一株源自白酒酿造窖泥中的产丁酸型梭菌及其应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及一株源自白酒酿造窖泥中的产丁酸型梭菌及其应用，属于酿造微生物技术领域。背景技术：2.中国白酒分为浓香型、清香型、酱香型、凤香型和米香型五大香型以及特香型、豉香型、兼香型、药香型、老白干香型、芝麻香型和馥郁香型七小香型。浓香型白酒的市场份额占全国白酒行业的70％左右。浓香型白酒主要以谷物为原料，泥窖为发酵容器，采用多菌种自发发酵的固态发酵模式，经蒸馏、储存及勾调等制成的酒精饮料。窖泥中栖息着大量的酿酒功能性微生物，泥窖固态发酵是浓香型白酒发酵独特的生产工艺，窖泥微生物经过长期的连续的生产逐渐被驯化并趋于稳定。厚壁菌门、广古菌门、拟杆菌门是老熟窖泥和优质窖泥的优势微生物，这些菌群以及它们之间的相互作用建立起了窖泥独有的微生物体系，也赋予了窖泥微生物在浓香型白酒中的功能性和重要性，因此窖泥对浓香型白酒的酿造有着重要的影响。3.浓香型白酒过程是一种由多菌种共同进行发酵的固态发酵过程，丁酸菌、己酸菌、丙酸菌是窖泥中重要酿造功能微生物。丁酸菌所产丁酸是合成浓香型白酒中的重要酯类——丁酸乙酯的前体物质，同时丁酸和乙酸是浓香型白酒中主体己酸菌合成己酸的电子受体，可以促进己酸菌的己酸合成(wang h,guy,zhou w,zhao d,qiao z,zheng j,gao j,chen x,ren c,xu y.2021.adaptability of a caproate-producing bacterium contributes to its dominance in an anaerobic fermentation system.appl environ microbiol 87:e01203-21)。目前窖泥中分离出的产丁酸的主要为丁酸梭菌(clostridium butyricum)、酪丁酸梭菌(clostridium tyobutyricum)。目前所筛选窖泥中的产丁酸菌种，如酪丁酸梭菌会产少量异嗅物质4-甲基苯酚，以及可产较高含量的丁酸(4100mg/l左右)(cn201610677492.7，一株高产4-甲基苯酚的酪丁酸梭菌)。浓香型白酒需要一定含量的丁酸，酒醅中浓度约为1000mg/kg(jiangjing gao et al.,domination of pit mud microbes in the formation of diverse flavour compounds during chinese strong aroma-type baijiu fermentation.lwt-food science and technology 137(2021)110442)，其含量需保持在适当水平，过量会导致窖泥ph过低，且影响白酒口感。4.因此从白酒窖泥中分离不产异嗅物质如4-甲基苯酚和产适量的丁酸的丁酸菌对于浓香型白酒风味改善具有重要作用。另外一方面，目前所分离的丁酸菌培养需添加过多的外源营养物质，如葡萄糖、酵母粉、蛋白胨等，丁酸菌培养方式亟需与大生产需求相适配，如从窖泥中挖掘能利用生产原料如高粱、大曲中营养物质生长的丁酸菌。技术实现要素：5.本发明从白酒老窖泥中筛选得到一株解淀粉梭菌，经鉴定不产生4-甲基苯酚，在高粱水解液中具有良好生长能力，且能在以大曲作为氮源条件下发酵高粱水解液产丁酸。6.本发明提供了一株源自白酒酿造窖泥的产丁酸型梭菌(clostridium amylolyticum lbm11027)及其应用。该菌株可利用葡萄糖、麦芽糖以及白酒酿造原料高粱发酵产挥发性脂肪酸丁酸和乙酸，为白酒提供了重要风味化合物以及相应的酯类前体物质。同时clostridium amylolyticum lbm 11027菌株可利用大曲粉而生长，在以大曲粉替代传统使用的酵母粉和蛋白胨氮源的培养基上，该菌也可以保持产丁酸能力。7.本发明的第一个目的是提供一株产丁酸型梭菌，分类学名称为clostridium amylolyticum，已于2021年12月24日保藏于于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号gdmcc no.62164，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。本发明将其命名为clostridium amylolyticum lbm 11027。8.本发明的clostridium amylolyticum lbm 11027，具有如下特性：9.(1)从浓香型白酒窖泥中筛选分离；10.(2)严格厌氧，菌落为白色光滑圆形，细胞为杆状；11.(3)不产生4-甲基苯酚；12.(4)代谢产物包含丁酸和乙酸；产量可达丁酸1300mg/l，乙酸630mg/l；13.(5)可利用白酒酿造原料高粱作为碳源，以大曲粉作为氮源；14.(6)16s rrna序列如seq id no:1所示。15.所述解淀粉梭菌(clostridium amylolyticum lbm 11027)的筛选，具体是：在mci寡培养基上富集培养，并进行菌株的纯培养分离纯化所得，通过对其得16s rrna序列进行blast分析，将该菌种鉴定为clostridium amylolyticum lbm 11027。16.本发明的第二个目的是提供含有clostridium amylolyticum lbm 11027菌株的微生物菌剂。17.本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中含菌株clostridium amylolyticum lbm11027的活细胞、冷冻干燥的菌体、固体化细胞中的一种或多种。18.本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为液体菌剂或固体菌剂。19.本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为微生物冻干菌粉。20.本发明提供了微生物冻干菌粉，所述冻干菌粉实施方式按如下步骤制备：将clostridium amylolyticum lbm 11027活化后，接种至葡萄糖培养基中，于35-38℃厌氧培养20-26h获得活性较高的菌悬液；将得到的菌悬液离心收集菌体，添加脱脂牛奶作为冻干保护剂，混匀后进行真空冷冻干燥，获得冻干菌粉。21.所述葡萄糖液体培养基的成分为(l-1)：葡萄糖为10-11g/l，硫酸铵2-3g，无水磷酸氢二钾1-2g，无水磷酸二氢钾0.5-1g，蛋白胨5-6g，酵母粉5-6g，七水合硫酸镁0.1-0.2g，七水合硫酸亚铁0.01-0.02g，一水合硫酸猛0.01-0.02g，氯化钙0.01-0.02g，硫酸锌0.02-0.03g，氯化钴0.02-0.03g，ph为7-7.3。22.本发明的第三个目的是提供所述解淀粉梭菌(clostridium amylolyticum lbm 11027)在酿造食品领域中的应用。23.在本发明的是一种实施中，所述应用是将clostridium amylolyticum lbm 11027用于白酒酿造菌剂的制备。24.在本发明的一种实施中，所述应用是解淀粉梭菌clostridium amylolyticum lbm 11027在多种碳源和多种氮源中的应用。25.在本发明的一种实施中，所述碳源为葡萄糖、麦芽糖和高粱水解液中的任意一种以上。26.所述的高粱水解液的制作方法如下：第一步：称取高粱200g，后用1000ml去离子水浸泡过夜(4度冰箱)，再研磨2min；第二步：淀粉糊化；利用naoh或hcl调ph 6.3，称取0.05g淀粉酶用温水溶解，加入原料中，105℃30min高压灭菌；第三步：蒸煮；煮至糖度至12bx左右，利用阿贝折光仪检测；第四步：冷却至60度，利用naoh或hcl调ph 4.3，添加0.06g糖化酶，放置60℃培养箱至少一小时；第五步：待糖度不在变化时，冷却至50℃，调节ph 10，添加碱性蛋白酶，放置50℃烘箱一小时；第六步：过滤、离心、取上清液保存至负20℃冰箱。27.本发明的第四个目的是提供所述解淀粉梭菌clostridium amylolyticum lbm 11027在发酵生产丁酸和/或乙酸的应用。28.在本发明的一种实施中，所述发酵是以葡萄糖和/或麦芽糖和/或高粱水解液为主要碳源。29.在本发明的一种实施中，所述发酵具体是：将所述clostridium amylolyticum lbm 11027在培养基中培养至对数期后，接种于培养基中，37℃厌氧培养18-24h。30.本发明中的一种实施方式中，所述发酵使用的培养基的成分为(/l)：硫酸铵2-3g，无水磷酸氢二钾1-2g，无水磷酸二氢钾0.5-1g，蛋白胨5-6g，酵母粉5-6g，七水合硫酸镁0.1-0.2g，七水合硫酸亚铁0.01-0.02g，一水合硫酸猛0.01-0.02g，氯化钙0.01-0.02g，硫酸锌0.02-0.03g，氯化钴0.02-0.03g，ph为7-7.3，碳源为10-11g/l。31.有益效果32.(1)本发明提供的解淀粉梭菌clostridium amylolyticum lbm 11027来源于浓香型白酒酿造窖泥，具有不产异嗅物质如4-甲基苯酚的特点；具有产丁酸和乙酸能力，且可利用葡萄糖和麦芽糖为碳源，产生丁酸和乙酸。33.(2)解淀粉梭菌lbm 11027菌株，能发酵白酒酿造淀粉质原料水解液，产生丁酸和乙酸。34.(3)解淀粉梭菌lbm 11027菌株，能在以大曲粉为替代氮源的培养基上进行生长，产生丁酸和乙酸。35.生物材料保藏36.解淀粉梭菌lbm 11027，分类学名称为clostridium amylolyticum，已于2021年12月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no.62164。附图说明37.图1：clostridium amylolyticum lbm 11027形态。38.图2：clostridium amylolyticum lbm 11027利用葡萄糖的生长(a)、底物消耗(b)、主要代谢产物(乙酸c和丁酸d)。39.图3：clostridium amylolyticum lbm 11027利用麦芽糖的生长(a)、底物消耗(b)、主要代谢产物(乙酸c和丁酸d)。40.图4：clostridium amylolyticum lbm 11027利用白酒酿造原料高粱的生长(a)、底物消耗(b)、主要代谢产物(乙酸c和丁酸d)。41.图5：clostridium amylolyticum lbm 11027利用大曲粉和高粱水解液的代谢产物。具体实施方式42.下面结合具体实施例对本发明进行具体描述。43.下面实施例中所涉及的培养基如下：44.富集/筛菌mci寡培养基(l-1)：酵母粉1～2g，蛋白胨1～2g，矿物质元素溶液50～60ml，微量元素溶液1～2ml，b族维生素溶液5～6ml和半胱氨酸溶液10～11ml。维生素、半胱氨酸溶液都灭菌后添加。微量元素溶液(l-1)含znso4·7h2o 0.1～0.2g，mncl20.03～0.04g，h3bo30.3～0.4g，cocl2·6h2o 0.2～0.3g，cacl20.01～0.02g，nicl2·6h2o 0.02～0.03g，na2moo40.03～0.04g和fecl2·4h2o 1.5～2g。矿物质元素溶液(l-1)含kh2po410～11g，mgcl2·6h2o 6.6～7g，nacl 8～9g，nhcl48～9g和cacl21～2g。b族维生素溶液(l-1)含烟酸20～21mg，钴胺素20～21mg，盐酸硫铵10～11mg，对氨基苯甲酸10～11mg，盐酸吡哆酸50～60mg和泛酸钙5～6mg。45.mci固体培养基：以mci液体培养基为基础，添加2％的琼脂。46.葡萄糖(或麦芽糖)液体培养基成分为(/l)：硫酸铵2-3g，无水磷酸氢二钾1-2g，无水磷酸二氢钾0.5-1g，蛋白胨5-6g，酵母粉5-6g，七水合硫酸镁0.1-0.2g，七水合硫酸亚铁0.01-0.02g，一水合硫酸猛0.01-0.02g，氯化钙0.01-0.02g，硫酸锌0.02-0.03g，氯化钴0.02-0.03g，ph为7-7.3。葡萄糖(或麦芽糖)为碳源，添加终浓度为10-11g/l。固体以上述液体培养基为基础，添加2％的琼脂。47.大曲粉：宜宾五粮液股份有限公司制曲车间提供。48.实施例1：clostridium amylolyticum lbm 11027的分离与鉴定49.(1)寡培养富集培养：在37℃厌氧箱中称取5-6g窖泥样品于100ml mci培养基中，富集培养15-20d，用于后续筛菌。50.(2)筛菌：将富集培养好的窖泥混菌体系，采用梯度稀释得方法(10-2、10-3、10-4、10-5、10-6)将获得的窖泥混菌体系培养液涂布于mci固体培养基上，于37℃厌氧箱中培养5-7d后，挑取典型单菌落，接种至mci液体培养基中培养12-24h。51.(3)菌株鉴定：52.1)形态：取培养12-24h后的纯菌菌液10μl于载玻片，后利用光学显微镜，确定菌株形状为短杆状(如图1)。53.2)分子鉴定：利用细菌16s rrna基因的通用引物(27f，1492r)对所在液体培养基培养的微生物进行pcr扩增，后通过ncbi的blast比对，确定分其类地位。54.所用引物：55.27f：agagtttgatcctggctcag(seq id no:2)56.1492r：ggttaccttgttacgactt(seq id no:3)57.pcr扩增反应体系：27f 0.5μl、1492r 0.5μl、高保真酶primer star 12.5μl、灭菌超纯水10.5μl和菌液1μl。58.pcr反应条件：预变性98℃2min；第一次变性95℃10s；第二步退火55℃30s；第三步产物延伸72℃1min；第一步至第三步循环30次；第四步产最后延伸72℃10min；第五步保持16℃4min。59.纯化：根据pcr结果确定菌株分类学地位，将目标菌株培养液涂布于mci固体培养基上，纯化获得单菌落。测序结果序列如seq id no.1所示。60.按照上述方法获得了性能优良的clostridium amylolyticum lbm 11027，将得到菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no.62164，保藏时间为2021年12月24日。61.实施例2：clostridium amylolyticum lbm 11027应用于葡萄糖发酵产丁酸和乙酸62.具体步骤如下：63.(1)将实施例1中得到的clostridium amylolyticum lbm 11027接种至葡萄糖液体培养基中，三个平行。在37℃厌氧箱培养8h，即得到一级种子液，后继续转接直至培养到三级种子液。64.(2)取步骤(1)中的三级种子液，按照10％(v/v)接种比例分别接种于不同浓度氮源的葡萄糖培养基中，在37℃厌氧箱中发酵24h，在0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h取样，后利用气相色谱进行产物检测以及利用分光光度计进行生长检测。65.(3)步骤(2)所述不同浓度氮源为：高氮源的葡萄糖液体培养基：5g/l蛋白胨，5g/l酵母粉；低氮源的葡萄糖液体培养基：2g/l蛋白胨，1g/l酵母粉。66.结果如图2所示，在0-12h解淀粉梭菌clostridium amylolyticum lbm 11027位于生长旺盛期，发酵12-24h逐渐到稳定期。在高浓度氮源葡萄糖液体培养基中clostridium amylolyticum lbm 11027可发酵产生1324mg/l的丁酸和606mg/l的乙酸。在低浓度氮源葡萄糖液体培养基中clostridium amylolyticum lbm 11027可发酵产生597mg/l的丁酸和271mg/l的乙酸。同时经gc-ms检测，该菌株不产4-甲基苯酚。67.实施例3：clostridium amylolyticum lbm 11027应用于发酵麦芽糖产丁酸和乙酸68.具体步骤如下：69.(1)将实施例1中得到的clostridium amylolyticum lbm 11027接种于葡萄糖液体培养基中，在37℃厌氧箱培养8h，即得到一级种子液，后继续转接直至培养到三级种子液。70.(2)取步骤(1)中的三级种子液，按照10％(v/v)接种比例分别接种于不同浓度氮源的麦芽糖培养基中，在37℃厌氧箱中发酵24h，在0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h取样，后利用气相色谱进行产物检测以及利用分光光度计进行生长检测。71.(3)步骤(2)所述的不同浓度氮源培养基如下：高氮源的麦芽糖液体培养基：5g/l蛋白胨，5g/l酵母粉；低氮源的麦芽糖液体培养基：2g/l蛋白胨，1g/l酵母粉。72.结果如图3所示，在0-6h解淀粉梭菌clostridium amylolyticum lbm 11027处于生长旺盛期，发酵6-24h逐渐到稳定期。在高浓度氮源的麦芽糖液体培养基中clostridium amylolyticum lbm 11027可发酵产生597mg/l的丁酸和345mg/l的乙酸。在低浓度氮源的麦芽糖液体培养基中clostridium amylolyticum lbm 11027可发酵产生279mg/l的丁酸和164mg/l的乙酸。该菌具有的麦芽糖利用能力对于在“边糖化，边发酵”的白酒发酵体系中的有效生长和代谢具有重要作用。73.实施例4：clostridium amylolyticum lbm 11027应用于白酒酿造原料高粱水解液发酵产丁酸和乙酸74.具体步骤如下：75.(1)将实施例1中得到的clostridium amylolyticum lbm 11027接种葡萄糖液体培养基中，在37℃厌氧箱培养8h，即得到一级种子液，后继续转接直至培养到三级种子液。76.(2)取步骤(1)中的三级种子液，按照10％(v/v)接种比例分别接种于高粱水解液培养基中，在37℃厌氧箱中发酵24h，在0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h取样，后利用气相色谱进行产物检测以及利用分光光度计进行生长检测。77.(3)步骤(2)所述高粱水解液培养基为：高粱水解液、5g/l蛋白胨和20g/l大曲粉(宜宾五粮液股份有限公司制曲车间提供)，且高粱水解液的还原糖浓度为10-12g/l。其中，高粱水解液的制作方法如下：第一步：称取高粱200g，后用1000ml去离子水浸泡过夜(4度冰箱)，再研磨2min；第二步：淀粉糊化；利用naoh或hcl调ph 6.3，称取0.05g淀粉酶用温水溶解，加入原料中，105℃30min高压灭菌；第三步：蒸煮；煮至糖度至12bx左右，利用阿贝折光仪检测；第四步：冷却至60度，利用naoh或hcl调ph 4.3，添加0.06g糖化酶，放置60℃培养箱至少一小时；第五步：待糖度不在变化时，冷却至50℃，调节ph 10，添加碱性蛋白酶，放置50℃烘箱一小时；第六步：过滤、离心、取上清液保存至负20℃冰箱。所述的高粱水解液的还原糖浓度的测试方法为二硝基水杨酸法(dns)。78.结果如图4所示，在0-6h梭菌clostridium amylolyticum lbm 11027处于生长旺盛期，发酵6-24h逐渐到稳定期。在高粱水解液培养基中clostridium amylolyticum lbm 11027可发酵产生605mg/l的丁酸和265mg/l的乙酸。79.实施例5：clostridium amylolyticum lbm 11027以大曲粉为氮源，发酵高粱水解液产丁酸和乙酸80.具体步骤如下：81.(1)将实施例1中得到的clostridium amylolyticum lbm 11027接种含葡萄糖液体培养基中，在37℃厌氧箱培养8h，即得到一级种子液，后继续转接直至培养到三级种子液。82.(2)取步骤(1)中的三级种子液，按照10％(v/v)接种比例分别接种于不同浓度大曲粉的高粱水解液培养基中，在37℃厌氧箱中发酵24h，在0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h取样，后利用气相色谱进行产物检测以及利用分光光度计进行生长检测。所述的不同浓度大曲粉的高粱水解液培养基为：高浓度大曲粉的高粱水解液培养基：高粱水解液和20g/l的大曲粉。中浓度大曲粉高粱水解液培养基：高梁水解液和10g/l大曲粉。低浓度大曲粉高粱水解液培养基：高粱水解液和5g/l大曲粉。高粱水解液的制备方法同实施例4，其可溶性还原糖浓度为10～12g/l。83.(3)步骤(3)所述的高粱水解液的可溶性还原糖浓度的测试方法为二硝基水杨酸法(dns)。84.结果如图5所示，在高浓度大曲粉高粱水解液培养基(20g/l)中clostridium amylolyticum lbm 11027可发酵产生251mg/l丁酸；在中浓度大曲粉高粱水解液培养基(10g/l)中clostridium amylolyticum lbm 11027可发酵产生159mg/l丁酸；而在低浓度大曲粉高粱水解液培养基(5g/l)中clostridium amylolyticum lbm 11027可发酵产生的丁酸低于定量限。可见，添加2％(终浓度20g/l)的大曲粉可以替代酵母粉和蛋白胨促进lbm 11027菌株发酵高粱水解液中的还原糖产生丁酸。且在仅含有高粱水解液和大曲粉中乙酸的含量都低于定量限制。85.实施例6：clostridium amylolyticum lbm 11027菌剂的制备86.具体步骤如下：87.(1)clostridium amylolyticum lbm 11027的活化88.将实施例1得到的clostridium amylolyticum lbm 11027接种于含葡萄糖培养基中，在37℃厌氧箱培养8h，得到一级种子液，后按照每代10％的接种比例逐级扩大培养至三代，即可获得三级种子液。89.(2)取步骤(1)中的种子液，按照10％(v/v)接种比例接种于100ml葡萄糖液体培养基中，在37℃厌氧箱中发酵培养8h。后取菌液在4℃8000rpm离心10min收集菌体，于厌氧箱内按菌体含量添加冻干保护剂(脱脂牛奶)，混匀均匀后进行真空冷冻干燥，最后熔封得冻干微生物菌剂。90.菌剂具体制备方法为：clostridium amylolyticum lbm 11027菌体与脱脂牛奶按照5:1的比例混匀，即500ml发酵液对应100ml脱脂牛奶，分装于玻璃培养皿中，每个培养皿分装100ml，使用保鲜膜封口，在-80℃预冻2h，预冻后使用真空冷冻干燥机，在66.66pa的真空度下，冷冻干燥24h，即得含clostridium amylolyticum lbm 11027的固体菌剂。91.seq list92.seq id no.193.catgcaagtcgagcgagggagtttcttcggaaacaacctagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgccttgaagtgggggatagccctccgaaaggaggattaataccgcataacatcagtacatcgcatgatgaattgattaaaggagtaatccgcttcaagatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagcaacgccgcgtgagtgatgaaggccttcgggttgtaaagctctgtcttcagggacgataatgacggtacctgaggaggaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttactgggcgtaaagggagtgtaggcggatacttaagtcagatgtgaaatacccgggctcaacttgggtgctgcatttgaaactgggtatctagagtgcaggagaggaaagtggaattcctagtgtagcggtgaaatgcgtagagattaggaagaacaccagtggcgaaggcgactttctggactgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgggtactaggtgtgggaggtatcgactccttccgtgccgccgttaacacaataagtaccccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctagacttgacatctcctgaattacccttaatcggggaagcccttcggggcaggaagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctattgttagttgctaccattaagttgagcactctagcgagactgcccgggtgaaccgggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtctagggctacacacgtgctacaatggcgagtacaacgagacgcaataccgcgaggtggagcaaaacttaaaaaactcgtcccagttcggattgtaggctgaaactcgcctacatgaagccggagttgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagttggcaatacccgaagtccgtgaggtaaccgtaaggagccagc94.seq id no:2：agagtttgatcctggctcag95.seq id no:3：ggttaccttgttacgactt96.本发明以最佳实施例公开如上，但其并非以限定本发明，任何熟悉此技术，在不脱离本发明的范围内都可进行修改，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。









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