一种褐色脂肪组织和白色脂肪组织生物标志物及其应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种褐色脂肪组织和白色脂肪组织生物标志物及其应用。背景技术：2.肥胖与许多代谢疾病有关，如2型糖尿病、动脉粥样硬化、心血管疾病、高血压、脂肪肝和一些癌症。为了提高生活质量，减轻医疗不适和经济负担，需要有效的方法来预防和战胜肥胖，以实现人类的健康和可持续发展。3.近年来，褐色脂肪组织(brown adipose tissue，bat)的激活和/或米色脂肪组织的补充被认为是对抗肥胖和2型糖尿病等代谢性疾病的一种有前途的治疗策略。现在人们普遍认为哺乳动物中存在两种主要的脂肪组织：褐色脂肪组织和白色脂肪组织(white adipose tissue,wat)。白色脂肪组织是以甘油三酯的形式储存过剩能量的主要脂质库，也是人体的主要内分泌器官之一。米色脂肪组织最近被认为是一种源自白色脂肪组织，但其行为类似于褐色脂肪组织。从功能上讲，褐色和米色脂肪组织与白色脂肪组织的不同之处在于，它们有能力将线粒体atp合成与电子梯度电位解耦，从而通过线粒体内膜蛋白解偶联蛋白1(ucp1)产生热量，这一过程发生在非颤抖产热(nst)中，被认为对啮齿动物、冬眠动物和新生儿等哺乳动物维持正常体温很重要。4.不同于啮齿动物，人类和其他动物，如反刍动物和兔子被认为在出生后仅短时间内具有功能褐色脂肪组织，随着年龄的增长褐色脂肪组织随后转化为白色脂肪组织。因此，在相当长的一段时间里，人们普遍认为没有代谢活跃的褐色脂肪组织。然而，2009年的三项研究通过葡萄糖类似物f18氟脱氧葡萄糖(fdg-pet/ct)的正电子发射断层扫描/计算机断层扫描报告了成年人类中存在代谢活跃的褐色脂肪组织。成人褐色脂肪组织主要存在于颈椎、锁骨上和椎旁区域，可被寒冷激活。褐色脂肪组织含量的减少与随着年龄的增长身体脂肪的积累有关。这些发现重新激起了人们对褐色脂肪生物学研究的兴趣，并推动了褐色脂肪组织可能是增加能量消耗和减少肥胖的一个有希望的目标的想法。5.综上所述，开发有效的区别褐色脂肪组织和白色脂肪组织的标志物，有助于评估人体内的褐色脂肪组织和白色脂肪组织的含量与占比，对于脂肪研究领域具有重要意义。技术实现要素：6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种褐色脂肪组织和白色脂肪组织生物标志物及其应用，本发明发现分别在褐色脂肪组织和白色脂肪组织差异表达的基因，可准确表征褐色脂肪组织和白色脂肪组织，因此，可作为有效的生物标志物，应用于检测褐色脂肪组织和白色脂肪组织。7.针对现有技术的不足和实际需求，本发明采用以下技术方案：8.第一方面，本发明提供一种褐色脂肪组织和白色脂肪组织的生物标志物，所述生物标志物包括tfrc基因、stard7基因、smoc1基因、klhdc7a基因、gk基因、fh基因、hmgb3基因、prg4基因、grm8基因、mapk8ip2基因、calb1基因、znf804a基因、ca12基因、trap1基因、atp5g1基因、atpaf1基因、ppa1基因、hr基因、rnf112基因、lmx1b基因、fmod基因、tmem119基因、gdf10基因、adra2a基因、hand2基因、irx1基因、hoxb6基因、hoxb8基因、unc5c基因或fbln7基因中的任意一种或至少两种的组合。9.本发明中，利用rna-seq分析兔子的褐色脂肪组织和白色脂肪组织，分析哪些基因分别在褐色脂肪组织和白色脂肪组织中高表达，同时与人和小鼠的褐色脂肪组织和白色脂肪组织差异基因共同分析比较，寻找能够作为褐色脂肪组织以及白色脂肪组织的标志基因，可准确表征褐色脂肪组织和白色脂肪组织。10.本发明中，在褐色脂肪组织中高表达的基因包括tfrc基因、stard7基因、smoc1基因、klhdc7a基因、gk基因、fh基因、hmgb3基因、prg4基因、grm8基因、mapk8ip2基因、calb1基因、znf804a基因、ca12基因、trap1基因、atp5g1基因、atpaf1基因、ppa1基因和hr基因；在白色脂肪组织中高表达的基因包括rnf112基因、lmx1b基因、fmod基因、tmem119基因、gdf10基因、adra2a基因、hand2基因、irx1基因、hoxb6基因、hoxb8基因、unc5c基因和fbln7基因。11.第二方面，本发明提供第一方面所述褐色脂肪组织和白色脂肪组织的生物标志物在制备检测褐色脂肪组织和/或白色脂肪组织产品中应用。12.第三方面，本发明提供一种检测褐色脂肪组织和/或白色脂肪组织的试剂盒，所述试剂盒包括检测第一方面所述的褐色脂肪组织和白色脂肪组织的生物标志物的表达水平的试剂。13.优选地，所述试剂包括rna转录组检测试剂。14.第四方面，本发明提供第一方面所述褐色脂肪组织和白色脂肪组织的生物标志物在检测褐色脂肪组织和/或白色脂肪组织中应用。15.第五方面，本发明提供一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测褐色脂肪组织和/或白色脂肪组织的方法，所述方法包括：16.对待测样本中rna进行测序，根据测序结果分析第一方面所述褐色脂肪组织和白色脂肪组织的生物标志物的每百万次读取的转录本tpm值，并按计算tpm值与rna质量的比值s，进行判断是否是褐色脂肪组织和/或白色脂肪组织。17.本发明中，检测褐色脂肪组织和/或白色脂肪组织的方法可应用于褐色脂肪组织和白色脂肪组织相关行为的基础研究中。18.优选地，所述以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测褐色脂肪组织和/或白色脂肪组织的方法还包括提取待测样本中rna的步骤。19.本发明中，市售提取rna的试剂均适用于本发明，不作特别限定。20.优选地，所述测序前还包括构建文库的步骤。21.本发明中，市售rna文库构建试剂均适用于本发明，不作特别限定。22.优选地，所述判断的标准包括：23.判断是褐色脂肪组织的标准为：tfrc基因的s值≥8.66、stard7基因的s值≥52.37、smoc1基因的s值≥26.34、klhdc7a基因的s值≥0.08、gk基因的s值≥32.22、fh基因的s值≥142.48、hmgb3基因的s值≥61.87、prg4基因的s值≥10.55、grm8基因的s值≥0.3、mapk8ip2基因的s值≥1.23、calb1基因的s值≥0.3、znf804a基因的s值≥0.04、ca12基因的s值≥2.35、trap1基因的s值≥98.11、atp5g1基因的s值≥278.34、atpaf1基因的s值≥24.52、ppa1基因的s值≥228.03或hr基因的s值≥2.64中的任意一种或至少两种的组合；24.判断是白色脂肪组织的标准为：rnf112基因的s值≥16.57、lmx1b基因的s值≥0.9、fmod基因的s值≥12.43、tmem119基因的s值≥13.84、gdf10基因的s值≥3.64、adra2a基因的s值≥4.56、hand2基因的s值≥2.42、irx1基因的s值≥1.33、hoxb6基因的s值≥13.25、hoxb8基因的s值≥11.49、unc5c基因的s值≥1.00或fbln7基因的s值≥1.47中的任意一种或至少两种的组合。25.作为优选的技术方案，所述以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测褐色脂肪组织和/或白色脂肪组织的方法包括以下步骤：26.(1)提取待测样本中rna；27.(2)利用所述rna构建文库并进行测序；28.(3)根据测序结果分析第一方面所述褐色脂肪组织和白色脂肪组织的生物标志物的每百万次读取的转录本tpm值，计算tpm值与rna质量的比值s，并进行判断是否是褐色脂肪组织和/或白色脂肪组织。29.第六方面，本发明提供一种检测褐色脂肪组织和/或白色脂肪组织的装置，所述装置包括检测单元和分析单元；30.所述检测单元用于执行包括：对待测样本中rna进行测序；31.所述分析单元用于执行包括：32.根据测序结果分析第一方面所述褐色脂肪组织和白色脂肪组织的生物标志物的每百万次读取的转录本tpm值，计算tpm值与rna质量的比值s，并进行判断是否是褐色脂肪组织和/或白色脂肪组织。33.优选地，所述判断的标准包括：34.判断是褐色脂肪组织的标准为：tfrc基因的s值≥8.66、stard7基因的s值≥52.37、smoc1基因的s值≥26.34、klhdc7a基因的s值≥0.08、gk基因的s值≥32.22、fh基因的s值≥142.48、hmgb3基因的s值≥61.87、prg4基因的s值≥10.55、grm8基因的s值≥0.3、mapk8ip2基因的s值≥1.23、calb1基因的s值≥0.3、znf804a基因的s值≥0.04、ca12基因的s值≥2.35、trap1基因的s值≥98.11、atp5g1基因的s值≥278.34、atpaf1基因的s值≥24.52、ppa1基因的s值≥228.03或hr基因的s值≥2.64中的任意一种或至少两种的组合；35.判断是白色脂肪组织的标准为：rnf112基因的s值≥16.57、lmx1b基因的s值≥0.9、fmod基因的s值≥12.43、tmem119基因的s值≥13.84、gdf10基因的s值≥3.64、adra2a基因的s值≥4.56、hand2基因的s值≥2.42、irx1基因的s值≥1.33、hoxb6基因的s值≥13.25、hoxb8基因的s值≥11.49、unc5c基因的s值≥1.00或fbln7基因的s值≥1.47中的任意一种或至少两种的组合。36.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：37.本发明利用rna-seq分析兔子的褐色脂肪组织和白色脂肪组织，首次发现分别在褐色脂肪组织和白色脂肪组织中高表达的基因，同时与人和小鼠的褐色脂肪组织和白色脂肪组织差异基因共同分析比较，寻找能够作为褐色脂肪组织以及白色脂肪组织的标志基因，可准确表征褐色脂肪组织和白色脂肪组织，作为一类新的生物标志物，应用于检测褐色脂肪组织和白色脂肪组织。附图说明38.图1为兔子的褐色脂肪组织的形态变化图，d14为出生后14天，m4为出生后4个月，ibat为肩胛骨间隙褐色脂肪组织，dbat为背部褐色脂肪组织；39.图2为兔子褐色脂肪组织he染色图，比例尺为50μm；40.图3为兔子白色脂肪组织he染色图，比例尺为50μm；41.图4为人、小鼠和兔子的褐色脂肪组织的高表达基因的分析结果图；42.图5为人、小鼠和兔子的白色脂肪组织的高表达基因的分析结果图。具体实施方式43.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。44.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。45.实施例146.本实施例对不同周龄的兔子的脂肪组织进行分离。47.随机选取3只雄性的新英格兰兔子(来自于广州市白云区龙归兴科动物养殖场)，分别在出生后第一天(d1)、第十四天(d14)、一个月(m1)、两个月(m2)、三个月(m3)和四个月(m4)的年龄分离褐色脂肪组织和白色脂肪组织。在脂肪组织解剖中，如图1所示，可以看见在早期的兔子的背部的褐色脂肪组织呈现明显的褐色，而在晚期的兔子的背部的褐色脂肪组织呈现明显的白色而不再是褐色。每个时间点收集的脂肪组织分别进行固定并在-80度冷冻。48.实施例249.本实施例对实施例1中脂肪组织进行he染色检测。50.脂肪组织在福尔马林溶液中进行固定，采用常规方法进行石蜡切片和he染色，光学显微镜下观察肝脏中脂肪细胞形态变化。51.结果如图2所示，he染色结果表明，褐色脂肪组织中的褐色脂肪细胞形态随着年龄的增大，逐渐从多脂滴的细胞形态转变为单一脂滴的细胞形态，而白色脂肪组织中的白色脂肪细胞形态一直维持着单一脂滴的细胞形态。52.实施例353.本实施例对实施例1中不同周龄的兔子的脂肪组织进行rna-seq分析，鉴定新的褐色脂肪组织和白色脂肪组织的标志基因。54.选择兔出生后第一天的肩胛骨褐色脂肪组织(interscapularbat,ibat)，记为ibat_d1，和出生后四个月的腹股沟的白色脂肪组织(inguinalwat,ingwat)，记为ingwat_m4，根据制造商(invitrogen)的说明，使用试剂从脂肪组织中提取总rna，并使用dnase i(takara)去除基因组dna，通过琼脂糖凝胶电泳和安捷伦2100生物分析仪测定rna质量，使用nd-2000(纳米滴技术)测定rna纯度和浓度。选择高质量的rna样本(od260/od280＝1.8～2.2，od260/od230≥2.0，rin≥6.5，28s/18s≥1.0，》1μg)构建测序文库。55.rna-seq转录组文库的制备遵循来自illumina(加利福尼亚州圣地亚哥)的truseqtm rna样品制备试剂盒，使用1μg总rna，根据polya选择法，使用oligo(dt)珠分离mrna，然后通过片段缓冲液进行片段化，使用上标双链cdna合成试剂盒(invitrogen，ca)和随机六聚体引物(illumina)合成双链cdna，根据illumina的文库构建方案，对合成的cdna进行末端修复、磷酸化和“a”碱基添加，在2％低量程超琼脂糖上选择大小为300bp的cdna靶片段的文库，然后使用phusion dna聚合酶(neb)进行15个pcr周期的pcr扩增。在通过tbs380进行量化后，使用illumina hiseq xten/novaseq 6000测序仪(2×150bp读取长度)对配对末端rna seq测序文库进行测序。56.在majorbio云平台的免费在线平台(www.majorbio.com)上进行数据分析，根据每百万次读取的转录本(tpm)方法计算每个转录本的表达水平，rsem(http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)用于量化基因丰度，计算tpm值与rna质量的比值，使用deseq2进行差异基因(deg)表达分析，其中q值≤0.05，带q值的degs≤0.05和|log2fc|》1被认为是表达显著不同的基因。57.比较兔体内ibat_d1和ingwat_m4之间的deg，以及batlas中报告的人类bat和wat和小鼠褐色和白色脂肪细胞(https://shiny.hest.ethz.ch/batlas/.)，使用│log2fc│≥0.5和padjust≤0.05作为筛选可能的bat和wat标记基因的鉴别标准，通过差异基因的表达分析，发现有188个基因在人、兔子和小鼠的褐色脂肪组织中高表达(图3)，102个基因在人、兔子和小鼠的白色脂肪组织中高表达(图4)。由于兔子和人更接近，通过对这些差异基因的分析比较，选择了12个在白色脂肪细胞中高表达基因，如表1所示，18个褐色脂肪细胞中高表达基因，如表2所示。58.表1[0059][0060][0061]表2[0062][0063]综上所述，本发明中，利用rna-seq分析兔子的褐色脂肪组织和白色脂肪组织，首次发现了分别在褐色脂肪组织和白色脂肪组织中高表达的基因，并利用算tpm值与rna质量的比值s，能够有效表征褐色脂肪组织和白色脂肪组织，即，提供了一类新的生物标志物，可应用于检测褐色脂肪组织和白色脂肪组织。[0064]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。









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