FK506或其可药用衍生物和铁死亡诱导剂联合在制备治疗癌症的药物中的用途的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术fk506或其可药用衍生物和铁死亡诱导剂联合在制备治疗癌症的药物中的用途技术领域1.本发明涉及生物医药领域，特别涉及fk506或其可药用衍生物和铁死亡诱导剂联合在制备治疗癌症的药物中的用途。背景技术：2.铁死亡(ferroptosis)是近年来，新发现的一种由铁离子依赖地，以多不饱和脂肪酸氧化积累介导的调节性细胞死亡。由于肿瘤细胞存在一个名为铁成瘾的现象，即依赖铁来促进其自身增殖，使得肿瘤细胞可能更易发生铁死亡，在肿瘤治疗领域得到极大的重视。目前，铁死亡诱导剂在肝癌、肠癌、肾癌等癌种中表现出良好的治疗效果，但是在肺癌中却疗效欠佳。3.而肺癌是我国死亡率最高的癌症，目前对晚期肺癌的治疗方案主要有化疗、靶向治疗及免疫治疗；三种治疗方案都不可避免出现耐药，因此，为了延长患者生命，寻找新的治疗方案势在必行。如果增加肺癌细胞对铁死亡药物的敏感性，安全地通过诱导肺癌细胞铁死亡来治疗肺癌将极大推动目前肺癌的治疗手段。4.目前已知的铁死亡介导机制有两种：第一种是通过抑制细胞膜上的xc-系统(system xc-)，使得细胞内谷胱甘肽合成前体减少，以抑制谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4，gpx4)，目前报道的唯一一个可以有效去除膜上脂质氧化的谷胱甘肽过氧化酶，从而导致致死性脂质过氧化物积累，导致细胞铁死亡，但是由于xc-到gpx4中间还有很多代谢调控，癌细胞相对而言容易发生耐药；而另一种机制，则是通过小分子化合物rsl3直接抑制铁死亡最重要的负调节分子gpx4的活性来实现铁死亡的诱导，这是一种高效地诱导铁死亡的方式。5.肺作为人体呼吸器官，相对于其他组织，常处于一个高氧浓度的环境中，这种特殊的环境使得肺部肿瘤习惯氧化压力的环境，从而极有可能提高了铁死亡的诱导阈值。也极有可能是，抗肿瘤药物索拉菲尼(在甲状腺癌、肾癌、肝癌等肿瘤中拥有良好疗效)在肺癌的临床研究中没有获得支持的原因之一。即使应用rsl3来治疗，依然需要较高浓度的rsl3才能够肺癌细胞发生铁死亡。因此，本领域十分需要寻找方法来增加癌细胞对rsl3处理的敏感性，并将铁死亡诱导剂(rsl3)使用量降低至安全用药的范围内。技术实现要素：6.本发明的目的在于提供一种治疗癌症的方法，使得降低癌细胞发生铁死亡阈值，恢复癌细胞对铁死亡诱导剂的敏感性，以更好的诱导癌细胞铁死亡，达到治疗癌症的目的。7.为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了fk506或其可药用衍生物和铁死亡诱导剂联合在制备治疗癌症的药物中的用途。8.在一些优选的方案中，所述癌症为肺癌。9.在一些优选的方案中，所述铁死亡诱导剂为rsl3或其可药用衍生物。10.在一些优选的方案中，给药方式为皮下注射，所述rsl3或其可药用衍生物的单次给药质量浓度为3.0至5.0mg/kg，更优选为3.3至4.7mg/kg，更优选为3.5至4.5mg/kg，更优选为3.8至4.2mg/kg；例如4mg/kg。11.在一些优选的方案中，给药方式为皮下注射，所述fk506或其可药用衍生物的单次给药质量浓度为7.0至9.0mg/kg，更优选为7.3至8.7mg/kg，更优选为7.5至8.5mg/kg，更优选为7.8至8.2mg/kg；例如8mg/kg。12.在一些优选的方案中，所述rsl3或其可药用衍生物的单次给药质量浓度与所述fk506或其可药用衍生物的单次给药质量浓度之比为1：(1.5-2.5)，优选为1：(1.8-2.2)。13.在一些优选的方案中，给药方式为口服，所述fk506或其可药用衍生物的的单次给药浓度为0.01mg/kg-0.3mg/kg。14.在一些优选的方案中，给药方式为静脉注射，所述fk506或其可药用衍生物的单次给药浓度为0.01mg/kg-0.1mg/kg。15.在一些优选的方案中，给药方式为口服，所述rsl3或其可药用衍生物的的单次给药浓度为0.01mg/kg-0.3mg/kg。16.在一些优选的方案中，给药方式为静脉注射，所述rsl3或其可药用衍生物的单次给药浓度为0.01mg/kg-0.1mg/kg。17.在一些优选的方案中，所述fk506或其可药用衍生物的每日给药剂量为80mg至1000mg，优选为100、250、500、750或1000mg，最优选为250mg或500mg。18.在一些优选的方案中，所述rsl3或其可药用衍生物的每日给药剂量为40mg至1500mg，优选为50、125、250、300或500 1000mg，最优选为250mg或500mg。19.在一些优选的方案中，所述rsl3或其可药用衍生物的每日给药剂量与所述fk506或其可药用衍生物的每日给药剂量之比为1：(1.5-2.5)，优选为1：(1.8-2.2)。20.在一些优选的方案中，所述fk506或其可药用衍生物的给药频率为单位剂量每日1至5次，优选为1至3次，优选为1至2次，最优选为1次。21.在一些优选的方案中，所述rsl3或其可药用衍生物的给药频率为单位剂量每日1至5次，优选为1至3次，优选为1至2次，最优选为1次。22.在一些优选的方案中，所述fk506或其可药用衍生物和rsl3或其可药用衍生物被分别给药、同时给药或序贯给药23.本发明的第二方面，提供了一种药物组合，所述药物组合包括fk506或其可药用衍生物和铁死亡诱导剂或其可药用衍生物，以及药用载体或赋形剂。24.本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一活性成分和第二活性成分以及药用载体或赋形剂，其中所述第一活性成分为fk506或其可药用衍生物，所述第二活性成分为rsl3或其可药用衍生物。25.本发明的第四方面，提供了一种fk506或其可药用衍生物在制备降低铁死亡诱导剂或其可药用衍生物的使用浓度的药物中的用途。26.本发明的第五方面，提供了一种降低铁死亡诱导剂临床使用浓度的方法，所述方法包括步骤：向患癌的受试者施用治疗有效量的铁死亡诱导剂或其可药用衍生物和治疗有效量的fk506或其可药用衍生物；27.向患癌的受试者施用治疗有效量的含有fk506或其药用衍生物的药物组合物和治疗有效量的含有rsl3或其药用衍生物的药物组合物；或者28.向患癌的受试者施用治疗有效量的本发明第三方面所述的组合物。29.本发明的第六方面，提供了一种提升肺癌细胞铁死亡敏感性的方法，所述方法包括步骤：向癌的受试者施用治疗有效量的铁死亡诱导剂或其可药用衍生物和治疗有效量的fk506或其可药用衍生物；30.向患癌的受试者施用治疗有效量的含有fk506或其药用衍生物的药物组合物和治疗有效量的含有rsl3或其药用衍生物的药物组合物；或者31.向患癌的受试者施用治疗有效量的本发明第三方面所述的组合物。32.本发明的第七方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括步骤：33.向患癌的受试者施用治疗有效量的fk506或其药用衍生物和治疗有效量的rsl3或其药用衍生物；或者34.向患癌的受试者施用治疗有效量的含有fk506或其药用衍生物的药物组合物和治疗有效量的含有rsl3或其药用衍生物的药物组合物；或者35.向患癌的受试者施用治疗有效量的本发明第三方面所述的组合物。36.本发明中fk506的结构如下式ⅰ所示；37.rsl3的结构如下式ⅱ所示；[0038][0039]本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：[0040](1)本发明提供的联合用药的用途，可以减少癌细胞铁死亡诱导剂的使用浓度但不减少其作用效果，即可以降低癌细胞尤其是肺癌细胞铁死亡诱导阈值使得铁死亡诱导剂在安全的用药浓度下诱导癌细胞铁死亡，实现治疗癌症的功能；[0041](2)本发明中联合用药的用途(fk506和rsl3联合使用)具有比单独用药更强的肿瘤抑制能力，对于肺癌病人来源的癌细胞和小鼠肺癌细胞都具有很强的杀伤效果，当药物组合的各成员使用浓度在本发明所述的用药浓度范围内时，具有非常好的抑制肿瘤细胞生长的作用且不产生明显的副作用。[0042]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明[0043]一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。[0044]图1是根据本发明实施例中rsl3联合fk506处理肺癌a549细胞系细胞死亡情况示意图；[0045]图2是根据本发明实施例中rsl3联合fk506处理肺癌a549细胞存活率柱状图；[0046]图3是根据本发明实施例中1号肺癌病人来源细胞存活柱状图；[0047]图4是根据本发明实施例中2号肺癌病人来源细胞存活柱状图；[0048]图5是根据本发明实施例中1号肺癌病人来源细胞sytox染色图；[0049]图6是根据本发明实施例中rsl3联合fk506处理肺癌细胞系llc小鼠皮下瘤实验结果图；[0050]图7是根据本发明实施例中小鼠肺癌细胞系llc小鼠皮下瘤药物剂量实验结果图；[0051]图8是根据本发明实施例中rsl3联合fk506处理肺癌kln205细胞系；[0052]图9是根据本发明实施例中rsl3联合fk506处理肺癌kln205细胞存活率柱状图；[0053]图10是根据本发明实施例中kln205细胞皮下瘤生长曲线；[0054]图11是根据本发明实施例中肿瘤t/c比值示意图；[0055]图12是根据本发明实施例中肿瘤大小图示意图；[0056]图13是根据本发明实施例中各组药物处理小鼠体重变化曲线图，(rsl3，4mg/kg；fk506，8mg/kg)；[0057]图14是根据本发明实施例中各组药物处理20天小鼠白细胞、红细胞数目柱状图；[0058]图15是根据本发明实施例中各组药物处理20天小鼠血小板数目柱状图；[0059]图16是根据本发明实施例中各组药物处理20天小鼠血红蛋白含量柱状图。具体实施方式[0060]现有技术中，抗癌药物作用于肺癌效果差强人意。发明人在研究中发现，肺癌细胞系铁死亡相关基因表达量较其他器官来源肿瘤细胞高，表明肺癌细胞提高了铁死亡的阈值。肺癌细胞系(a549、hop-62、nci-h226、nci-h322m和nci-h460)中，system xc-组份slc7a11和slc3a2表达量高于其他肿瘤细胞系，说明对于肺癌细胞来讲抑制gpx4比抑制xc-会更有效；肺癌细胞系sw900可以通过高表达丝氨酸苏氨酸酪氨酸激酶1(serine threonine tyrosine kinase 1,styk1)，进而促进gpx4的表达，导致铁死亡在nsclc中受到抑制。这都证明了提高细胞对rsl3的敏感度尤其重要。如果能在安全的铁死亡诱导剂(rsl3)使用量的前体下，恢复肺癌细胞对铁死亡的敏感性，将拓宽肺癌患者的治疗方法。[0061]药用衍生物[0062]本发明中“药用衍生物”指的是某活性成分的药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化物或前药。其中，“药学上可接受的盐”可以是指由药学上可接受的无毒酸(包括无机酸和有机酸)制备的药学上可接受的加成盐。在某些情况下，药学上可接受的盐是通过使本文所述的化合物与酸反应而获得的。术语“药学上可接受的盐”还可以指通过使具有酸性基团的化合物与碱反应形成盐或通过先前确定的其他方法制备的药学上可接受的加成盐。药理学上可接受的盐没有特别限制，只要它可以用于药物中。[0063]药物组合[0064]在本发明的一些实施方式中，提供了一种药物组合，所述药物物组合包括fk506或其可药用衍生物和铁死亡诱导剂或其可药用衍生物，以及药用载体或赋形剂。[0065]本发明中的药物组合可以是第一药物和第二药物的组合，或以第一药物为活性成分的第一药物组合物和以第二药物为活性成分的第二药物组合物的组合，或同时以第一药物和第二药物为活性成分药物组合物。[0066]药物组合物[0067]本发明中的“药物组合物”是指包含除包含活性成分外，还包含“赋形剂”如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂和/或增稠剂的混合物。药物组合物有助于将化合物施用于生物体。例如，“第一药物组合物”指的是包含第一活性成分(rsl3)和所述第一活性成分的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。“药物组合物”中可含有的活性成分的量为约0.1％到约99.9％、优选约1％到约60％的活性成分。联合疗法中用于经肠或非经肠给药途径的药物制剂是，例如:单位剂型的制剂，如糖衣片、胶囊或栓剂，或安顿瓶。如无特别注明，这些制剂形式以公知的方式制备，如，通过传统的混合、制粒、包糖衣、溶解或冻干等工艺。应理解，各剂型的制剂中包含的组合成员的单位含量其本身不必构成有效量，因为必要的有效量可以通过多个剂量单元的给药达到。[0068]受试者给药方式[0069]本发明中“受试者”是指动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、猴、牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。术语“受试者”和“患者”在本文中例如关于哺乳动物受试者(如人)可互换使用。[0070]本发明所述给药途径选自经口给药、胃肠外给药、经皮给药，所述胃肠外给药包括但不限于静脉注射、皮下注射、肌肉注射。[0071]本发明的药物组合中每个药物的治疗有效量可被同时给药或按任何顺序序贯给药，各组分可被分开给药或作为固定组合给药。例如，可包含:同时地或以任何顺序序贯地(i)施用游离形式或药学上可接受的盐形式的第一药物以及(ii)施用游离形式的或药学上可接受的盐形式的药物，所述施用以联合治疗有效量、优选以协同有效量进行，例如，以本文描述的每日剂量或间歇剂量进行。本发明组合中的各组合成员可以在治疗过程中的不同时间点分别给药，或以独立的或单一的组合形式同时给药。另外，术语"给药"也涵盖组合成员的前药的使用，该前药在体内转化成该组合成员本身，应该理解本发明涵盖了所有这些同时或交替治疗的方案，对"给药"这个词应作出相应的解释。[0072]本发明药物组合中采用的每个药物的有效剂量可根据所用的特定化合物或药物组合物、给药方式、所治疗的病症、所治疗病症的严重程度而变化。因此本发明组合的给药方案根据各种因素来选择，包括给药途径以及病人的肝肾功能。普通技能的临床医生或医师都可以容易地确定并在处方中开出减轻、对抗或阻止病症进展所需的单个活性成分的有效量。在有效无毒性的范围内达到活性成分最优的精确浓度需要一个基于活性成分对所治疗病症的利用度动力学参数的治疗方案。[0073]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。[0074]除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本技术的示例性实施方式。[0075]实施例1、rsl3对肺癌细胞系抑制曲线的绘制[0076]通过利用不同浓度rsl3对肺癌细胞进行敏感度分析，测试出rsl3对肺癌细胞系抑制曲线。具体步骤如下：第一天，将不同肺癌细胞以105/ml的密度铺于96孔板，每孔100ul。每细胞系铺30个孔。第二天，用rpm1640培养基加入rsl3，分别配置rsl3浓度为(0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5um)。随后将上一步骤所配含rsl3的rpm1640培养基加入96孔培养板中，每个浓度三个复孔。加药20小时后，运用cck8法对细胞活力进行测定，并以此绘制rsl3对肺癌细胞系抑制曲线。[0077]实施例2、人肺癌细胞系rsl3和fk506分别单独用药和联合用药比较[0078](1)人肺癌细胞系a549[0079]第一天，将a549细胞以105/ml的密度铺于96孔板，每孔100ul。共铺12个孔。第二天，用rpm1640培养基加入sytox(终浓度1um)，随后分别配置含rsl3(2.5um)、fk506(5um)、rsl3(2.5um)和fk506(5um)、以及含dmso的对照培养基。将上一步骤配置的培养基分别替换加入第一天所铺96孔板，每组3个复孔。加药后20小时，于荧光显微镜进行拍照记录，随后用cck8法测量细胞活力。[0080]实验结果见图1-2。图1中绿色荧光为sytox进入细胞核后发出的光，表示细胞膜完整性已经破坏的死亡细胞。由图1-2可知，fk506本身不具备细胞毒效应，rsl3对肺癌细胞仅有微弱的杀伤作用。当rsl3和fk506同时加入后，细胞发生比单独加rsl3更剧烈的细胞死亡。铁死亡抑制剂liproxstatin-1(lip1)能够抑制rsl3，以及rsl3和fk506联合使用引起的细胞死亡。[0081](2)肺癌病人来源的肺癌细胞[0082]对于肺癌病人来源的肺癌细胞，采用和(1)中相同的方法进行联合用药实验。[0083]结果见图3-5。由图3-5可知，rsl3和fk506同时使用也比单独使用rsl3具有更加强烈的肿瘤杀伤能力，同时单独的fk506几乎不引起细胞死亡，铁死亡抑制剂lip1能够很好的抑制rsl3，以及rsl3和fk506联合使用引起的细胞死亡。这说明相比较于单独使用rsl3，rsl3和fk506联合使用对从肺癌患者新鲜分离的肿瘤细胞依然更有效，而且效果明显。[0084]实施例3、小鼠皮下瘤用药实验[0085]为了测试rsl3和fk506联合使用的抗肿瘤效果是否在有免疫力的机体上依然有效，发明人将小鼠肺癌细胞系llc接种到免疫系统健全的c57bl/6小鼠皮下，单独给予rsl3、fk506，同时给予rsl3(3.4mg/kg/天)和fk506(6.4mg/kg/天)，同时给予rsl3、fk506及铁死亡抑制剂lip1，结果见图6。结果显示，给予不同浓度的rsl3和fk506，并检测不同rsl3和fk506浓度的效果。结果见图7。[0086]由图7可知，rsl3浓度在4mg/kg，fk506浓度在8mg/kg具有非常好的抑制肿瘤细胞生长的作用。[0087]实施例4、rsl3和fk506联合用药最佳浓度验证[0088]发明人选择另一种小鼠肺癌细胞系kln205进行了最佳浓度的验证。[0089]首先在体外进行了rsl3和fk506的联合用药预实验，结果见图8和图9,图8和图9再次验证了rsl3和fk506的联合用药比单独用药具更加优良的效果。[0090]发明人将小鼠肺癌细胞kln205接种在免疫系统健全的健康野生型c57bl/6小鼠皮下，然后分别给予溶药载体(dmso)，fk506(8mg/kg)，rsl3(4mg/kg)，rsl3(4mg/kg)和fk506(8mg/kg)联合给药，以及rsl3和fk506联合给药的同时加上铁死亡抑制剂lip1，同时检测小鼠肿瘤大小，结果见图10-12。[0091]由图可10-12可知，在有免疫系统的小鼠体内rsl3和fk506联合给药对于抑制肿瘤的生长具有非常理想的效果。[0092]实施例6、rsl3和fk506联合用药剂量安全性[0093]选用6周龄c57雌鼠，对小鼠进行皮下注射药物(dmso、rsl3、fk506、rsl3和fk506)，每天注射一次。每两天对小鼠体重，进行监测记录。药物注射后低十七天，对小鼠进行尾静脉采血，并运用小鼠血液检测仪对小鼠血液中白细胞、红细胞、血小板及血红蛋白进行检测。[0094]结果见图13-16。由图13-16可知，rsl3浓度在4mg/kg，fk506浓度在8mg/kg对小鼠为安全剂量[0095]本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。









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