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黄金茶挥发油在制备急性肺损伤条件下哺乳动物肠道保护药物中的应用

作者:admin      2022-08-31 14:07:21     591



医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于医药用途技术领域,进一步涉及物质的新的医药用途,具体涉及黄金茶挥发油在制备急性肺损伤条件下哺乳动物肠道保护药物中的应用。背景技术:2.黄金茶是江西省的一种特殊的山区资源。根据《本草纲目》中记载,黄金茶具有清热解毒、健胃消食的作用。目前,黄金茶因作为预防流感的制剂而受到了广泛的关注。此外,江西部分农村地区,黄金茶也被广泛用于治疗腹泻。有研究表明胃肠功能障碍的患病率与急性肺损伤发生和进展有关。中医学认为,“肺-肠”轴是双向轴,肠道菌群会影响肺部疾病的发展,而肺部感染疾病时,肠道菌群也会随之改变,进而影响免疫功能,这为急性肺损伤的防治提供了新途径。3.本实验室通过气相色谱-质谱分析,黄金茶挥发油主要由21种化合物组成,通过控制异常炎症对急性肺损伤发挥肺保护作用。因此,黄金茶挥发油有望成为预防急性肺损伤的理想药物。然而,未有文献报道黄金茶挥发油对肠道功能障碍的影响。技术实现要素:4.本发明要解决的一个技术问题是提供黄金茶挥发油的一种新用途。5.本发明要解决的另一技术问题是提供可对急性肺损伤条件下哺乳动物肠道具有保护作用的药物。6.本发明通过以下技术方案予以实现:7.黄金茶挥发油的一种新用途,其用于制备急性肺损伤条件下哺乳动物肠道保护药物的应用。8.作为优选,所述保护药物是缓解急性肺损伤导致的肠道损伤。9.作为优选,所述保护药物是改善急性肺损伤条件下哺乳动物的空肠组织病理损伤实现的。10.作为优选,所述保护药物是通过缓解急性肺损伤条件下哺乳动物的短链脂肪酸减少的状况实现的。11.作为优选,所述保护药物是通过改善菌群失调的状态实现的。12.作为优选,所述保护药物是通过调节急性肺损伤条件下哺乳动物肠道菌群趋于正常实现的。13.作为优选,保护组织是空肠组织,缓解为急性肺损伤,所述保护药物是通过减轻空肠组织损伤,紧密上皮细胞排列实现的。14.作为优选,所述保护药物是通过丙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸显著增加实现的。15.作为优选,所述保护药物是通过增强菌群丰富度,增加肠道菌群的物种多样性,并有效改善肠道菌群物种组成,减小急性肺损伤条件下哺乳动物与正常哺乳动物肠道菌群物picogreen dsdnaassay kit购自于cell signaling technology公司,truseq nano dna lt library prep kit购自于illumina公司。31.实验动物:清洁级大鼠wistar雄性大鼠,体重180-200g,资格证号:scxk(jing)2016-0006。购自于北京维通利华公司。32.1.2主要仪器设备33.高速台式离心机德国sigma公司;超纯水仪美国millipore公司;m1-l201b型微波炉购于美的制冷家电集团;skm型数显恒温电热套山东鄄城华鲁电热仪器有限公司;生化培养箱上海森信实验仪器公司;agilent 6890n气相色谱系统美国agilent technologies公司;pcr扩增仪gene公司;包埋机武汉俊杰电子有限公司;光学显微镜日本尼康公司;病理切片机上海徕卡仪器有限公司;varioskan flash全波长多功能酶标仪thermo公司;2100生物分析仪agilent公司;illumina miseq高通量测序仪illumina公司。34.2、实验方法35.2.1动物实验设计36.选取36只健康清洁级大鼠wistar雄性大鼠,体重180-200g,资格证号:scxk(jing)2016-0006。购自于北京维通利华公司。许可证号:scxk(赣)2018-0003。大鼠饲养于干燥、通风、安静的环境中,适应性喂养一周。按体重随机分成5组,每组7只,随机分为6组:正常组(con)、阳性对照组(地塞米松组,dex,5mg/kg)、模型组(lps,800μg/kg)、lps+黄金茶挥发油低剂量(ceol,25mg/kg)、lps+黄金茶挥发油中剂量(ceom,50mg/kg)、lps+黄金茶挥发油高剂量(ceoh,100mg/kg)。黄金茶挥发油组的大鼠均通过灌胃方式给予前处理7天。正常组和lps组的大鼠通过灌胃方式给予相同体积的0.5%dmso。dex组的大鼠通过灌胃方式给予相同体积的0.5%dmso最后一天腹腔注射dex(5mg/kg)。末次灌胃后0.5h,腹腔注射lps溶液800μg/kg建立急性肺损伤模型,6h后处死,进行各相关指标的测定。37.动物实验过程中选用的dex是临床上一种广泛运用抗炎药物,已有大量研究报道,dex作为一种糖皮质激素,具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用,可以有效的减弱lps所导致的机体损伤,减弱机体过度炎症反应,维护免疫系统的平衡,因此本技术中选用dex作为阳性对照组是合适的。38.2.2实验样品采集39.收集肺、空肠组织以及盲肠内容物样品,保存在-80℃冰箱备用。40.2.3肠道组织形态结构分析41.收集空肠组织,用10%福尔马林固定至少24h,进行组织病理学形态检测。42.2.4盲肠内容物的短链脂肪酸测定43.取100mg盲肠内容物样品于2ml ep管中,按照1∶7比例加入超纯水,60hz,60s振动混匀,冰浴超声10min后静置20min,4℃下离心,取上清过膜,测定短链脂肪酸。44.2.5盲肠内容物和肺组织dna的提取及高通量测序45.使用dneasypowersoil试剂盒从大鼠盲肠内容物中提取细菌dna,采用pcr扩增细菌16s rrna基因的v3-v4区域,进行高通量测序。46.2.6统计学处理47.实验数据采用平均值士标准误差(mean±sd)表示,组间差异采用spss23.0进行单因素anova分析,并通过lsd检验5%的置信水平,graphpadprism 7作图。48.3、结果与分析49.3.1黄金茶挥发油对急性肺损伤模型大鼠空肠组织形态学变化的影响如图1所示50.he染色显示了正常组大鼠的空肠组织正常形态,无充血或破裂,黏膜上皮细胞按顺序排列。相比之下,lps组发生绒毛破裂、充血等病理现象,隐窝深度明显减少,黏膜上皮侵蚀,提示空肠组织有炎症反应。同时,黄金ceol组显示绒毛断裂充血,黏膜上皮受损。而ceom、ceoh、dex组空肠组织损伤明显改善,上皮细胞排列紧密。51.3.2黄金茶挥发油对急性肺损伤模型大鼠盲肠内容物中短链脂肪酸含量的影响如图2所示52.结果显示,与con组相比,lps组盲肠含量的scfas(丙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸)显著降低。而用黄金茶挥发油干预后,scfas明显增加,但dex组中没有显著变化。因此,我们的研究表明,黄金茶挥发油可能对急性肺损伤大鼠的scfas发挥调节作用。53.注:图2中,与con组相比,*表示差异显著(p<0.05),**表示差异极显著;与lps组相比,#表示差异显著(p<0.05),##表示极显著性(p<0.01),(mean±sd,n=6)。54.3.3黄金茶挥发油对急性肺损伤大鼠肠道菌群的物种多样性的影响55.3.3.1 alpha多样性分析如图3所示56.肠道菌群的alpha多样性主要由chao1指数、shannon指数、simpson指数和observed species指数反映。较con组相比,lps组的chao1指数、shannon指数、simpson指数和observed species指数均有降低;较lps组相比,dex组和ceo各组chao1指数、shannon指数、simpson指数和observed species指数均呈回升趋势,其中,在chao1指数、shannon指数中dex组和ceom组有显著的增加(p<0.01);在simpson指数中,dex组有显著的回升(p<0.01);在observed species指数中,ceom组有显著回升(p<0.01)。这说明与lps相比,dex和黄金茶挥发油可抑制菌群丰富度下降,并增加肠道菌群的物种多样性。总的来说,当大鼠患有急性肺损伤时,其肠道菌群出现失调,而黄金茶挥发油干预可以改善失调的肠道菌群。57.注:图3中,*表示差异显著(p<0.05),**表示差异极显著(mean+sd,n=6)。58.3.3.2 beta多样性分析如图4所示59.使用qiime软件计算beta多样性,通过分析beta多样性指数比较各组间微生物组成相似度。采用unweighted unifrac距离算法进行pcoa主坐标分析,结果显示如图4(a)所示,pco1=10%,pco2=7.1%。con组与lps组微生物群落分开聚集,说明正常组与lps组差异明显。与lps组相比,ceo组和dex组微生物群落沿pco2轴向con组偏移,组内中心连接点与con组中心点的距离小于lps组与con组的距离,说明黄金茶挥发油和dex在一定程度上改善急性肺损伤大鼠肠道菌群的结构分布。其中,ceom组组内中心连接点与con组中心点的距离较小;dex组沿着pco2远离lps组,组内中心连接点与con组中心点的距离最小,更接近con组。此外,使用nmds分析验证不同组之间的物种多样性差异,结果见图4(b)。由图可知,con组和lps组之间发生明显的分离,而ceo组均表现出偏离lps组向con组靠近的趋势。总之,结果表明lps组和con组的肠道菌群物种组成存在显著性差异,黄金茶挥发油可有效改善肠道菌群物种组成,减小lps诱导的急性肺损伤大鼠与正常大鼠肠道菌群物种组成间的差异。60.3.3.3肠道微生物菌落组成分析如图5所示61.图5(a)显示各组在门水平上肠道微生物菌落组成,主要由10个门构成:厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)、疣微菌门(verrucomicrobia)、变形杆菌(proteobacteria)、放线菌门(actinobacteria)、软壁菌门(tenericutes)、tm7、脱铁杆菌门(deferribacteres)、蓝藻细菌门(cyanobacteria)、黏胶球形菌门(lentisphaerae)。其中厚壁菌门和拟杆菌门均为优势菌门,是丰度比例最高的两个菌门。并且与con组相比,lps组的拟杆菌门相对丰度显著降低。相比于lps组,dex组和挥发油低中组的拟杆菌门相对丰度呈现不同程度的增加,表明黄金茶挥发油可减缓lps诱导的菌群结构失调。62.图5(b)显示各组在属水平上肠道微生物菌落组成,乳酸菌(lactobacillus)和瘤胃球菌属(ruminococcus)在各组中均为优势菌属;与con组相比,lps组乳酸菌(lactobacillus)、akkermansla、shigella、普氏菌属(prevotella)、粪球菌属(coprococcus)丰度增加,瘤胃球菌属(ruminococcus)、颤螺菌属(oscillospira)、alistripes、拟杆菌属(bacteroides)丰度明显降低。与lps组比较,黄金茶挥发油灌胃后大鼠粪便中丰度增加。63.3.3.4组间差异物种分析如图6所示。64.基于lefse分析如图6(a)所示,lda阈值为2.0。主要筛选出con、lps和ceo组组间丰度差异显著物种,柱长越长代表该分类单元的差异越显著。同时,应用metagenomeseq分析方法进行筛选。结果如图6(b)-(g)所示。与con组相比,lps组firmicutes的相对丰度降低,其中差异显著的菌为staphylococcus、roseburia、ruminococcus。与con组肠道菌群相比,dex组大鼠actinobacteria、bacteroidetes、firmicutes的相对丰度降低,其中差异明显的菌为adlercreutzia、alistipes、clostridium、oscillospira。与con组肠道菌群相比,ceo各组大鼠bacteroidetes、firmicutes的相对丰度降低,ceom组下调菌群最为丰富,有显著差异的菌群为bacteroides、alistipes、lactobacillus、candidatus、clostridium、oscillospira。与lps组肠道菌群相比,ceom组各组大鼠proteobacteria、verrucomicrobia的相对丰度降低,ceom组中akkermansia下调菌群有显著差异。总而言之,黄金茶挥发油可能下调大鼠肠道菌群alistipes、candidatus、oscillospira来维持肠道健康,通过下调akkermansia相对丰度使急性肺损伤大鼠肠道菌群趋于正常。65.4、实验结论66.黄金茶挥发油可通过改善肠道健康对急性肺损伤条件下哺乳动物发挥保护作用。黄金茶挥发油能有效抑制肠道的炎症,使上皮细胞排列紧密,改善急性肺损伤条件下哺乳动物空肠组织损伤。同时,黄金茶挥发油治疗可显著缓解急性肺损伤条件下哺乳动物的scfas减少的状况。另外,黄金茶挥发油可维系哺乳动物肠道微生物的结构和下调肠道微生物中的特征菌,减少急性肺损伤对肠道的损伤。根据哺乳动物盲肠内容物高通量测序的结果,说明菌群失调是伴随着急性肺损伤发生与发展的,并且个体间表现出很大差异性,黄金茶挥发油的干预能改善菌群失调的状态。基于lefse分析和metagenomeseq分析方法筛选出差异菌群,结果显示黄金茶挥发油可能下调哺乳动物肠道菌群alistipes、candidatus、oscillospira来维持肠道健康,通过下调akkermansia相对丰度使急性肺损伤条件下哺乳动物肠道菌群趋于正常。因此,口服黄金茶挥发油对急性肺损伤哺乳动物肠道的有一定的保护作用。67.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。









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