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人血管紧张素转化酶抑制剂化合物和合成方法

作者:admin      2022-08-31 15:22:22     437



有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及抑制剂技术领域,具体的说,涉及了一种人血管紧张素转化酶抑制剂化合物和合成方法。背景技术:2.心力衰竭是因心肌肥大和心室重塑而引起心肌收缩力下降、心脏收缩和舒张功能障碍所导致的疾病。根据治疗指南,心衰管理的常规治疗方法是给予血管紧张素转换酶抑制剂(acei)、β-肾上腺素能阻滞剂和利尿剂进行治疗。然而,长期使用这些化学药物可能会导致严重的副作用,如出现电解质紊乱、体液耗竭、低血压等。3.而人血管紧张素转化酶抑制剂ace i是由α-helix组成,在内部有一个底物结合区域,该区域是酶活中心,是抑制剂的结合区域。而目前用于临床应用的ace i抑制剂均是小分子化合物,由于小分子化合物与ace i的结合能力较弱,因此在临床上还需要金属离子辅助小分子化合物来作为人血管紧张素转化酶抑制剂进行使用,而由于金属离子的存在,会发生因不同体质的人群对药物的敏感性不同而出现药物过敏等副作用。技术实现要素:4.本发明的目的是针对现有技术的不足,从而提供一种人血管紧张素转化酶抑制剂和合成方法。5.为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案是:一种人血管紧张素转化酶抑制剂化合物,该化合物的结构式如式ⅰ所示[0006][0007]基于上述,该人血管紧张素转化酶抑制剂化合物是将式ⅱ所示的化合物中苯基对位上的氢原子被羟基取代,同时对其支链上的羰基进行修饰得到的,其中,式ⅱ所示的化合物是通过对能够结合在ace i蛋白的底物结合区进行虚拟筛选得到的[0008][0009]基于上述,式ⅱ所示的化合物的虚拟筛选步骤包括:[0010]步骤一、从pdb数据库(蛋白质结构数据库)中下载ace i蛋白的晶体结构,使用pymol去除分子中多余的水分子、化合物分子和多肽链,并计算化合物结合区的分子笼坐标;[0011]步骤二、从zinc12数据库中下载tcm database@taiwan数据集,以mol2格式保存化合物分子式,使用sybly-x读取tcm database@taiwan中天然化合物分子数据集,并进行3d转化和分子几何优化,优化后的天然化合物分子以mol2格式保存,然后对天然化合物分子的空间结构进行最低能量优化;[0012]使用ledock进行天然化合物分子的虚拟筛选,设置分子筛选标准将能够与ace i蛋白结合的化合物选出,分别使用pymol对选出的天然化合物分子与ace i蛋白进行结合状态分析、使用discovery studio计算天然化合物分子与ace i蛋白的结合自由能、使用itc测定天然化合物分子与ace i蛋白的结合常数kd值,并对筛选出的天然化合物分子进行评分,根据打分排序,得到式ⅱ所示的化合物。[0013]本发明还提供一种合成式ⅰ所示化合物的方法,包括以下步骤:[0014]步骤一:使用二碳酸二叔丁酯保护吡唑-1-甲脒的氨基集团后通过缩合反应获得到含中间产物一的溶液,该中间产物一的结构式如式ⅲ所示[0015][0016]步骤二:3-(4-羟基苯基)-1-丙醇缩合反应获得含中间产物二的溶液,该中间产物一的结构式如式ⅳ所示[0017][0018]步骤三:将步骤二制取的所述含中间产物二的溶液滴定在步骤一制取的所述含中间产物一的溶液中,在碳二亚胺、三氮唑、n,n-二甲基甲酰胺的催化下发生缩合反应,生成式ⅰ所示的化合物。[0019]基于上述,所述步骤一包括:在冰上,将吡唑-1-甲脒、二碳酸二叔丁酯和三乙胺以2.5:5.5:4比例进行混合,然后添加四氢呋喃和lih作为催化剂,在室温下反应5小时,随后加入n-(苄氧羰基)-1,4-丁二胺、乙腈、三乙胺并震荡反应4小时,最后加入pd-c和乙酸乙酯并进行搅拌,最后再充入氢气去除cbz保护基团,得到所述含中间产物一的溶液。[0020]基于上述,所述步骤二包括:将3-(4-羟基苯基)-1-丙醇溶解在ph为7.4的磷酸缓冲液中,然后向其中加入辣根过氧化物酶和h2o2,在45℃的温度条件下进行振摇处理使其发生缩合反应,获得所述含中间产物二的溶液。[0021]基于上述,所述步骤三包括:向步骤一制取的所述含中间产物一的溶液中加入碳二亚胺、三氮唑、n,n-二甲基甲酰胺,搅拌均匀后,再逐滴滴入步骤二制取的所述含中间产物二的溶液中并进行搅拌处理,随后再加入三氟乙酸去除boc保护基,反应结束后,在室温条件下蒸馏除去溶剂,并利用乙醇重结晶,得到式ⅰ所示化合物。[0022]具体地,式ⅱ所示的化合物为小分子化合物,可以结合到ace i分子的底物结合口袋中。该化合物结构为2,3-苯并呋喃的衍生物,c1链接苯环,c2、c5通过侧链链接胍基。为了提高该化合物的稳定性,通过将式ⅱ所示的化合物设中的苯基对位上的氢原子被羟基取代,同时对其支链上的羰基进行修饰得到的,从而得到了式ⅰ所示的化合物。[0023]与现有技术相比,本发明具有突出的实质性特点和显著的进步,具体地说,本发明针对目前用于医疗的ace i抑制剂均是小分子化合物,与ace i的结合能力较弱,需要金属离子的辅助,导致的因不同体质的人群对药物的敏感性不同而出现药物过敏等副作用的缺陷,提供了一种人血管紧张素转化酶抑制剂化合物和合成方法,该人血管紧张素转化酶抑制剂是从已知的zinc12数据库中筛选得到的。而本发明筛选修饰得到的化合物分子较大,是含有分支的化合物,可以完全结合ace i的底物结合区,抑制天然底物与ace i的结合,省略了现有的需要金属离子辅助小分子化合物来作为人血管紧张素转化酶抑制剂进行使用的步骤,降低了副作用。附图说明[0024]图1为重组表达的ace i纯化峰图。[0025]图2为重组ace i的sds-page电泳图。[0026]图3为筛选得到的式ⅱ所示的天然化合物分子与ace i蛋白itc实验。[0027]图4为式ⅰ所示的化合物与ace i蛋白结合示意图。具体实施方式[0028]下面通过具体实施方式,对本发明的技术方案做进一步的详细描述。[0029]本实施例通过一种人血管紧张素转化酶抑制剂化合物,该化合物的结构式如式ⅰ所示[0030][0031]具体地,该人血管紧张素转化酶抑制剂化合物是将式ⅱ所示的化合物中苯基对位上的氢原子被羟基取代,同时对其支链上的羰基进行修饰得到的,其中,式ⅱ所示的化合物是通过对能够结合在ace i蛋白的底物结合区进行虚拟筛选得到的[0032][0033]具体地,式ⅱ所示的化合物的虚拟筛选步骤包括:[0034]步骤一、从pdb数据库(蛋白质结构数据库)中下载ace i蛋白的晶体结构,使用pymol去除分子中多余的水分子、化合物分子和多肽链,并计算化合物结合区的分子笼坐标;[0035]步骤二、从zinc12数据库中下载tcm database@taiwan数据集,以mol2格式保存化合物分子式,使用sybly-x读取tcm database@taiwan中天然化合物分子数据集,并进行3d转化和分子几何优化,优化后的天然化合物分子以mol2格式保存,然后对天然化合物分子的空间结构进行最低能量优化;[0036]使用ledock进行天然化合物分子的虚拟筛选,设置分子筛选标准将能够与ace i蛋白结合的化合物选出,分别使用pymol对选出的天然化合物分子与ace i蛋白进行结合状态分析、使用discovery studio计算天然化合物分子与ace i蛋白的结合自由能、使用itc测定天然化合物分子与ace i蛋白的结合常数kd值,并对筛选出的天然化合物分子进行评分,根据打分排序,得到一种式ⅱ所示的化合物。[0037]本发明还提供一种合成式ⅰ所示化合物的方法,包括以下步骤:[0038]步骤一:使用二碳酸二叔丁酯保护吡唑-1-甲脒(praxadine)的氨基集团后通过缩合反应获得到含中间产物一(n-cbz-agmatinium)的溶液,该中间产物一的结构式如式ⅲ所示[0039][0040]步骤二:3-(4-羟基苯基)-1-丙醇(4-(3-hydroxypropyl)phenol)缩合反应获得含中间产物二(dihydrodehydroconiferyl)的溶液,该中间产物一的结构式如式ⅳ所示[0041][0042]步骤三:将步骤二制取的所述含中间产物二的溶液滴定在步骤一制取的所述含中间产物一的溶液中,在碳二亚胺、三氮唑、n,n-二甲基甲酰胺的催化下发生缩合反应,生成式ⅰ所示的化合物。[0043]具体反应过程如下:[0044]第一步:在冰上,吡唑-1-甲脒、二碳酸二叔丁酯和三乙胺以2.5:5.5:4比例混合,四氢呋喃和lih为催化,在室温反应5小时,随后加入n-cbz-diaminobutane,乙腈,三乙胺,然后震荡反应4小时,再加入pd-c和乙酸乙酯后搅拌溶液中充入氢气,获得到含中间产物一(n-cbz-agmatinium)的溶液。[0045]第二步:4-(3-hydroxypropyl)phenol溶解在phosphate buffer(ph 7.4),加入辣根过氧化物酶、h2o2、在45℃的温度条件下振摇进行缩合反应获得含中间产物二(dihydrodehydroconiferyl)的溶液。[0046]第三步:向所述含中间产物一的溶液加入碳二亚胺、三氮唑、n,n-二甲基甲酰胺,搅拌均匀后,再逐滴加入所述含中间产物二的溶液逐,同时搅拌溶液,随后加入三氟乙酸去除boc保护基,反应结束后在室温条件下蒸馏除去溶剂,乙醇重结晶得到生成式ⅰ所示的化合物。[0047]更具体地,合成式ⅰ所示化合物的方法,包括以下步骤:[0048]制备中间产物一:使用二碳酸二叔丁酯,在四氢呋喃和lih催化下在吡唑-1-甲脒(20mmol)的氨基连接boc保护氨基基团,加入n-cbz-diaminobutane、乙腈,三乙胺进行缩合反应生成中间产物,在氢气存在情况下加入pd-c和乙酸乙酯后搅拌溶液去除cbz保护基团。[0049]制备中间产物二:4-(3-hydroxypropyl)phenol(20mmol)在phosphate buffer(ph 7.4),加入辣根过氧化物酶、h2o2在45℃的温度条件下振摇进行缩合反应获得含有dihydrodehydroconiferyl的溶液。[0050]按照第三步,使用中间产物二缓慢滴定中间产物一,在碳二亚胺、三氮唑、n,n-二甲基甲酰胺的催化下缩合下生成式ⅰ所示的化合物,重结晶化合物晶体重量为4.89g,反应得率为81%。[0051]具体地,式ⅱ所示的化合物可以结合到ace i分子的底物结合口袋中。该化合物结构为2,3-苯并呋喃的衍生物,c1链接苯环,c2、c5通过侧链链接胍基。为了提高该化合物的稳定性,通过将式ⅱ所示的化合物设中的苯基对位上的氢原子被羟基取代,同时对其支链上的羰基进行修饰得到的,从而得到了式ⅰ所示的化合物。[0052]其中,如图1、图2、图3和图4所示,为例评价ace i蛋白与式ⅱ所示的天然化合物分子的亲和能力,需要制备大量的ace i蛋白。[0053]本实施例中,使用原核蛋白质表达系统重组表达ace i蛋白质,具体重组表达步骤如下:[0054]1、重组质粒pqe60-ace i的构建[0055]将pqe60载体(qiagen公司的产品)的ncoⅰ识别序列和bglⅱ识别序列间的dna分子替换为ace i蛋白质(68-656)的核酸序列,保持pqe60载体的其它序列不变,得到重组质粒pqe60-ace i。[0056]2、重组质粒pqe60-ace i的表达和纯化[0057]平衡液:含100mm nacl、50mm tris、10mm咪唑和0.1%(v/v)β-巯基乙醇的水溶液,ph值为8.5。[0058]洗涤液:含100mm nacl、50mm tris、10mm咪唑和0.1%(v/v)β-巯基乙醇的水溶液,ph值为8.5。[0059]洗脱液:含100mm nacl、50mm tris、350mm咪唑和0.1%(v/v)β-巯基乙醇的水溶液,ph值为8.5。[0060]裂解液:含200mm nacl、50mm的tris-hcl、10mm imidazole、0.1%(v/v)β-巯基乙醇和1mm pmsf的水溶液,ph值为8.5。[0061]1)、将重组质粒pqe60-ace i导入大肠杆菌c3016,得到工程大肠杆菌;[0062]2)、将步骤1得到的重组大肠杆菌接种于含200mg/l氨苄青霉素的lb液体培养基,37℃、2000rpm振荡培养,得到od600nm值约为0.8的培养菌液;[0063]3)、取步骤2得到的培养菌液,先冰浴放置30min,然后加入iptg,得到诱导体系;诱导体系中,iptg的浓度为0.5mmol/l;[0064]4)、取步骤3得到的诱导体系,14℃至18℃、200rpm振荡培养12-18h;[0065]5)、取完成步骤4的诱导体系,4000rpm离心15min,收集菌体;[0066]6)、用冰冷的裂解液重悬步骤5收集的菌体,然后在冰上超声破碎(超声功率400w,5s破碎5s间隙,共99次),得到菌体破碎液;[0067]7)、取步骤6得到的菌体破碎液,15000rpm离心30min,收集上清液;8)、取步骤7收集的上清液,0.45μm滤膜过滤,收集滤液;[0068]9)、取ni亲和层析柱(qiagen公司的产品),①用25ml平衡液洗脱(目的为平衡柱子),②加入步骤8收集的滤液,③用25ml洗涤液洗脱(目的为去除杂蛋白),④用20ml洗脱液洗脱,收集用洗脱液进行洗脱得到的过柱后溶液;[0069]10)、取步骤9收集的过柱后溶液,置于截留分子量为10kd的超滤浓缩管进行超滤浓缩,得到蛋白浓缩液;[0070]11)、取步骤10得到的蛋白浓缩液,使用superdex200分子筛柱(分子筛缓冲液:含100mm nacl和50mm tris的水溶液,ph值8.5)进行纯化,纯化后的蛋白浓缩为浓度为10mg/ml的蛋白溶液。[0071]对制得的蛋白溶液进行检测,检测结果如图1和图2所示,从图中可以看出,制取的ace i蛋白溶液具有很高的纯度。[0072]同时,采用itc测定式ⅱ所示的天然化合物分子与ace i蛋白的结合常数kd值,具体结果如图3所示,从图3中可以看出,式ⅱ所示的天然化合物分子与ace i蛋白具有较强的结合力,该化合物能作为人血管紧张素转化酶抑制剂进行应用的化合物。[0073]同时,从图4中可以看出,本发明提供的式ⅰ所示的含有分支大分子化合物,不需要金属离子辅助就可以完全结合ace i的底物结合区,抑制天然底物与ace i的结合,从而降低了人血管紧张素转化酶抑制剂的副作用。[0074]最后应当说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制;尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明,所属领域的普通技术人员应当理解:依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换;而不脱离本发明技术方案的精神,其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。









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