高存活率酿酒酵母及其应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及工业微生物发酵工程技术领域，具体涉及高存活率酿酒酵母及其应用。背景技术：2.燃料乙醇作为新型燃料替代品和汽油添加剂，具有可再生性、增氧助燃、无毒环保等优点，越来越受到各国政府和能源巨头的关注，并替代汽油、煤炭、石油气等传统燃料广泛应用于餐饮、车用等燃料行业。3.工业酿酒酵母是经过长时间选育而获得酵母菌株，利用淀粉原料生产乙醇，具有繁殖快、产酒率高、耐受恶劣环境能力强等优点。但是乙醇生产企业多采用连续发酵方法，发酵时间较长(超过96h)，发酵后期乙醇、乙酸含量高，对酵母菌的生存严重威胁，使得酵母细胞大量死亡，导致残糖含量提高，减少乙醇产量，造成原料浪费。因此选育能够耐受乙醇工厂恶劣环境的高存活率的工业酿酒酵母，可以更好的为乙醇企业服务，降低生产成本，以带来可观的经济、社会和环境效益。4.酿酒酵母处于恶劣环境时，细胞死亡率增多，其耐受能力属于复杂性状。当细胞处于胁迫环境下，大量基因的表达量发生改变以使细胞适应新的环境。专利申请公开号为cn104450598a的发明公开了一种酿酒酵母的驯化方法，将所述活化后的酿酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行培养，得到小酒母；将所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行8-12小时的扩大培养，得到大酒母，在以后的每一代大酒母的扩大培养中，逐步提高酶解糖液的浓度。驯化得到的酵母菌株乙醇产率得到提高，但是由于驯化培养时间较短(8-12小时)，产生的乙醇浓度小于工业乙醇生产浓度，无法提高菌株后期耐受高乙醇、乙酸的能力，细胞存活率得不到提高。专利申请公开号为cn109486693a的发明公开了一种酿酒酵母zlnj-1菌株通过定向筛选方法(耐受多种发酵抑制物、耐高温且耐高浓度乙醇)。一级筛选是用玉米糖化醪培养菌株，乙醇浓度到达13％(v/v)后，用新鲜的玉米糖化醪置换75％的发酵液，随后以24小时的间隔进行相同的新鲜玉米糖化醪置换，持续发酵1个月，筛选优异菌株进行二级筛选，按照一级筛选方法将置换比例改为60％的发酵液进行发酵，持续时间1个月，筛选优异菌株进行三级筛选，以33℃起始温度并每隔20天提高1℃，其它方法步骤与二级筛选相同维持2个月，筛选出优异酿酒酵母zlnj-1。经实验证实，该酿酒酵母zlnj-1菌株在28℃-35℃的条件下能够在乙醇发酵中实现发酵速率快、乙醇浓度高、并且副产物少的优异效果。但是该菌株每次传代时间间隔(24小时)较短，无法提高发酵后期酵母细胞存活率。技术实现要素：5.本发明所要解决的技术问题是如何获得能够耐受多种环境胁迫的酿酒酵母和/或如何获得耐乙醇、乙酸的酿酒酵母和/或如何获得耐高温的酿酒酵母和/或如何获得具有高存活率的酿酒酵母和/或如何获得适用于生产乙醇的酿酒酵母。6.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了酿酒酵母菌。所述酿酒酵母菌可含有下述8种蛋白质：7.a、酵母孢子壁蛋白，所述酵母孢子壁蛋白由酵母孢子壁蛋白基因编码，所述酵母孢子壁蛋白基因的编码序列可为序列表中序列4所示。8.所述酵母孢子壁蛋白的氨基酸序列可由724个氨基酸残基组成；9.b、蛋白磷酸酶靶向亚基蛋白，所述蛋白磷酸酶靶向亚基蛋白由蛋白磷酸酶靶向亚基蛋白基因编码，所述蛋白磷酸酶靶向亚基蛋白基因的编码序列可为序列表中序列6所示。10.所述酵母孢子壁蛋白的氨基酸序列可由538个氨基酸残基组成。11.c、天冬氨酸转氨酶，所述天冬氨酸转氨酶由天冬氨酸转氨酶基因编码，所述天冬氨酸转氨酶基因的编码序列可为序列表中序列8所示。12.所述天冬氨酸转氨酶的氨基酸序列可由451个氨基酸残基组成。13.d、3-葡糖基转移酶，所述3-葡糖基转移酶由3-葡糖基转移酶基因编码，所述3-葡糖基转移酶基因的编码序列可为序列表中序列10所示。14.所述3-葡糖基转移酶的氨基酸序列可由1198个氨基酸残基组成。15.e、参与细胞分裂周期蛋白，所述参与细胞分裂周期蛋白由参与细胞分裂周期蛋白基因编码，所述参与细胞分裂周期蛋白基因的编码序列可为序列表中序列12所示。16.所述参与细胞分裂周期蛋白的氨基酸序列可由520个氨基酸残基组成。17.f、转录调节因子，所述转录调节因子由转录调节因子基因编码，所述转录调节因子基因的编码序列可为序列表中序列14所示。18.所述转录调节因子的氨基酸序列可由811个氨基酸残基组成。19.g、硫胺跨膜转运蛋白，所述硫胺跨膜转运蛋白由硫胺跨膜转运蛋白基因编码，所述硫胺跨膜转运蛋白基因的编码序列可为序列表中序列16所示。20.所述硫胺跨膜转运蛋白的氨基酸序列可由598个氨基酸残基组成。21.h、镁离子跨膜转运蛋白，所述镁离子跨膜转运蛋白由镁离子跨膜转运蛋白基因编码，所述镁离子跨膜转运蛋白基因的编码序列可为序列表中序列18所示。22.所述镁离子跨膜转运蛋白的氨基酸序列可由969个氨基酸残基组成。23.i、磷脂酰肌醇激酶，所述磷脂酰肌醇激酶由磷脂酰肌醇激酶基因编码，所述磷脂酰肌醇激酶基因的编码序列可为序列表中序列20所示。24.所述磷脂酰肌醇激酶的氨基酸序列可由875个氨基酸残基组成。25.上述酿酒酵母菌可含有所述酵母孢子壁蛋白基因、所述蛋白磷酸酶靶向亚基蛋白基因、所述天冬氨酸转氨酶基因、所述3-葡糖基转移酶基因、所述参与细胞分裂周期蛋白基因、所述转录调节因子基因、所述硫胺跨膜转运蛋白基因、所述镁离子跨膜转运蛋白基因和所述磷脂酰肌醇激酶基因。26.上述酿酒酵母菌可为酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)，其菌株号为tib scy03，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.17925。27.为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述酿酒酵母菌或由其传代而产生的酿酒酵母菌的培养物。所述培养物可为将上述酿酒酵母菌或由其传代而产生的酿酒酵母菌在微生物培养基中培养得到的物质。28.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种菌剂。所述菌剂含有上述酿酒酵母菌或/和上述的酿酒酵母菌的代谢物或/和上述的培养物。29.上述菌剂可具有下述至少一种特性：30.k1)耐高温；31.k2)耐高浓度糖化醪或耐高浓度乙醇或耐环境胁迫或耐高渗环境；32.k3)高细胞存活率。33.所述高浓度糖化醪可为35％(即35g/100ml)的糖化醪。所述糖化醪可为玉米糖化醪、水稻糖化醪和/或木薯糖化醪。所述高浓度乙醇可为乙醇含量为143g/l的乙醇溶液。所述高温可为40℃。所述高细胞存活率可为92％细胞存活率。34.为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述酿酒酵母菌的下述至少一种应用：35.l1)在制备乙醇中的应用；36.l2)在制备生产乙醇的产品中的应用；37.l3)提高制备乙醇过程中原料利用率中的应用；38.l4)提高制备乙醇过程中乙醇产量中的应用。39.为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述菌剂的下述至少一种应用：40.m1)在制备乙醇中的应用；41.m2)在制备生产乙醇的产品中的应用；42.m3)提高制备乙醇过程中原料利用率中的应用；43.m4)提高制备乙醇过程中乙醇产量中的应用。44.为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备上述菌剂的方法，包括将上述酿酒酵母菌在微生物培养基中培养的步骤。45.上述方法中，所述微生物培养基可为ypd培养基。46.上文所述酿酒酵母菌的培养物是将上述酿酒酵母菌在微生物培养基中培养得到的物质(如含有上述酿酒酵母菌和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有上述酿酒酵母菌和分泌到固体培养基内的物质)。47.上述菌剂的活性成分可为上述酿酒酵母菌或/和上述酿酒酵母菌的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。48.所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，上述酿酒酵母菌或/和上述酿酒酵母菌的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。49.根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。50.上述酿酒酵母菌代谢物可为上述酿酒酵母菌的发酵液。上述酿酒酵母菌的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养上述酿酒酵母菌，收集发酵液(含有上述酿酒酵母菌和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为上述酿酒酵母菌的代谢物。51.为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备乙醇的方法。所述方法可包括使用上述述的酿酒酵母菌和/或上述菌剂以淀粉质原料进行分步糖化发酵工艺得到乙醇的步骤。52.所述淀粉质原料可为玉米粉、水稻粉、木薯淀粉等。53.所述分步糖化发酵工艺过程可包括：1)拌料；2)预液化；3)液化；4)糖化；5)发酵。54.本发明针对现在乙醇生产工艺中，发酵后期酿酒酵母高细胞死亡率问题，提供了一种高存活率的酿酒酵母，且在高温(40℃)环境中仍保持较高存活率，使得乙醇产量获得提高。通过对比实验验证，与商业乙醇酿酒酵母菌株相比，细胞存活率较高，残留糖较少，乙醇产量高。在高浓醪(35％以上)条件下，乙醇浓度高于143g/l。高存活率酿酒酵母tib scy03在高温条件下发酵生产乙醇，降低了原料的浪费，提高乙醇产量，降低了乙醇生产成本，增强企业竞争力。55.保藏说明56.菌种名称：酿酒酵母57.拉丁名：saccharomyces cerevisiae58.菌株编号：tib scy0359.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心60.保藏机构简称：cgmcc61.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号62.保藏日期：2019年06月13日63.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.17925附图说明64.图1为基于its序列构建的酿酒酵母菌株tib scy02和tib scy03的系统发育树。具体实施方式65.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。66.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。67.本发明实施例中培养基的配制方法如下：68.ypd培养基的ph为5.5，组成为：葡萄糖2g/100ml，蛋白胨2g/100ml，酵母粉1g/100ml，其余为水。其配制方法为(100ml)：葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母粉1g，用水定容至100ml，调节ph至5.5，121℃灭菌15min。69.ypd发酵培养基的ph为5.5，组成为：葡萄糖30g/100ml，蛋白胨2g/100ml，酵母粉1g/100ml，其余为水。其配制方法为(100ml)：葡萄糖30g，蛋白胨2g，酵母粉1g，用水定容至100ml，调节ph至5.5，121℃灭菌15min。70.本发明实施例中商业乙醇酿酒酵母a(简称：商业a)为广西中粮生物质能源有限公司产品。商业乙醇酿酒酵母b(简称：商业b)为广西中粮生物质能源有限公司产品。71.实施例1、酿酒酵母tib scy03的获得72.本实施例中以酿酒酵母工业菌株tib scy02为出发菌株，以玉米粉为原料进行适应性传代培养制备酿酒酵母tib scy03：73.将出发酵母菌株tib scy02接种于装有30ml种子培养基(ypd培养基)的100ml摇瓶中，30℃、250r/min的条件下培养24h，转接到含80ml玉米糖化醪培养基的100ml蓝盖瓶中，接种量为od600nm＝80，在40℃、200r/min条件下发酵48小时，然后用40ml新鲜的玉米糖化醪置换发酵醪液(此时混合液中含有4-5％的乙醇)，在40℃、200r/min条件下继续发酵48h，重新利用新鲜的玉米糖化醪置换发酵醪液，用相同方法传代培养。经过8个月培养，获得细胞存活率提高(平均10％-20％)且耐受高温(40℃)、高浓度糖化醪(35％，即35g/100ml)、高酒精的(乙醇含量为143g/l的乙醇水溶液)酿酒酵母菌株tib scy03(下文简称酵母菌株tib scy03)，将其保存。74.将酵母菌株tib scy02和酵母菌株tib scy03接种到30ml ypd培养基的100ml摇瓶中，于30℃，180rpm摇床培养24h，收集菌体，提取总dna，然后以其为模板，采用下述真核生物its基因序列的通用引物按常规的方法进行its基因序列的pcr扩增得到pcr扩增产物：75.fp1:5'-agtaaaagtcgtaacaaggt-3’和fp2:5’‑ttcactcgccgttactaggg-3’。76.pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由北京擎科生物科技有限公司测序。测序结果表明酵母菌株tib scy02和酵母菌株tib scy03的its基因序列分别如序列表中序列1和序列2所示。将序列1和序列2与genbank数据库中的序列进行比对，并利用mega7.0软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树，结果如图1所示：酵母菌株tib scy02和酵母菌株tib scy03为酿酒酵母saccharomyces cerevisiae。77.酵母菌株tib scy03于2019年06月24日将其藏保于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.17925。78.获得的酵母菌株tib scy03过程中所用的培养基为30％浓度的玉米糖化醪，制备过程如下(100ml)：79.玉米糖化醪的底物(玉米粉)浓度为30％(30g/100ml)，玉米粉含水量是12％。80.1、调浆：称取玉米粉(广西中粮生物质能源有限公司)34.1g，去离子水定容至100ml，调浆后，在65℃水浴锅中搅匀维持20分钟；81.2、液化：用硫酸调节ph值至5.4-5.6；添加α-淀粉酶(macklin/麦克林，货号：a800731-100g)0.004g(0.12kg/吨玉米粉)，63℃-65℃维持25分钟；升温至90℃，二次添加淀粉酶0.004g(0.12kg/吨玉米粉)，维持130分钟；82.3、糖化：降温至58℃-60℃，硫酸调节ph值至3.8-4.2；添加糖化酶(solarbio/索莱宝，货号：t8501-500g)0.03g(0.88kg/吨玉米)，维持1小时后添加尿素0.05g(1.5kg/吨玉米粉)，获得浓度为30％的玉米糖化醪。83.实施例2酵母菌株tib scy03发酵葡萄糖测试84.将酵母菌株tib scy03、tib scy02分别接种于装有20ml ypd培养基中100ml摇瓶中，30℃、200r/min下培养24小时，得到种子液(od600nm＝10)。将10ml种子液接种于装有200ml ypd发酵培养基的500ml摇瓶中，在30℃或40℃、200r/min条件下发酵48小时，利用美兰染色-细胞计数法测定酵母细胞存活率，hplc检测发酵液中乙醇含量，以乙醇(生工生物工程(上海)股份有限公司，产品目录号a500737-0500)为标准品根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析乙醇。实验重复三次，每次重复每种菌株每种培养温度设置3个500ml摇瓶。85.采用spss11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用one-way anova检验，p＜0.05表示与酵母菌株tib scy02相比具有显著性差异。具体实验结果如表1所示。86.细胞计数法测定细胞存活率：87.1、美兰试剂配制：2％二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液：次甲基蓝0.01g，二水合柠檬酸三钠2g，用蒸馏水定容至100ml，备用。88.2、将酵母菌液稀释100倍，取0.5ml美兰染色液与0.5ml酵母菌液混合，染色3-5分钟，用血球计数板计数。89.3、将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上加盖专用的盖玻片，将混合后的菌液用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余菌液用吸水纸吸取，静止5分钟，是酵母菌全部沉降到血球计数室内。90.4、计数时，使用规格为25格×16格的计数板，选取其4个对角方位和中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌。91.5、每个样品计数三次，取其平均值，按照公式计数1ml菌液中的酵母菌个数和活细胞率。92.细胞总数/ml＝80小格内细胞个数/80×400×104×20093.死细胞数/ml＝80小格内蓝色细胞个数/80×400×104×20094.酵母细胞存活率％＝(酵母细胞总数-酵母死细胞数)/酵母细胞总数×10095.hplc检测方法：96.检测柱：rezex rfq-fast acid h+(0.8％)，lc column(100×7.8mm)97.检测条件：0.5mm硫酸、0.6ml/min，柱温55℃，示差检测器，温度35℃，时间为10min。98.表1.酵母菌株tib scy03发酵葡萄糖测试实验结果[0099][0100]从表1中可以看出，酵母菌株tib scy03在30℃和40℃条件下，细胞存活率均高于tib scy02，乙醇产量和乙醇得率相对较高。tib scy03在30℃和40℃条件下细胞存活率分别为98.4±0.6％和92.2±0.4％，与tib scy02相比分别提高了5.4和7.1％(p《0.05)，乙醇产量分别提高了1.0和13.2g/l(p《0.01)。[0101]实施例3酵母菌株tib scy03发酵高浓玉米糖化醪测试[0102]将酵母菌tib scy03、tib scy02分别接种于盛有20ml种子培养基(ypd培养基)的100ml摇瓶中进行培养(培养条件同实施例2)，得到种子液(od600nm＝10)。将10ml种子液接种于装有200ml 35％浓度玉米糖化醪的500ml摇瓶中，30℃或40℃、200r/min条件下发酵72小时，利用美兰染色-细胞计数法和hplc检测方法同实施例2。[0103]35％浓度的玉米糖化醪的制备过程如下(100ml)：[0104]玉米糖化醪的底物(玉米粉)浓度为35％(35g/100ml)，玉米粉含水量是12％。[0105]1、调浆：称取玉米粉(广西中粮生物质能源有限公司)39.7g，去离子水定容至100ml，调浆后，在65℃水浴锅中搅匀维持20分钟；[0106]2、液化：用硫酸调节ph值至5.4-5.6；添加α-淀粉酶(macklin/麦克林，货号：a800731-100g)0.004g(0.12kg/吨玉米粉)，63℃-65℃维持25分钟；升温至90℃，二次添加淀粉酶0.004g(0.12kg/吨玉米粉)，维持130分钟；[0107]3、糖化：降温至58℃-60℃，硫酸调节ph值至3.8-4.2；添加糖化酶(solarbio/索莱宝，货号：t8501-500g)0.03g(0.88kg/吨玉米)，维持1小时后添加尿素0.05g(1.5kg/吨玉米粉)，获得浓度为35％的玉米糖化醪。[0108]实验结果如表2所示，酵母菌株tib scy03的细胞存活率、乙醇产量均高于tib scy02。在30℃和40℃条件下，与tib scy02相比，酵母菌株tib scy03的细胞存活率分别提高了2.7和10.7％(p《0.01)，乙醇产量分别提高了5.2和6.9g/l(p《0.05)，葡萄糖残留量也减少一半。[0109]表2.酵母菌株tib scy03发酵玉米糖化醪测试实验结果[0110][0111]实施例4酵母菌株tib scy03与商业乙醇酿酒酵母a发酵水稻糖化醪测试[0112]将酵母菌株tib scy03、商业a分别接种于盛有20ml种子培养基(ypd培养基)的100ml摇瓶中进行培养(培养条件同实施例2)，得到种子液(od600nm＝10)。将10ml种子液接种于装有200ml 35％浓度水稻糖化醪的500ml摇瓶中(35％浓度水稻糖化醪的制备方法同实施例3，将玉米粉改用水稻粉，其余配制方法不变，水稻粉为广西中粮生物质能源有限公司产品)，30℃或40℃、200r/min条件下发酵72小时，利用美兰染色-细胞计数法和hplc检测方法同实施例2。[0113]具体实验结果如表3所示，与商业a相比，酵母菌株tib scy03的细胞存活率、乙醇产量均较高。在30℃和40℃条件下，与商业a相比，酵母菌株tib scy03的细胞存活率分别提高了19和25％(p《0.01)，乙醇产量均提高了6g/l(p《0.05)。[0114]表3.酵母菌株tib scy03发酵水稻糖化醪测试实验结果[0115][0116]实施例5酵母菌株tib scy03与商业乙醇酿酒酵母b发酵木薯糖化醪测试[0117]将酵母菌株tib scy03、商业b分别接种于盛有20ml种子培养基(ypd培养基)的100ml摇瓶中进行培养(培养条件同实施例2)，得到种子液(od600nm＝10)。将10ml种子液接种于装有200ml 35％浓度木薯糖化醪的500ml摇瓶中(35％浓度木薯糖化醪的制备方法同实施例3，将玉米粉改为木薯粉，其余配制方法不变，木薯粉为广西中粮生物质能源有限公司产品)，30℃/40℃、200r/min条件下发酵72小时，利用美兰染色-细胞计数法和hplc检测方法同实施例2。[0118]具体实验结果如表4所示，与商业b相比，酵母菌株tib scy03的细胞存活率、乙醇产量均较高。在30℃和40℃条件下，与商业b相比，酵母菌株tib scy03的细胞存活率分别提高了22.7和20.5％(p《0.01)，乙醇产量提高了5.5和6.7g/l(p《0.05)。[0119]表4.酵母菌株tib scy03发酵水稻糖化醪测试实验结果[0120][0121]实施例6酵母菌株tib scy03遗传变异[0122]通过对酵母菌株tib scy03进行全基因组重测序，利用比较基因组学分析手段，挖掘与出发菌株tib scy02相比，酵母菌株tib scy03中积累了非同义突变，其结果如表5所示。[0123]菌株tib scy03的基因组dna和测序文库由诺禾致源(中国北京)公司提取和构建，采用illumina hiseqxten-pe15高通量测序平台的150bp双端测序的方法测序。以酿酒酵母菌株s288c为参考基因组(refseq assembly accession:gcf_000146045.2)，获得16.3百万clean reads，测序深度为147x和97.8％的测序覆盖率。菌株tib scy02的基因组dna和测序文库由华大基因(中国北京)公司提取和构建，采用illumina hiseq 4000高通量测序平台的150bp双端测序的方法测序。以酿酒酵母菌株s288c为参考基因组(refseq assembly accession:gcf_000146045.2)，获得16.3百万clean reads，测序深度为147x和97.8％的测序覆盖率。[0124]表5.酵母菌株tib scy03中积累的非同义突变gene[0125][0126]注：wt：野生型；mt：突变；homo：纯合；het：杂合。sift score越小，说明该突变对蛋白结构和功能的影响越大。[0127]采用depristo等人报道的基因组分析流程，检测菌株中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)突变和插入/缺失(insertion/deletion，indels)突变(相关文献：depristo ma,banks e,poplin r,et al.a framework for variation discovery and genotyping using next-generation dna sequencing data.nat genet.2011；43(5):491-8.)。然后，对发生在蛋白编码区的非同义突变利用sift进行突变对蛋白功能影响的预测分析(相关文献：wagih o,galardini m,busby bp,memon d,typas a,beltrao p.a resource of variant effect predictions of single nucleotide variants in model organisms.mol syst biol.2018.14(12):e8430.)。[0128]使用上述方法，通过基因组测序分析筛选出非同义突变，以酵母菌株tib scy02和酵母菌株tib scy03的基因组dna为模板，进行pcr扩增突变dna片段，并行测序验证，结果如表5所示。与酵母菌株tib scy02相比，在酵母菌株tib scy03中发现2个纯合突变，osw2n361i和pig2d430v，以及8个杂合突变(即含有突变的等位基因)。[0129]其中两个纯合突变所在基因中，酵母孢子壁蛋白(osw2p)是酿酒酵母孢子壁内层葡聚糖层和甘露糖层正确组装所必需的，酵母菌株tib scy02中野生型osw2p基因的核苷酸序列为序列表中序列3所示，酵母菌株tib scy03中突变型osw2p基因的核苷酸序列为序列表中序列4所示；磷酸酶靶向亚基蛋白(pig2p)是i型蛋白磷酸酶靶向亚基，将glc7p-1型蛋白磷酸酶与gsy2p糖原合酶结合，酵母菌株tib scy02中野生型pig2p基因的核苷酸序列为序列表中序列5所示，酵母菌株tib scy03中突变型pig2p基因的核苷酸序列为序列表中序列6所示。[0130]其他杂合突变所影响的酿酒酵母的生理功能包括：l-天冬氨酸分解代谢(天冬氨酸转氨酶aat1p)、参与甾醇3-葡糖基转移酶的活性(3-葡糖基转移酶atg26p)、参与细胞分裂周期(参与细胞分裂周期蛋白cdc3p)、转录调节因子(转录调节因子rfx1p)、硫胺跨膜转运蛋白(thi7p)、镁离子跨膜转运蛋白(mnr2p)、磷脂酰肌醇激酶(vps34p)。其中酵母菌株tib scy02中野生型天冬氨酸转氨酶(aat1p)的核苷酸序列为序列表中序列7所示，酵母菌株tib scy03中含有的突变型aat1p基因的核苷酸序列为序列表中序列8所示；酵母菌株tib scy02中野生型atg26p基因的核苷酸序列为序列表中序列9所示，酵母菌株tib scy03中含有的突变型atg26p基因的核苷酸序列为序列表中序列10所示；酵母菌株tib scy02中野生型cdc3p基因的核苷酸序列为序列表中序列11所示，酵母菌株tib scy03中含有的突变型cdc3p基因的核苷酸序列为序列表中12所示；酵母菌株tib scy02中野生型rfx1p基因的核苷酸序列为序列表中序列13所示，酵母菌株tib scy03中含有的突变型rfx1p基因的核苷酸序列为序列表中序列14所示；酵母菌株tib scy02中野生型thi7p基因的核苷酸序列为序列表中序列15所示，酵母菌株tib scy03中含有的突变型thi7p基因的核苷酸序列为序列表中序列16所示；酵母菌株tib scy02中野生型mnr2p基因的核苷酸序列为序列表中序列17所示，酵母菌株tib scy03中含有的突变型mnr2p基因的核苷酸序列为序列表中序列18所示；酵母菌株tib scy02中野生型vps34p基因的核苷酸序列为序列表中序列19所示，酵母菌株tib scy03中含有的突变型vps34p基因的核苷酸序列为序列表中序列20所示。[0131]本发明提供一种工业生产乙醇酿酒酵母，能够在高温、浓醪液环境中依然保持较高细胞存活率，减少原料浪费，提高利用率和乙醇产量，经测算，假如应用的年产百万吨乙醇生产工厂中，将带来非常可观的收益。[0132]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。









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