一种管状结构的三维细胞培养支架的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及生物材料制备领域，尤其是涉及一种管状结构的三维细胞培养支架。背景技术：2.细胞是生物体结构和功能的基本单位。目前，在体外细胞培养中，很大程度上都是在二维培养条件下完成的。然而二维细胞培养技术培养得到的细胞在体外环境下会逐渐丧失其体内原有的性状，在形态、结构和功能等方面与体内自然生长状态下的细胞相去甚远，因此其应用受到大量限制。三维细胞培养技术目前正得到广泛发展，在三维空间结构中培养得到的细胞可以保留天然细胞微环境中的物质结构基础，可以更好地模拟体内细胞的生长和发展过程。然而，不论是在二维还是三维的细胞体外培养中，与周围环境进行通讯的主要方式之一即为细胞黏附，同时细胞黏附也对细胞生长、迁移、增殖、分化、凋亡等生理过程至关重要的影响因素。3.对于三维细胞体外培养，由于体内许多器官的结构都是管状结构，因此在组织工程领域有大量文献报道了管状结构组织工程支架的制备方法，可以模拟体内管状结构器官，特别是血管等的形成过程。中国专利公开号“cn103173353a”公开了一种多层管状结构细胞培养支架及其制备方法和用途，该支架包括位于高分子弹性膜层和与其贴合的高分子固定层，所述高分子弹性膜层的弹性使得所述支架自动卷曲成多层管状结构；可以为提供一种将单种/多种细胞层状分布在多层管状结构细胞培养支架的方法及由该方法制得的单种/多种细胞层状分布的三维管状结构的用途，其用于模拟血管或肠道多种细胞层状分布的人体器官、用于病变或受损器官修复和作为体外研究模型。在管状结构细胞培养的过程中，细胞与培养材料相接触后，首先要先黏附在材料表面，然后才能进行铺展、增殖等行为，因此细胞与材料的黏附性能对细胞培养效果具有重要影响。目前使用的管状结构细胞培养材料对于细胞的黏附能力较差，导致细胞培养效果较差。技术实现要素：4.本发明是为了克服现有管状结构细胞培养装置细胞黏附能力差、细胞培养效果不佳的问题，提供一种管状结构的三维细胞培养支架。通过管状支架实现细胞的三维培养，通过支架表面的修饰涂层增强培养过程中细胞对支架的黏附能力，修饰涂层包括聚多巴胺层、纳米纤维素层及短肽层，通过多种吸附效应增强细胞吸附能力和生长活性。5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种管状结构的三维细胞培养支架，支架包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到多巴胺溶液中，自聚合后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后的纳米纤维素溶解后加入tempo和nabr，反应后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶二甲氨基吡啶。4-二甲氨基吡啶可以催化短肽与氧化纳米纤维素或聚多巴胺层的反应交联，将rgd肽交联到管状结构细胞培养支架的表面。13.作为优选，基底支架材质为玻璃、硅或生物可降解聚合物中的一种。14.作为优选，生物可降解聚合物为聚氨酯、聚乳酸、聚己内酯中的一种或其组合。15.作为优选，基底支架上设有网孔，所述网孔的孔径为50~500μm。通过网孔的设计更有效地模拟细胞外基质环境，并且也可以控制细胞在管状结构细胞培养支架上的位置和数量，更好地进行三维细胞体外培养。16.作为优选，所述基底支架的长度为18~22mm，外径为20~24mm，高度为4~6mm。17.因此，本发明具有如下有益效果：（1）提供了一种管状结构的三维细胞培养支架，细胞可以顺利附着在支架上进行生长，实现细胞的体外三维培养，有效模拟细胞外基质环境；（2）在管状结构细胞培养支架表面通过反应制备修饰涂层，修饰涂层包括聚多巴胺层、氧化纤维素和rgd肽，聚多巴胺层可以实现修饰涂层与基底之间的良好结合、提供可反应基团，氧化纤维素可以提升细胞的焦点粘附，rgd肽可以减少氧化纤维素表面的负电对细胞附着的负面影响，同时通过其与细胞表面整合素的结合增强细胞的附着和增殖能力；（3）可以单独或组合用于体外细胞三维培养和细胞模型构建，特别是体内管状器官的模型构建，研究细胞行为，也可以用于植入式材料和器件的生物表面构建，提升材料的生物相容性。具体实施方式18.下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。应理解，这些实施例适用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的范围限制；实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中采用的条件。19.下述实施例中未作特殊说明，所有原料均来自于商购或通过本领域的常规方法制备而得。20.实施例1一种管状结构的三维细胞培养支架，包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述基底支架的长度为20mm，外径为22mm，高度为5mm，基底支架材质为玻璃，基底支架上还设有网孔，所述网孔的孔径为300μm，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到浓度为1.0mg/ml、ph为8.0的多巴胺溶液中，自聚合25h后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后直径为5~20nm、长度为0.5~1.5μm的纳米纤维素溶解，纳米纤维素的浓度为30mg/ml，然后加入tempo和nabr，纳米纤维素、tempo和nabr的质量比为3:0.5:1.5，在ph6.5条件下反应8h后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，在28℃下充分交联6h后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有rgd肽和催化剂的溶液中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，rgd肽的浓度为2mmol/l，4-二甲氨基吡啶的浓度为4mmol/l，在25℃下充分反应16h后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。21.实施例2一种管状结构的三维细胞培养支架，包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述基底支架的长度为18mm，外径为20mm，高度为4mm，基底支架材质为硅，基底支架上还设有网孔，所述网孔的孔径为500μm，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到浓度为2mg/ml、ph为8.5的多巴胺溶液中，自聚合20h后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后直径为5~20nm、长度为0.5~1.5μm的纳米纤维素溶解，纳米纤维素的浓度为50mg/ml，然后加入tempo和nabr，纳米纤维素、tempo和nabr的质量比为5:1:2，在ph7.0条件下反应6h后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，在25℃下充分交联8h后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有rgd肽和催化剂的溶液中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，rgd肽的浓度为2mmol/l，4-二甲氨基吡啶的浓度为4mmol/l，在20℃下充分反应18h后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。22.实施例3一种管状结构的三维细胞培养支架，包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述基底支架的长度为22mm，外径为24mm，高度为6mm，基底支架材质为聚氨酯，基底支架上还设有网孔，所述网孔的孔径为50μm，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到浓度为0.5mg/ml、ph为7.5的多巴胺溶液中，自聚合30h后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后直径为5~20nm、长度为0.5~1.5μm的纳米纤维素溶解，纳米纤维素的浓度为10mg/ml，然后加入tempo和nabr，纳米纤维素、tempo和nabr的质量比为1:0.1:1，在ph6.0条件下反应10h后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，在30℃下充分交联4h后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有rgd肽和催化剂的溶液中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，rgd肽的浓度为2mmol/l，4-二甲氨基吡啶的浓度为4mmol/l，在30℃下充分反应12h后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。23.实施例4一种管状结构的三维细胞培养支架，包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述基底支架的长度为20mm，外径为22mm，高度为5mm，基底支架材质为质量比为3:1的聚氨酯和聚乳酸，基底支架上还设有网孔，所述网孔的孔径为200μm，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到浓度为1.5mg/ml、ph为8.0的多巴胺溶液中，自聚合25h后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后直径为5~20nm、长度为0.5~1.5μm的纳米纤维素溶解，纳米纤维素的浓度为40mg/ml，然后加入tempo和nabr，纳米纤维素、tempo和nabr的质量比为4:0.8:1.5，在ph7.0条件下反应10h后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，在30℃下充分交联6h后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有rgd肽和催化剂的溶液中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，rgd肽的浓度为1.5mmol/l，4-二甲氨基吡啶的浓度为3mmol/l，在25℃下充分反应16h后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。24.实施例5一种管状结构的三维细胞培养支架，包括基底支架和修饰涂层，所述基底支架为管状，所述基底支架的长度为20mm，外径为22mm，高度为5mm，基底支架材质为聚己内酯，基底支架上还设有网孔，所述网孔的孔径为100μm，所述修饰涂层的制备方法包括如下步骤：（1）聚多巴胺表面修饰：将基底支架浸没到浓度为1.0mg/ml、ph为7.5的多巴胺溶液中，自聚合20h后清洗、干燥，得到聚多巴胺表面修饰的基底支架；（2）氧化纳米纤维素交联：将纯化后直径为5~20nm、长度为0.5~1.5μm的纳米纤维素溶解，纳米纤维素的浓度为25mg/ml，然后加入tempo和nabr，纳米纤维素、tempo和nabr的质量比为2:0.4:1.2，在ph6.0条件下反应7h后得到氧化纳米纤维素溶液，再将聚多巴胺表面修饰的基底支架浸没到氧化纳米纤维素溶液中，在25℃下充分交联8h后清洗、干燥，得到氧化纳米纤维素交联的基底支架；（3）短肽修饰：将氧化纳米纤维素交联的基底支架加入含有rgd肽和催化剂的溶液中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，rgd肽的浓度为3mmol/l，4-二甲氨基吡啶的浓度为4mmol/l，在20℃下充分反应18h后清洗、干燥，得到增强细胞黏附能力的管状结构细胞培养支架。25.对比例1本对比例与实施例1的区别在于，不进行修饰涂层的制备。26.对比例2本对比例与实施例1的区别在于，在修饰涂层的制备过程中不进行聚多巴胺层的制备。27.对比例3本对比例与实施例1的区别在于，在修饰涂层的制备过程中不进行氧化纳米纤维素层的制备。28.对比例4本对比例与实施例1的区别在于，在修饰涂层的制备过程中不进行短肽修饰。29.将制备得到的管状结构细胞培养支架用于人微血管内皮细胞株(hmec-1)的三维细胞培养过程中，具体方法如下：取传代周期在第2代和第6代之间的hmec-1细胞，首先在无血清的deme培养基（含10% fbs，2mm l-谷氨酰胺，1mm丙酮酸钠，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素）中培养24h。将管状结构细胞培养支架放入培养皿中，然后加入融化的基质胶，使基质胶充分贴合管状结构细胞培养支架，在10℃冰箱中预冷后加入无血清培养24h后的hmec-1细胞制成的细胞悬液，放入培养箱中继续培养48~72h。30.由于在管状结构细胞培养支架表面进行了修饰涂层的制备，增强了其对细胞的黏附效果，因此使用实施例1~5制备得到的管状结构细胞培养支架可以在三维细胞培养过程中使得hmec-1细胞顺利贴壁到支架表面，在后续培养过程中形成血管内皮细胞管状结构。对比例1的支架没有修饰涂层，因此细胞在其上的黏附能力不足，无法进行三维细胞培养，细胞只能在培养皿表面和支架与培养皿的接触部分贴壁生长，无法形成类似血管的结构。对比例2的支架没有进行聚多巴胺层的制备，导致后续的修饰涂层无法与基底支架形成良好的结合，使得细胞无法顺利在支架表面形成良好的管状结构。对比例3制备得到的支架由于缺少氧化纳米纤维素层，一方面短肽修饰的过程中与支架表面的结合不足，另一方面由于缺少了氧化纳米纤维素提供的焦点粘附效应，从而导致细胞的贴壁与生长效果不佳。对比例4制备得到的支架未进行短肽修饰，可能由于氧化纳米纤维素表面负电荷过多降低了细胞的黏附效果，导致细胞在支架上部贴壁效果较差，同时由于失去了短肽对细胞生长的促进作用，形成的细胞层的生长也较为缓慢。









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