。[0250]本发明的car治疗的癌症类型包括但不限于非实体瘤(例如血液恶性肿瘤)，成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也包括在内。[0251]此外，实体肿瘤例如乳房、结肠、肝、肺、肾、胰腺、前列腺、肾和卵巢也可以通过本发明的car进行治疗。[0252]本发明的主要优势包括：[0253](a)本发明的抗体具有优良的生物活性和特异性，对细胞表面ror1具有良好的结合亲和力，可作为ror1靶向抗体和ror1靶向car的scfv元件；[0254](b)本发明的全人源抗体和scfv不仅具有与免疫抗体相当的活性，并且免疫原性较低；[0255](c)本发明的抗体和靶向ror1的car均具有显着的抗肿瘤活性，并且对哺乳动物本身无明显毒副作用；[0256](d)本发明的抗体和靶向ror1的car不仅在肿瘤模型中具有显着的治疗效果，并且适用于其他与ror1高表达相关的疾病。[0257]以下实施例将进一步阐述本发明。应当理解本实施例仅用于描述本发明，并非限制本发明的范围。实施例的实验方法，若没有点出具体条件，则通常是根据常规条件进行，例如sambrook et al.,molecular cloning:laboratory manual(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)描述的条件，或根据制造商推荐的条件进行。除非另有说明，实施例中提及的百分比和其他数值是指重量百分比和重量。细胞系为市售或购自atcc的常规产品，所有质粒均为市售产品。[0258]细胞系：[0259]所有细胞系均获取自美国典型培养物保藏中心(atcc)。jeko-1以及过表达ror1的mda-mb-231、ncl-h358、ncl-h1975、ht-29、sk-ov-3、u87mg、sk-ov-3细胞在含有10％fbs的rpmi1640中培养；293t、pan02、panc-1、a549细胞在含有10％fbs的dmem1640中培养；培养条件为37℃、5％co2。[0260]实施例1：从全人噬菌体抗体库中筛选抗ror1特异性结合子[0261]使用噬菌体展示系统合成人抗ror1抗体，这些抗体是通过使用专有增强型人源性噬菌体文库(promab biotechnologies,inc.)生成的。[0262]抗ror1抗体克隆c3、g3和g6为三株高亲和力的抗体，其vh和vl的氨基酸序列见表1。[0263]表1.抗ror1抗体克隆c3、g3和g6的氨基酸序列。[0264][0265][0266][0267][0268]表2.抗体vh、vl和cdr的序列id[0269][0270][0271]上述三个抗体克隆对人ror1的亲和力如下所示。[0272][0273]抗ror1抗体和ror1之间相互作用的表位作图显示，c3和g3与ror1的克林格(kringle)结构域结合，g6与ror1的免疫球蛋白样结构域结合。[0274]实施例2：构建抗ror1嵌合抗原受体(抗ror1-car)表达载体[0275]本发明带有全人抗ror1 scfv的car被设计为包含与抗ror1 scfv有效连接的ef1α启动子、来自cd8α和4-1bb共刺激结构域的铰链和跨膜结构域，然后是cd3δ链的细胞内信号结构域。抗ror1-car还包含一个cd8α信号肽序列，用于在免疫效应细胞表面表达。scfv以外的car组成部分氨基酸序列见表3，抗ror1-car的构建如图1b所示。[0276]表3.scfv之外的car组成部分的序列[0277][0278][0279]三个抗ror1 car构建体编码的scfv氨基酸序列如下：[0280][0281]抗ror1-car慢病毒载体是通过标准实验室方案构建的。简言之，gv401的线型化质粒是通过用bamhi限制性内切核酸酶(neb，cat：r0136l)消化而得。抗ror1-scfv序列由geneiwiz inc.合成，抗ror1-car基因片段由扩增引物通过pcr扩增获得。[0282]在5’端插入同源重组序列设计的引物，并通过重叠pcr扩增构建抗ror1-car慢病毒载体质粒，抗ror1-car慢病毒载体结构如图1a所示。将前述重组质粒用于转化大肠杆菌，然后挑取克隆进行pcr测序鉴定，带有正确序列的克隆被培养并提取用于包装慢病毒。[0283]实施例3：制备携带抗ror1-car载体的慢病毒[0284]抗ror1-car慢病毒是使用标准实验室方法制造的。简言之，在第1天将2×106 hek293t细胞接种在10cm培养皿中，然后用lipofectamine3000试剂(invitrogen，cat：l3000015)和转染载体进行转染；在第2天包装抗ror1-car-gv401载体、含有gag、pol、rev基因的phelper1.0载体和含有vsvg假型包膜基因的phelper1.0载体；在第3天更换培养基；在第5天收集上清液并以4000g离心10分钟去除细胞成分，以0.45微米过滤器过滤，接着，将含有慢病毒的上清液在4℃、25000rpm下离心2小时，然后丢弃上清液，加入病毒保存液，于-80℃保存备用。[0285]实施例4：从外周血和表型测试中分离pbmc[0286]从健康志愿者的新鲜外周血中分离外周血单个核细胞(pbmc)。首先，用真空采血器和抗凝剂从健康志愿者身上采集10-20ml新鲜外周血，然后将新鲜血液转移到50ml离心管中，在室温下以2000rpm离心10分钟；丢弃上层血浆后，用生理盐水1:1稀释细胞，轻轻上下排吸3-5次；接着，将15ml ficoll-hypaque淋巴细胞分离液(ge，cat：17-1440-02)加入50ml离心管中，然后缓慢加入稀释的外周血，将样品在室温下以2000rpm离心30分钟；最后，小心地将上清液转移到新的50ml离心管中，并用生理盐水冲洗淋巴细胞3次。使用流式细胞术检测cd3+(bd,cat:552852)、cd4+(bd,cat:555347)和cd8+(bd,cat:555369)细胞亚群的比例，结果如图2所示。[0287]实施例5：pbmc感染抗ror1-car慢病毒[0288]pbmc以1.5×106/ml重悬并以每6孔板2ml接种，并加入1mg/ml cd3(miltenyi,cat:170-076-116)和0.5mg/ml cd28(miltenyi，cat：170-076-116)可溶性抗体以及15μg/ml retronectin(takara，cat：t100a)进行细胞活化；第二天将moi为3的抗ror1-car慢病毒加入每个孔中，两天后，回收细胞并以1.5×106/ml密度重悬，四天后用于facs和共培养实验。[0289]实施例6：通过facs评估抗ror1-car-t细胞的感染效率和表型[0290]方法一[0291]构建以自剪切多肽2a分隔，同时表达抗ror1-car和绿色荧光蛋白的慢病毒载体用于确认抗ror1-car的表达效率，通过流式细胞技术(facs)检测绿色荧光蛋白来确认抗ror1-car的表达效率。感染效率检测及表型分析如下：首先，取1×106个细胞用前述慢病毒感染，用洗涤缓冲液冲洗两次，接着加入15μl apc抗人cd8抗体(bd，货号：555369)、15μl pe抗人cd4抗体(bd，货号：555347)、15μl percy5.5抗人cd3抗体(bd，货号：552852)，于4℃避光孵育30分钟；第二步，将样品在室温下以1000rpm离心5分钟，然后去除上清液；第三步，加入facs缓冲液冲洗两次，然后在室温下以1000rpm离心5分钟；最后，将细胞用150μl facs缓冲液悬浮，并通过facs检测荧光。[0292]方法二[0293]构建以自剪切多肽2a分隔，同时表达抗ror1-car和绿色荧光蛋白的慢病毒载体用于确认抗ror1-car的表达效率，通过流式细胞技术(facs)检测绿色荧光蛋白来确认抗ror1-car的表达效率。感染效率检测及表型分析如下：首先，取1×106个细胞用前述慢病毒感染，用洗涤缓冲液冲洗两次，接着加入15μl apc抗人cd8抗体(bd，货号：555369)、15μl pe抗人cd4抗体(bd，货号：555347)、15μl percy5.5抗人cd3抗体(bd，货号：552852)、5μl brilliant violiant 510tm抗人cd45ro抗体(biolegend，货号：304246)、5μl brilliant violiant 421tm抗人cd197抗体(ccr7)(biolegend，货号：353208)，于4℃避光孵育30分钟；第二步，将样品在室温下以1000rpm离心5分钟，然后去除上清液；第三步，加入facs缓冲液冲洗两次，然后在室温下以1000rpm离心5分钟；最后，将细胞用150μl facs缓冲液悬浮，并通过facs检测荧光。[0294]对实施例的各种修改于本领域技术人员而言是显而易见的，方法一和方法二中定义的步骤具有通用性，可用于其他抗ror1-car-t细胞的分析。[0295]6.1抗ror1-c3-car-t细胞分析[0296]抗ror1-c3-car-t细胞采用方法一进行分析，分析结果见图3。t细胞的感染效率约为40％，其中35％的t细胞为cd4 t细胞，65％的t细胞为cd8 t细胞。[0297]6.2抗ror1-g3-car-t细胞分析[0298]抗ror1-g3-car-t细胞采用方法二进行分析，分析结果见图4和图6。t细胞的感染效率约为54％，其中30％的t细胞为cd4 t细胞，70％的t细胞为cd8 t细胞；46.5％的抗ror1-g3-car-t细胞是中央记忆型t细胞，28％的抗ror1-g3-car-t细胞是效应t细胞，20％的抗ror1-g3-car-t细胞是初始t细胞(t cell)。[0299]实施例7：评估比较非转导t细胞与抗ror1-car-t细胞的增殖[0300]为了进行体外评估抗ror1-car-t细胞的增殖，将0.5×106/ml抗ror1-car-t细胞、cd19-car-t细胞和非转导t细胞分别在texmacs(miltenyi，货号：170-076-309)+10％fbs+200iu/ml il-2(miltenyi，货号：130-097-748)+100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素中培养，每2天更换一次完全培养基并计算t细胞的数量。[0301]分析抗ror1-g3-car-t细胞，结果如图5所示，抗ror1-g3-car-t细胞的扩增数量与未转导的t细胞保持相似。[0302]实施例8：筛选ror1阳性和ror1阴性细胞系[0303]透过facs分析八种人类细胞系(见表4)以鉴定具有不同细胞表面表达水平的ror1细胞系。将细胞用含有0.5％bsa和抗ror1抗体(bd，货号：564474)的pbs悬浮，然后在4℃下孵育30分钟，然后用洗涤缓冲液冲洗细胞两次并检测ror1表达。[0304]结果如图7所示，mda-mb-231、panc-1、ht-29、a549、ncl-h358、ncl-h1975、jeko-1细胞大量表达ror1，而pan02细胞不表达ror1。[0305]将上述细胞系用于测试抗ror1-car的活性。[0306]表4.不同细胞系的ror1表达[0307]细胞系细胞类型ror1表达mda-mb-231乳腺癌阳性panc1胰腺上皮样癌阳性pan02胰腺上皮样癌阴性ncl-h358非小细胞肺癌阳性ncl-h1975非小细胞肺癌阳性a549肺腺癌阳性ht-29结直肠腺癌阳性jeko-1套细胞淋巴瘤阳性[0308]实施例9：细胞因子释放试验[0309]方法一[0310]使用人th1/th2细胞因子cba试剂盒(bd，货号：550749)评估抗ror1-car-t细胞对ror1阳性和ror1阴性肿瘤细胞的杀伤生物学活性。[0311]将抗ror1-car-t细胞或pbmc与mda-mb-231(ror1+)、panc-1(ror1+)、ncl-h358(ror1+)、ncl-h1975(ror1+)、a549(ror1+)、ht-29(ror1+)、jeko-1(ror1+)或pan02(ror1-)细胞系共培养24小时，试验具体步骤如下：首先，回收靶细胞(ror1+)和非靶细胞(ror1-)并用洗涤缓冲液冲洗两次，以含有2％fbs的rpmi1640悬浮细胞并稀释至1×106个细胞/ml的浓度，然后回收抗ror1-car-t细胞和pbmc细胞(效应细胞)并稀释至1×106个细胞/ml的浓度，将100μl靶细胞(ror1+)或非靶细胞(ror1-)与100μl抗ror1-car-t细胞或pbmc按1:1混合至96孔板中，于37℃共培养20-24小时；第二步，回收100μl培养液，以1000rpm离心5分钟，取上清液用于细胞因子释放检测；第三步，取出细胞因子捕获珠并充分混匀，将50μl混匀的珠子和50μl pe检测试剂加入每个上清液样品(50μl)中，充分混匀并于室温避光孵育3小时，然后将1ml洗涤缓冲液加入每个样品中，并以200g离心5分钟，去除上清液后在每个样品中加入300μl洗涤缓冲液以悬浮珠子；最后，透过流式细胞术分析样品。[0312]方法二[0313]通过使用人th1/th2细胞因子cba试剂盒(bd，货号：550749)评估抗ror1-car-t细胞对ror1过表达sk-ov-3和u87mg细胞的杀伤生物学活性。[0314]将抗ror1-car-t细胞或pbmc与ror1过表达sk-ov-3和u87mg细胞系共培养24小时，试验细节如下：首先，回收靶细胞(ror1过表达sk-ov-3和u87mg细胞)和非靶细胞(sk-ov-3和u87mg)并用洗涤缓冲液冲洗两次，以含有2％fbs的rpmi1640悬浮细胞并稀释至1×106个细胞/ml的浓度，然后回收抗ror1-car-t细胞和pbmc细胞(效应细胞)并稀释至1×106个细胞/ml的浓度，将100μl靶细胞(ror1过表达sk-ov-3和u87mg细胞)或非靶细胞(sk-ov-3和u87mg)与100μl抗ror1-car-t细胞或pbmc按1:1混合至96孔板中，于37℃共培养20-24小时；第二步，回收100μl培养液，以1000rpm离心5分钟，取上清液用于细胞因子释放检测；第三步，取出细胞因子捕获珠并充分混匀，将50μl混匀的珠子和50μl pe检测试剂加入每个上清液样品(50μl)中，充分混匀并于室温避光孵育3小时，然后将1ml洗涤缓冲液加入每个样品中，并以200g离心5分钟，去除上清液后在每个样品中加入300μl洗涤缓冲液以悬浮珠子；最后，透过流式细胞术分析样品。[0315]对实施例的各种修改于本领域技术人员而言是显而易见的，方法一和方法二中定义的步骤具有通用性，可用于其他抗ror1-car-t细胞的分析。[0316]9.1抗ror1-c3-car-t细胞分析[0317]使用方法一评估抗ror1-c3-car-t细胞对ror1阳性和ror1阴性肿瘤细胞的杀伤生物学活性。[0318]结果如图8所示，只有在ror1阳性细胞存在的情况下，抗ror1-c3-car-t细胞才会释放il-2、tnfα、ifnγ，即抗ror1-c3-car-t细胞仅在与ror1阳性靶细胞共培养时才产生细胞因子，而与ror1阴性细胞共培养时不产生细胞因子，证明car-t细胞具有特异性杀伤ror1阳性肿瘤细胞系的能力，对正常细胞没有杀伤作用。[0319]9.2抗ror1-g3-car-t细胞分析[0320]使用方法二评估抗ror1-g3-car-t细胞对ror1过表达sk-ov-3和u87mg细胞的杀伤生物学活性。[0321]结果如图9所示，只有在靶细胞(ror1过表达sk-ov-3和u87mg细胞)存在的情况下，抗ror1-g3-car-t细胞才会释放il-2、tnfα、ifnγ，即抗ror1-g3-car-t细胞仅在与ror1阳性靶细胞(ror1过表达sk-ov-3和u87mg细胞)共培养时才产生细胞因子，而与ror1阴性细胞(sk-ov-3和u87mg细胞)共培养时不产生细胞因子，证明car-t细胞具有特异性杀伤ror1阳性肿瘤细胞系的能力，对正常细胞没有杀伤作用。[0322]实施例10：细胞裂解能力测试[0323]用共培养试验评估由抗ror1-car-t细胞引起的细胞裂解。将抗ror1-car-t细胞或pbmc与mda-mb-231(ror1+)、panc-1(ror1+)、ncl-h358(ror1+)、ncl-h1975(ror1+)、a549(ror1+)、ht-29(ror1+)或pan02(ror1-)细胞共培养24小时。细胞裂解试验具体步骤如下：首先，回收靶细胞(ror1+)和非靶细胞(ror1-)并用洗涤缓冲液冲洗两次，以含有2％fbs的rpmi1640悬浮细胞并稀释至1×106个细胞/ml的浓度，然后回收抗ror1-car-t细胞和pbmc细胞(效应细胞)并稀释至1×106个细胞/ml的浓度；将效应细胞与靶细胞或非靶细胞按1:1接种于12孔板中，于37℃共培养24小时；最后，评估细胞存活率并拍照。[0324]分析抗ror1-car-t细胞，结果显示抗ror1-c3-car-t细胞导致mda-mb-231(ror1+)、panc-1(ror1+)、ncl-h358(ror1+)、ncl-h1975(ror1+)、a549(ror1+)和ht-29(ror1+)细胞裂解，但不会导致pan02(ror1-)细胞裂解，如图10所示。[0325]实施例11：细胞毒性试验[0326]方法一[0327]通过ldh释放试验评估细胞毒性，所用试剂盒为cytotoxnon-radioactive cytotoxicity assay(promega,，货号：g1780)。[0328]抗ror1-car-t细胞或pbmc与mda-mb-231(ror1+)、panc-1(ror1+)、ncl-h358(ror1+)、ncl-h1975(ror1+)、a549(ror1+)、ht-29(ror1+)、jeko-1(ror1+)或pan02(ror1-)细胞共培养4-6小时。细胞毒性试验细节如下：首先，回收靶细胞(ror1+)和非靶细胞(ror1-)并用洗涤缓冲液冲洗两次，以含有2％fbs的rpmi1640悬浮细胞并稀释至1×105个细胞/ml的浓度，然后回收抗ror1-car-t细胞和pbmc细胞(效应细胞)并分别稀释至2×106个细胞/ml、1×106个细胞/ml、0.5×106个细胞/ml、1×105个细胞/ml的浓度，将上述细胞加入96孔板(200μl)中，各组别的组成见表5，效应细胞:靶细胞的比例分别为20:1、10:1、5:1、1:1，接着，于37℃培养4-6小时，实验结束前45分钟加入20μl的10×裂解液(来自检测试剂盒)至最大靶细胞释放组中；每孔取出50μl上清液转移至新的96孔板中，然后在96孔板中加入50μl底物，于室温下避光孵育30分钟；最后，加入50μl终止液，以490nm波长测量吸光值。使用以下公式计算特定裂解的百分比：[0329](x–effector–target auto release+背景值)/(y-b)[0330]表5.ldh释放试验的实验组设计[0331][0332]方法二[0333]通过ldh释放试验评估细胞毒性，所用试剂盒为cytotoxnon-radioactive cytotoxicity assay(promega,，货号：g1780)。[0334]抗ror1-car-t细胞或pbmc与ror1过表达sk-ov-3和u87mg细胞(ror1+)或sk-ov-3和u87mg细胞(ror1-)共培养4-6小时。细胞毒性试验具体步骤如下：首先，回收靶细胞(ror1+)和非靶细胞(ror1-)并用洗涤缓冲液冲洗两次，以含有2％fbs的rpmi1640悬浮细胞并稀释至1×105个细胞/ml的浓度，然后回收抗ror1-car-t细胞和pbmc细胞(效应细胞)并分别稀释至2×106个细胞/ml、1×106个细胞/ml、0.5×106个细胞/ml、1×105个细胞/ml的浓度，将上述细胞加入96孔板(200μl)中，各组别的组成见表5，效应细胞:靶细胞的比例分别为20:1、10:1、5:1、1:1，接着，于37℃培养4-6小时，实验结束前45分钟加入20μl的10×裂解液(来自检测试剂盒)至最大靶细胞释放组中；每孔取出50μl上清液转移至新的96孔板中，然后在96孔板中加入50μl底物，于室温下避光孵育30分钟；最后，加入50μl终止液，以490nm波长测量吸光值。使用以下公式计算特定裂解的百分比：[0335](x–effector–target auto release+背景值)/(y-b)[0336]表5.ldh释放试验的实验组设计[0337][0338]对实施例的各种修改于本领域技术人员而言是显而易见的，方法一和方法二中定义的步骤具有通用性，可用于其他抗ror1-car-t细胞的分析。[0339]11.1抗ror1-c3-car-t细胞分析[0340]使用方法一评估抗ror1-c3-car-t细胞的细胞毒性。结果如图11所示，抗ror1-c3-car-t细胞对ror1阳性肿瘤细胞有明显的细胞毒性，但对ror1阴性肿瘤细胞没有细胞毒性，证明car-t细胞具有特异性杀伤ror1阳性肿瘤细胞系的能力，且对正常细胞没有杀伤作用。[0341]11.2抗ror1-g3-car-t细胞分析[0342]使用方法二评估抗ror1-g3-car-t细胞的细胞毒性。结果如图12所示，抗ror1-g3-car-t细胞对ror1过表达sk-ov-3和u87mg细胞有明显的细胞毒性，但对sk-ov-3和u87mg细胞没有细胞毒性，证明car-t细胞具有特异性杀伤ror1阳性肿瘤细胞系的能力，且对正常细胞没有杀伤作用。[0343]实施例12：抗ror1-car-t细胞安全性测试[0344]为了评估抗ror1-car-t细胞的安全性，本实施例使用了8周龄的nsg小鼠(购自上海模式生物中心)。将小鼠饲养在温度20-25℃和相对湿度40-70％的设施中，皮下接种5×106个表达ror1的肿瘤细胞sk-ov-3；一周后，当小鼠荷瘤体积达到100mm3时，给其注射不同剂量的抗ror1-car-t细胞、对照t细胞或pbs溶液。[0345]总共40只荷瘤小鼠，分为5组，每组4只雄性小鼠和4只雌性小鼠；第一组给予1×106个car-t细胞，第二组给予5×106个car-t细胞，第三组给予1×107个car-t细胞，第四组给予1×107个正常t细胞，第五组注射pbs溶液作为对照。小鼠注射car-t细胞后，每天密切观察小鼠的不良反应和活动状态，共观察28天，从注射car-t细胞开始日记录体重，每周记录到第28天，研究结束后将小鼠安乐死，尸体进行剖检以观察主要器官的病理变化。心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑、小脑、淋巴结未见病理改变，呼吸系统、消化系统、颅神经系统也未见异常症状，因此，抗ror1-car-t细胞在nsg荷瘤小鼠中显示出高安全性。[0346]对实施例的各种修改于本领域技术人员而言是显而易见的，本文定义的方法可用于分析任何抗ror1-car-t细胞。[0347]实施例13：抗ror1-car-t细胞功能检测[0348]方法一[0349]为了评估各个car的抗ror1-scfv序列的体内功能，使用转导表达萤火虫荧光素酶的mb-mda-231肿瘤细胞的小鼠荷瘤模型。将1×107个细胞皮下注射到nod-prkdcscidil2rgem1/smoc小鼠(购自上海模式生物中心)，然后在第20天将1×107个抗ror1-car-t细胞注射到肿瘤中，mda-mb-231细胞接种在nsg小鼠中，44天后，注射抗ror1-car-t细胞并测量肿瘤大小。[0350]方法二[0351]为了评估各个car的抗ror1-scfv序列的体内功能，使用转导表达萤火虫荧光素酶的ror1过表达jeko-1、sk-ov-3和u87mg细胞的小鼠肿瘤模型。在套细胞淋巴瘤异种移植物中，将1×106个jeko-1细胞尾静脉注射到nod-prkdcscidil2rgem1/smoc小鼠(购自上海模式生物中心)，然后在第2天或第12天静脉注射不同剂量的抗ror1-car-t细胞；在卵巢癌异种移植模型中，将1×106个sk-ov-3-ror1细胞腹腔注射到nod-prkdcscidil2rgem1/smoc小鼠，然后于第2天腹腔注射1×107个抗ror1-car-t细胞；在脑胶质瘤异种移植模型中，1×105个u87mg-ror1细胞颅内注射到nod-prkdcscidil2rgem1/smoc小鼠，然后在第5天将2×106个抗ror1-car-t细胞注射到肿瘤中并测量肿瘤大小。[0352]对实施例的各种修改于本领域技术人员而言是显而易见的，方法一和方法二中定义的步骤具有通用性，可用于其他抗ror1-car-t细胞的分析。[0353]13.1抗ror1-c3-car-t细胞分析[0354]采用方法1评估抗ror1-c3-car-t细胞的功能，结果如图13所示。根据肿瘤生长曲线，注射抗ror1-c3-car-t细胞组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，而pbmc组肿瘤生长正常。[0355]13.2抗ror1-g3-car-t细胞分析[0356]采用方法2评估抗ror1-g3-car-t细胞的功能，结果见图14、图15、图16和图17。[0357]在多个动物模型中，抗ror1-g3-car-t细胞治疗皆可防止肿瘤进展。根据肿瘤生长曲线，注射抗ror1-g3-car-t细胞组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，而pbmc组肿瘤生长正常。[0358]实施例14：从健康的人外周血中分离富集双阴性t细胞[0359]14.1从外周血中分离dnt细胞[0360]用2支含柠檬酸钠的一次性真空管采集20-50ml外周血，使用rosetteseptm human cd8 depletion kit(stemcell，货号：15663)和rosetteseptm human cd4 depletion kit(stemcell，货号：15662)进行dnt细胞分离。分离过程简述如下：首先，在新鲜采集的血样中加入50μl/ml抗人cd4和cd8耗尽混合物(depletion cocktail)，于室温孵育20分钟，然后在血样中加入等体积的生理食盐水；接着，将血样加入含有15ml密度梯度离心ficoll-paque-plus(ge，货号：17-1440-02)的50ml sepmatetm-50管(stemcell，货号：104950)中，sepmatetm-50管以1200g离心15分钟，在聚蔗糖和血浆界面收集不含cd4和cd8阳性t细胞的pbmc；最后，将回收的pbmc用0.87％生理食盐水于150g离心10分钟，并冲洗3次。[0361]14.2从外周血中富集dnt细胞[0362]使用human pan t cell isolation kit(miltenyi，货号：130-096-535)，从14.1中获得的不含cd4和cd8阳性t细胞的pbmc中富集dnt细胞。富集步骤如下：首先，将pbmc以1×107/40μl的密度洗涤并悬浮在预冷的pbs中，接着，加入10μl/1×107个细胞的pan t cell biotin-antibody cocktail于4℃孵育5分钟，然后加入30μl pbs和20μl pan t cell microbead cocktail于4℃孵育10分钟；将上述细胞加入ls柱(miltenyi，货号：130-042-401)中，并透过磁力架分离细胞；最后，将得到的dnt细胞用pbs冲洗3次。使用流式细胞术检测cd3+(bd，货号：552852)、cd4-(bd，货号：555347)和cd8-(bd，货号：555369)细胞亚群的比例，结果如图19所示。[0363]分离富集后约35％的细胞为dnt细胞，dnt细胞纯度较高，可用于抗ror1-g3-car慢病毒感染。[0364]实施例15：抗ror1-g3-car慢病毒感染dnt细胞[0365]将dnt细胞以1.5×106/ml重悬并接种于6孔板中，每孔含有2ml培养基，细胞用5μg/ml cd3(miltenyi，货号：170-076-116)和0.5μg/ml cd28(miltenyi，货号：170-076-116)可溶性抗体和15μg/ml retronectin(takara，货号：t100a)活化，第二天将moi为5和15的抗ror1-g3-car慢病毒加入每个孔中，两天后，回收细胞并以1.5×106/ml重悬，四天后用于facs和共培养实验。[0366]实施例16：通过facs评估抗ror1-g3-car-dnt细胞的效率和表型[0367]构建以自剪切多肽2a分隔，同时表达抗ror1-car和绿色荧光蛋白的慢病毒载体，以检查抗ror1-g3-car的表达功效。通过流式细胞荧光分选技术(facs)检测绿荧光蛋白来确认抗ror1-g3-car的表达效率。感染效率检测及表型分析如下：首先，取1×106个细胞用前述慢病毒感染，用洗涤缓冲液冲洗两次，接着加入15μl apc抗人cd8抗体(bd，货号：555369)、15μl pe抗人cd4抗体(bd，货号：555347)、15μl percy5.5抗人cd3抗体(bd，货号：552852)，于4℃避光孵育30分钟；第二步，将样品在室温下以1000rpm离心5分钟，然后去除上清液；第三步，加入facs缓冲液冲洗两次，然后在室温下以1000rpm离心5分钟；最后，将细胞用150μl facs缓冲液悬浮，通过facs检测荧光，结果如图20所示。[0368]dnt细胞的感染效率在moi为5时约为43％，在moi为15时为55％，抗ror1-g3-car-dnt细胞均为cd4和cd8阴性t细胞。[0369]实施例17：抗ror1-g3-car-dnt细胞体外增殖评估[0370]为了确认体外抗ror1-g3-cart细胞增殖的能力，在感染慢病毒后第3天收集dnt细胞并在texmacs(miltenyi，货号：170-076-309)+10％fbs+200iu/ml il-2(miltenyi，货号：130-097-748)+5ng/ml il-4(proptech，货号：200-07-10)+10ng/ml il-7(proptech，货号：200-04-5)+10ng/ml il-15(proptech，货号：200-15-10)+100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素中培养4天。[0371]在第7天收集抗ror1-g3-car-dnt细胞，用pbs冲洗1-2次，并在含有100ng/ml cd3的完全培养基(miltenyi，货号：170-076-116)中培养，之后每3至4天更换一次含有100ng/ml cd3(miltenyi，货号：170-076-116)的完全培养基，持续培养21天。在培养过程中，每3至4天记录一次抗ror1-g3-car-dnt细胞的数量。[0372]抗ror1-g3-car-dnt细胞的数量如图22所示。培养第18天，抗ror1-g3-car-dnt细胞可扩增500倍以上，然而在第18天后，抗ror1-g3-car-dnt细胞的数量逐渐减少，这可能是由于抗ror1-g3-car-dnt细胞体外培养时间过长，导致细胞凋亡。[0373]实施例18：抗ror1-g3-car-dnt细胞的细胞因子释放测定[0374]通过使用人th1/th2细胞因子cba试剂盒(bd，货号：550749)评估抗ror1-g3-car-dnt细胞对ror1过表达u87mg细胞的生物学活性。将抗ror1-g3-car-dnt细胞或pbmc与ror1过表达u87mg细胞系共培养24小时，试验具体步骤如下：首先，回收靶细胞(ror1过表达u87mg细胞)和非靶细胞(u87mg)并用洗涤缓冲液冲洗两次，以含有2％fbs的rpmi1640悬浮细胞并稀释至1×106个细胞/ml的浓度，然后回收抗ror1-g3-car-dnt细胞和pbmc细胞(效应细胞)并稀释至1×106个细胞/ml的浓度，将100μl靶细胞(ror1过表达u87mg细胞)和非靶细胞(u87mg)与100μl抗ror1-g3-car-dnt细胞或pbmc按1:1混合至96孔板中，于37℃共培养20-24小时；第二步，回收100μl培养液，以1000rpm离心5分钟，取上清液用于细胞因子释放检测；第三步，取出细胞因子捕获珠并充分混匀，将50μl混匀的珠子和50μl pe检测试剂加入每个上清液样品(50μl)中，充分混匀并于室温避光孵育3小时，然后将洗涤缓冲液加入每个样品中，并以200g离心5分钟，去除上清液后在每个样品中加入300μl洗涤缓冲液以悬浮珠子；最后，透过流式细胞术分析样品。[0375]结果如图13所示，抗ror1-g3-car-dnt细胞仅在靶细胞(ror1过表达u87mg细胞)细胞系存在时才释放il-2、tnfα、ifnγ。意即抗ror1-g3-car-dnt细胞仅在与ror1阳性靶细胞(ror1过表达u87mg细胞)共培养时才产生细胞因子，而与ror1阴性细胞(u87mg)共培养时不产生细胞因子，证明car-t细胞具有特异性杀伤ror1阳性肿瘤细胞系的能力，但对正常细胞没有杀伤作用。[0376]实施例19：抗ror1-g3-car-dnt细胞的细胞裂解能力测试[0377]u87mg和ror1过表达u87mg细胞以1×105个细胞/孔的浓度接种在24孔板中，将等量的抗ror1-g3-car-dnt细胞添加到培养基中，不添加外源细胞因子。培养24小时后以facs测量残留的肿瘤细胞和抗ror1-g3-car-dnt细胞，通过cd3和gfp的表达识别抗ror1-g3-car-dnt细胞，肿瘤细胞则通过b7h3的表达识别。[0378]结果如图24所示，抗ror1-g3-car-dnt细胞对ror1过表达u87mg细胞产生显着的细胞毒性，但对u87mg细胞没有细胞毒性，证明car-t细胞具有特异性杀伤ror1阳性肿瘤细胞系的能力，同时对正常细胞没有杀伤作用。[0379]本发明提及的所有文献皆以同等内容引用至本技术文件作为参考。此外还应理解，本领域技术人员在阅读本发明的内容之后，可以对本发明进行各种修改或调整，这些等同方式也会一并落于本技术权利要求书所限定的范围内。









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