梅果皮红色性状相关的SNP分子标记及其应用

有机化合物处理,合成应用技术梅果皮红色性状相关的snp分子标记及其应用技术领域1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种与果梅果皮红色性状相关的snp分子标记组合、特异性引物及其应用。背景技术：2.果皮色泽是由果面的底色和表色两部分组成，与叶绿素、类胡萝卜素(胡萝卜素、叶黄素和番茄红色等)和类黄酮类色素(黄酮、黄酮醇和花青苷等)的含量及其比例有关。果面底色主要为绿色、黄色和黄绿色，由叶绿素和类胡萝卜的含量和比例决定，果面表色主要为红色、蓝色和紫色，是花青苷等类黄酮物质的合成和积累的结果。果实商品化是以市场经济需求为导向，提高水果经济效益为目标，实现提高果实品质、最大经济和使用价值的过程。果实品质是外在品质和内在品质的综合表现，果实外在品质通常包括果实果形、大小、整齐度、果皮色泽、表面光洁度和光泽、果点等指标，果皮色泽与果皮中花青苷种类和含量密切相关，良好的果皮色泽是优异的果实外观品质，能引起消费者的注意和提高其商品价值。3.花青苷是一类常见的水溶性类黄酮物质，是植物次生代谢-苯丙氨酸代谢途径中类黄酮代谢的分支产物。花青苷是存在于高等植物体的花、果实、叶等诸多器官中的重要次生代谢产物，结构多样并分布广泛。花青苷在细胞质中合成后被运输到液泡中储存，随着细胞液内酸碱度的改变而产生从红色到紫色的颜色变化。花青苷作为一类可食用的天然色素，是食品工业中利用最广泛的食品添加剂之一，经常用于果冻、糖果和果酱等加工品的调色。花青苷是红葡萄酒中的主要呈色物质，也是决定其外观品质光泽的主要因素，还与其他酚类物质共同影响口感等内在品质。其他富含花青苷的水果如蓝莓、桑葚和杨梅等，会被用来深加工成果干(蓝莓干和桑葚干)、果酱(蓝莓酱)、果酒(桑葚酒和杨梅酒)和果汁饮料等食品，丰富人们的日常饮食生活。4.全基因组重测序从基因组水平为构建高密度的遗传连锁图谱、全基因组关联研究分析、数量性状基因座定位提供高通量的分子标记。利用基于wgr开发的snp标记来识别和验证snp基因型分析，与传统分子标记的遗传作图相结合，可以快速挖掘到候选基因及其导致表型的snp位点。snp标记普遍应用于果树中梨、苹果、葡萄和桃等果树的遗传多样性及数量性状定位等方面，其中关于果实色泽的数量性状定位有不少报道。snp分子标记较其他的dna分子标记具有数量大、遗传稳定、易于检测等优点，常用作梨、苹果和葡萄等与果皮色泽相关基因的定位与分子标记辅助育种。snp分子标记在梅种质资源鉴定、遗传进化分析、花色基因定位等方面研究较多，但是有关果皮红色性状的相关分子标记尚未报道。因此开发与梅果皮花青苷的生物合成高度相关的高多态性snp分子标记，分子标记辅助育种将大大加快果梅适宜不同加工需求的优异种质的育种进程。技术实现要素：5.发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种与果梅果皮红色性状相关的snp分子标记组合、特异性引物及其应用。6.技术方案：本发明的目的可通过如下技术方案实现：7.第一方面，本发明利用从基因组测序并筛选得到的果梅果皮红色性状相关的snp分子标记，在加工生产常用的不同果皮色泽的果梅品种中鉴定和验证，并经过功能注释和分析筛选开发出与梅果皮色泽相关的显著snp位点。8.一种与果梅果皮红色性状相关的snp分子标记组合，所述分子标记组合包括以下7个snp分子标记:[0009][0010]pmsnp_1-7所在的核苷酸序列分别如seq id no.1-7所示。[0011]上述信息基于数据库ncbi的果梅基因组版本:gca_000346735.1p.mume_v1.0,2014/02/28。[0012]所述的与果梅果皮红色性状相关的snp分子标记组合的特异性引物，所述特异性引物的序列如下所示：[0013][0014]一种试剂盒，包含上述的特异性引物。[0015]第二方面，基于前述研究成果，本发明提供了所述分子标记组合在梅不同果皮色泽种质材料的鉴定或花青苷合成基因检测中的应用。[0016]所述的snp分子标记组合、所述的特异性引物或所述的试剂盒在果梅分子标记辅助育种中的应用。[0017]进一步的，所述的snp分子标记组合、所述的特异性引物或所述的试剂盒在筛选红色果皮果梅中的应用。[0018]一种筛选红色果皮果梅的方法，所述方法包含应用所述的snp分子标记组合、所述的特异性引物或所述试剂盒的步骤。[0019]进一步的，所述筛选红色果皮果梅的方法，包括以下步骤：[0020](1)提取待测果梅样本的基因组dna；[0021](2)以步骤(1)提取的基因组dna作为模板，利用所述的特异性引物或所述的试剂盒进行pcr扩增；[0022](3)纯化的pcr产物进行测序，检测基因型；[0023](4)将检测的7种基因型，与所述的snp分子标记组合进行比对，如果每种基因型均相同，则待测果梅样本为红色果皮果梅。[0024]有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：[0025]本发明利用测序数据和多年多点的表型数据进行关联分析，得到与果梅果皮色泽相关的snp位点，进一步开发了与果梅果皮色泽相关的snp分子标记，并通过分子标记组合检测的方法提高检测准确率达90％以上。[0026]本发明还同时为克隆候选花青苷合成基因提供候选基因组区间，鉴定出与果梅果皮色泽相关的染色体区段，为进一步的基因克隆和利用提供基础。[0027]利用本发明所开发的分子标记进行辅助育种，可以实现果皮色泽的快速鉴定，减少田间测试成本，从而节约育种成本、加快育种进程。附图说明[0028]图1为分子标记开发所用梅果实生态照。[0029]图2为pmsnp_1和pmsnp_2snp测序基因分型。[0030]图3为44份果梅种质的upgma聚类图。[0031]图4为44份果梅种质的种群结构。具体实施方式[0032]下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求限定的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0033]实施例[0034]用于果梅果皮红色性状检测的snp分子标记组合[0035]本发明位点的设计过程，通过利用果梅青梅类和红梅类的重测序数据位点信息，将青梅类和红梅类的位点比对和筛选得到用于果梅果皮色泽检测的28个snp位点，提取snp位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行验证和检测得到本技术方案的7个snp分子标记，具体如下：[0036]1、28个用于果梅果皮红色性状检测的snp分子标记的筛选[0037]通过利用果梅青梅类和红梅类的重测序数据位点信息，对果梅花青苷合成的功能基因所在区域所涉及的snp位点进行筛选，对收集到的18万个功能相关的位点，将青梅类和红梅类的位点比对，得到3143个完全匹配位点的果梅验证的snp标记，进一步对获得的snp标记对果梅的参考基因组(gca_000346735.1p.mume_v1.0)进行序列比对和注释，得到28个特异性最好的标记位点，根据这28个snp位点设计snp引物，选取44份果梅不同果皮色泽的种质资源进行基因分型验证，选出一套标记最少，并能够区分所有材料的标记组合，最终挑选出7个用于果梅果皮色泽检测的snp标记，所述7个分子标记均为高质量、单拷贝、高多态性(44份果梅材料中的pic值都高于》＝0.5)、数据检出率》90％的snp标记。上述44个果梅品种的生态照和基本信息如图1和表1所示。[0038]表1分子标记供试果梅品种[0039][0040]上述7个snp分子标记的基本信息如表2所示。[0041]表2分子标记的基本信息[0042][0043][0044]7个snp分子标记所在的核苷酸序列如下所示：[0045]pmsnp_1[0046]ttgcccgggtaagtcaatggtttaaccttccttccccaacaccacaccgtcctcatgactcaccgtctaactctatccataacaacaaaaccacactttctcgaggaaaagacactctcagattcccgcaatttctcagccccacaaaaacccatggcgccaaaatccttcaaccccaaaacccaaacctac[t/a]cctccccccgacctcccgcccccttccccacagaccccaacctctccctcacctccttcctcttccaatcctccacctccttccccaacaaccttgccctcgccgactcagacaccgccgaaactctaacc[0047]pmsnp_2[0048]tccggccttctccaccgac[g/c]ccaagcgcctcctcgtctgcacaggccccgtcgtctccatctttagcacctccaccggtttacaggtttccagttctaccttcctcttcctcctcaatttacgctcccataccctccctcttatgataatatttggttttatttgtttaatttagatagcttccttggaggctcacaatgccttggtcacctccgtcatagtagttcccggaaacaaagctctgagcttttgctggactgcctccctcgacggcacccttcgctattgggactttgcagt[0049]pmsnp_3[0050]gcagcttgaccatcctccatatcaaaataataactaccagcagctgccgaagctgaagctgaactacttgaagtagcagtcattgacattattgaagaaaagcatagttgtccgtttgatgacgagctcaaatgaccacaagtagtag[c/g]agtagcagtagtagtagtctctacctgatatacctcatgagtaacgcccatggcatgatcatgttgatggtcactcaaaaccccatttgaatttggatccttctgcagtaactcaacattgtccatcaattcattaaatgtacccaacaacccaccat[0051]pmsnp_4[0052]aaattaatcaaataatgaagagatcagcacaacttgtgttcatcccagccccaggcgctggccacatcgtgtcaacggtcgagatcgcaaagcaactcgttgctcaagatgaccagctcttcatcaccatcctcatcatgaagctccccttcgacaagctcttcaccaatacagacccttcaatctcacaccgcatcagcttcgtcaacctcccgga[g/c]ttccacatcgacacacagggccttgccttcacctccttcatcaaaaca[0053]pmsnp_5[0054]agccagagccagttcttggaattgggtttgatcaaaaactgtgaagctgccaaatgcaacatagatgactgagttg[a/t]gtggctgttgatccagccactgcaagcaagttgagtcttgtggccaaaaggagcctgctgaatttccgacccggttgcttgccaagagtgggcctattggtaaaatttcaggggccgaggtgaatgcttctggctcaaagtcatatgttgagttgcaaacaagcctttctaccagtttcagagtcctgttgattcttaacattacctcaaatatcattttctgagtggtaaagtcacctatgcatgcccacacaaagtctttagtgttcatggtgggcatg[0055]pmsnp_6[0056]cacattttgttcctcccgccaatctgccacgtaagtcgccactctcctataaaatttctccttaaacacctcccacacttggtacttgtagtgatttataaccaacactcccctatccacattcacaggctcgtacccat[t/a]cctaagatgaaaatggtgcaccacattgatcaatgttgagttcaatgcctcaggcctaacaatactcttgtgcctctcgggggcggccaaccgacacgtgtacccgaccgtgacgccttgaacaggaactcgtctgaggcccgaaggcccaaaactgta[0057]pmsnp_7[0058]attaaatgcctttgaattggtaagggagttgggattggctgtggaaatcaacatggagtataggaggagcttttatgggga[t/g]agtccgaaggttgtgaaggcagaagagatagagagaggaataagggaggtgatggtgcaggatagtgatttaaggaagagggtgaaagagacgagtgagaagagcaaggcggctttgatggatggtgggtcctcacactcttcattgggacattttcttgatcagatttttctttgatatataaataaaatatatattcggtggttctgattttg[0059]2、引物设计[0060]snp标记的设计：利用oligo 7软件对筛选出的8个snp分子标记进行snp引物设计。每个snp标记由正向和反向共2条引物序列组成，引物序列见表3。[0061]表3分子标记开发所用引物列表[0062][0063]3、snp检测[0064]利用表3，扩增含有snp位点的300～1,000bp pcr产物。用1μm的正、反向引物、0.2mmdntp、3mm mgcl2和2u taq dna聚合酶扩增1μl dna，使用以下循环程序95℃ 5min，然后94℃ 30s，60℃30 s，72℃90 s，共40个循环，最终延伸72℃10 min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。纯化的pcr产物由擎科生物科技(南京)进行sanger测序。使用novosnp软件检查测序图文件，并通过提取或比较峰信号来检测基因型。[0065]通过sanger测序获得所有snp位点的基因分型，如图2所示为，pmsnp_1和pmsnp_2snp测序基因分型为常见的t/a和c/g分型，包含杂合和纯合突变。[0066]4、7个用于果梅果皮红色性状检测的snp分子标记验证[0067]利用popgene 1.32软件对snp引物多态性进行分析，计算其有效等位基因数(ne)、观察杂合度(ho)、期望杂合度(he)、平均杂合度(ha)、基因杂合度(h)、次要等位基因频率(maf)、香农信息指数(i)、多态性信息含量(pic)。[0068]多态信息内容(pic)是物种多样性的指标。群体中pic》0.5表示该位点高度多态性；当0.25《pic《0.5时，该位点为中度多态性；pic《0.25当该位点表现出低程度的多态性。测得的该7个snp位点的多态性均高于0.5，属于高度多态性snp位点。[0069]利用该7个多态性从44份果梅样品中共获得968个遗传距离和相似系数数据，红梅类‘红顶’和‘软条红梅’的遗传相似度最高(0.989)，青梅类‘信侬小梅’和红梅类‘中红’的遗传相似度最低(0.412)，通过数量分布分析遗传相似系数为0.03，44个品种中遗传相似系数最高为0.81，两侧不对称。经卡方检验，均非正态分布(p《0.01)，呈左偏分布。根据snp遗传相似系数矩阵，如图3所示，将44个品种分为两个亚组。如图3所示，6个品种被分配到亚组i，38个品种被分配到亚组ii。6个红梅类品种归入亚组i，所有青梅类品种归入亚组ii。[0070]基于来自44个品种的28个snp位点，研究了果梅品种群结构。运行structure软件，k范围从1到10，并对每个k执行10次独立运行。最大δk在k＝2时检测到，因此推断品种群被分为2个簇，分别包括10个和34个种质(图4a)。[0071]将k＝2对应的10次操作得到的最大似然值进行比较，绘制果梅的品种群结构，得到属于该亚群的一个品种对应的qi值。结果表明，大部分红梅类品种(10/15)被归入簇i(he:0.3352,fst:0.1773)，4个红梅类品种的qi均大于0.9；有34个品种被归入簇ii(he:0.2817,fst:0.2800)，其中红梅类6个，青梅类28个，簇i中大部分青梅类品种(82％)qi值大于0.9，其他6个红梅类品种的范围为0.523～0.745。本研究对按结构和果皮颜色划分的亚组进行分析，发现基于结构的果梅分类结果与按形态分类的果实颜色有很大的相关性。例如，大多数红梅类品种被归入簇i，而绝大多数青梅类品种都被归入簇ii(图4b)。[0072]本发明基于基因组重测序开发的snp分子标记研究了44个品种的遗传多样性。根据pic值，共有7个snps标记表现出高多态性(pic》0.5)。通过构建进化树，将所有44个品种分成2大类，大多数红梅类品种被分配到簇i，所有青梅类被分到簇ii，意味着所开发的分子标记可以有效区分红梅类和青梅类品种，作为有效分子标记为在将来的果皮色泽相关分子标记辅助育种提供了可能。









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