五味子乙素在制备离体生物样本保存液中的应用的制作方法

农业,林业,园林,畜牧业,肥料饲料的机械,工具制造及其应用技术1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及五味子乙素在制备离体生物样本保存液中的应用。背景技术：2.随着器官移植的研究与应用，低温保存液由于使用简单，保存操作步骤简单易行，对环境要求低，满足于运输和移植中所要求的短期保存要求，使用范围越来越广泛。在低温条件(0～4℃)下，细胞内酶活性低、细胞代谢慢，细胞及组织器官可以保存于低温条件下延长存活时间，提高细胞保存效果。3.传统低温保存方法是将已分离细胞、组织和器官等直接保存于低温下，如4℃，但这种保存方法会导致在低温保存后细胞存活率下降，细胞膜皱缩，细胞结构遭到严重损伤，无法在复苏后存活。4.在临床医疗中，在短时间内保存细胞时，往往使用生理盐水来维持细胞活性，然而细胞在生理盐水中活性降低速度快，细胞保存效果不理想。5.随着技术进步，越来越多的研究者使用特殊的低温保存液来保存离体器官/组织。国际上通用的器官保存液为1987年研发的威斯康星大学保存液(uw液)和组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐溶液(htk液)。传统细胞低温保存液大多借鉴和采用器官/组织低温保护液和灌洗液，例如htk液、uw液、collins液等。其中，uw液因其优异表现成为器官保存的“金标准”，但是价格昂贵、高黏度、高钾、稳定性不足等特点也限制了uw液的使用范围。6.因此，降低低温保存液的成本同时提高细胞的存活率是改进传统低温保存液的难点。技术实现要素：7.为了解决上述问题，本发明的第一目的在于提供五味子乙素在制备离体生物样本保存液中的应用，以在降低低温保存液的制备成本和保存成本的同时提高低温保存后细胞的存活率。8.本发明的第二目的在于提供一种离体生物样本保存液，含有五味子乙素，以及生物样本保存所需的能量底物、ph缓冲剂、渗透压维持剂、渗透压调节剂和盐类物质中的至少一种。9.本发明的一种实现方式中，保存液中五味子乙素的浓度为0.02g/l～0.04g/l。10.本发明的一种实现方式中，保存液还包括以下各组分：[0011][0012][0013]本发明的一种实现方式中，保存液包括：[0014][0015]本发明的一种实现方式中，复方氨基酸水溶液为复方氨基酸原液和水的混合液。[0016]本发明的一种实现方式中，复方氨基酸原液和保存液的体积比为(1～3)：100；和/或[0017]复方氨基酸原液含有质量百分比为10％的复方氨基酸；和/或[0018]复方氨基酸原液为复方氨基酸注射液18aa。[0019]本发明的一种实现方式中，保存液的渗透压为280～310m0sm/kg。[0020]本发明的一种实现方式中，保存液的ph值为7.2～7.4。[0021]本发明的第三目的在于提供一种离体生物样本保存方法，将离体生物样本置于上述保存液中低温保存。[0022]本发明的一种实现方式中，低温保存的温度为0～4℃。[0023]本发明的一种实现方式中，离体生物样本为肝细胞样本和肝脏组织样本中的至少一种。[0024]本发明创新性地将五味子乙素应用于细胞保存液，使得保存液具有抑制细胞凋亡、稳定细胞膜和清除自由基等保护功能，在低温状态下能够维持离体生物样本的细胞活性，减少氧化应激损伤，克服低温环境下传统细胞培养液存在活力低下、易大量溶胀死亡的缺陷，使得保存液能够在低温下保持细胞活性，并且具有制备方法简单，便于运输和保存的优点，能够降低保存液的制备成本和运输成本。附图说明[0025]图1为本发明实施例5提供的台盼蓝染色法测存活率的染色结果示意图；[0026]图2为本发明实施例5提供的保存液中ast含量以及肝脏组织sod含量检测结果示意图。具体实施方式[0027]现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。[0028]因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。[0029]如上文，低温保存对细胞造成的伤害主要有以下几个方面：细胞膜流动性减小，细胞膜损伤引起细胞膨胀，环境压力造成氧化损伤，生成大量脂质过氧化物导致细胞坏死和凋亡等。传统保存方法或使用普通生理盐水，保存后细胞存活率低，或保存液昂贵、成分不稳定，导致低温保存成本高。[0030]为了至少部分解决上述技术问题的至少一个，本发明的第一方面提供了五味子乙素在制备离体生物样本保存液中的应用，五味子乙素使得保存液具有抑制细胞凋亡、稳定细胞膜和清除自由基等保护功能，在低温状态下能够维持离体生物样本的细胞活性，减少氧化应激损伤，使得保存液能够在低温下保持细胞活性，并且具有制备简单，便于运输和保存的优点，能够降低保存液的制备成本和运输成本。[0031]本发明的第二方面提供了一种离体生物样本保存液，含有五味子乙素，以及生物样本所需的能量底物、ph缓冲剂、渗透压维持剂、渗透压调节剂和盐类物质中的至少一种，使得离体生物样本在较长时间保存和运输中，能够维持细胞的存活率及活力；其中，五味子乙素在低温状态下能够维持离体生物样本的细胞活性，减少氧化应激损伤，保持细胞膜形态完整，从而使得保存液能够在低温下保存离体生物样本，减少离体生物样本中的细胞调亡现象，提高离体身生物样本中细胞的存活率，并且具有制备简单，便于运输和保存的优点，能够降低保存液的制备成本和运输成本。[0032]其中，五味子乙素的浓度为为0.02g/l～0.04g/l，进一步为0.03g/l～0.04g/l，以实现更好的低温保存效果。[0033]一些实施方案中，保存液还包括以下各组分：5g/l～6g/l氯化钠，0.3g/l～0.5g/l氯化钾，0.01g/l～0.03g/l氯化钙，0.8g/l～1g/l磷酸氢二钠，0.18g/l～0.23g/l硫酸镁，0.4g/l～1.2g/l碳酸氢钠，45g/l～55g/l右旋糖酐40，3.1g/l～4.0g/l甘露醇，1g/l～1.6g/l葡萄糖，4g/l～5.5g/lhepes，1g/l～1.5g/l腺苷，0.7g/l～1g/ld-海藻糖，0.04g/l～0.07g/l还原型谷胱甘肽，0.1g/l～0.3g/l维生素c以及复方氨基酸水溶液。[0034]本发明利用上述配方中的各成分构成细胞所需基本盐类、ph缓冲剂、冬眠保护剂、能量底物、清除代谢产物的清除剂、胶体渗透压维持剂等，形成了成分稳定、营养物质多元、溶液渗透体系缓冲力强的肝细胞保存液。利用本发明的保存液保存细胞或器官时，保存液不仅可以为细胞提供营养，提供合适的渗透压防止低温引起的细胞水肿，以及通过缓冲体系纠正细胞内酸中毒，还能很好的维持细胞活性，减少肝细胞的氧化损伤，提高细胞低温保存后的存活率。[0035]本发明保存液中的还原型谷胱甘肽、海藻糖，是离体细胞低温保存的良好保护剂，可以通过清除氧自由基、抑制钙通道、增加细胞膜的稳定性和抑制低温引起的细胞凋亡等渠道来保护低温保存中的离体细胞；葡萄糖、腺苷向细胞提供能量；非co2依赖性缓冲对可以减少在运输中及与空气暴露的过程中保存液对于co2的依赖，减少保存液ph值的波动；五味子乙素具有抗炎、清除自由基、抗氧化功效。本发明优化了低温保存液配方，通过低温保存方法维持细胞的生物学活性及特异性功能；同时，在4℃下低温保存情况下，细胞运输和保存过程中不需要任何营养和氧气供给，操作简单可行，为离体细胞的保存和运输带来便利，也可以用于肝移植供体肝脏的体外静态冷保存。[0036]一些实施方案中，复方氨基酸水溶液包括复方氨基酸原液和水的混合液，用于为细胞保存提供多元营养物质。[0037]一些具体实施方案中，复方氨基酸原液含有质量百分比为10％的复方氨基酸，复方氨基酸原液为复方氨基酸注射液18aa，复方氨基酸原液和保存液的体积比为(1～3)：100，进一步为20：100，以与保存液中上述其他成分复配，用于为细胞保存提供多元营养物质。[0038]一些实施方案中，保存液包括以下各组分：5.5g/l～6g/l氯化钠，0.4g/l～0.5g/l氯化钾，0.02g/l～0.03g/l氯化钙，0.9g/l～1g/l磷酸氢二钠，0.2g/l～0.23g/l硫酸镁，0.8g/l～1.2g/l碳酸氢钠，50g/l～55g/l右旋糖酐40，3.6g/l～4.0g/l甘露醇，1.3g/l～1.6g/l葡萄糖，4.8g/l～5.5g/lhepes，1.2g/l～1.5g/l腺苷，0.8g/l～1g/ld-海藻糖，0.06g/l～0.07g/l还原型谷胱甘肽，0.2g/l～0.3g/l维生素c，0.03g/l～0.04g/l五味子乙素以及复方氨基酸水溶液。一些具体实施方案中，保存液包括：6g/l氯化钠，0.5g/l氯化钾，0.02g/l氯化钙，0.8g/l磷酸氢二钠，0.2g/l硫酸镁，0.5g/l碳酸氢钠，52g/l右旋糖酐40，3.7g/l甘露醇，1.5g/l葡萄糖，4.8g/lhepes，1g/l腺苷，1g/ld-海藻糖，0.05g/l还原型谷胱甘肽，0.1g/l维生素c，0.03g/l五味子乙素以及复方氨基酸水溶液，以使得保存液具有更好的保存效果。[0039]本发明的保存液的渗透压为280m0sm/kg～310m0sm/kg，进一步可以为290m0sm/kg～310m0sm/kg，更进一步可以为300m0sm/kg～310m0sm/kg，能够避免因渗透压问题导致细胞溶胀而大量死亡的现象；保护液的ph值为7.2～7.4，进一步为7.3～7.4，能够保持保存液的缓冲力，为细胞在低温下生存提供合理的ph空间。[0040]本发明的第三方面提供了一种离体生物样本保存方法，包括将离体生物样本置于上述保存液中低温保存，本发明的保存液能够缓解低温环境对细胞造成的细胞膜流动性减小，细胞膜损伤引起细胞膨胀，环境压力造成氧化损伤，生成大量脂质过氧化物导致细胞坏死和凋亡等情况，维持细胞膜形态，减少细胞氧化损伤，从而提高细胞在低温环境下的细胞活性。[0041]一些具体实施方案中，低温保存的温度为0～4℃，进一步可以为2～4℃，具体可以为3℃，对于0～4℃的低温环境对细胞造成的损伤，本发明的保存液能够实现较佳的活性保持效果。[0042]一些实现方案中，离体生物样本为肝细胞样本和肝脏组织样本中的至少一种，可以理解的是，保存液可以用于对离体肝细胞样本的低温运输保存，也可以用于肝移植过程中肝脏组织的静态低温保存。[0043]因此，本发明的第四方面还提供了一种离体生物样本的保存液的制备方法如下：按照上述保存液中各组分的浓度将各组分用水溶解、搅拌混匀得混合溶液，调节混合溶液的ph值为7.2-7.4，渗透压为280m0sm/kg～310m0sm/kg，得到上述离体生物样本保存液。[0044]一些具体实施例中，还需对上述离体生物样本保存液进行除菌操作。具体地，配制完成使用(0.22μm)无菌pes过滤器过滤除菌即得肝细胞保存液，放置于4度冰箱避光保存备用，0.22μm无菌pes过滤器过滤除菌后，抽取样本做细菌培养检查。本发明的保存液在提高细胞存活率的同时还具有制备方法简单，便于运输和保存的优点，能够降低保存液的制备成本和运输成本。[0045]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。[0046]本发明以下实施例涉及的试剂均通过常规商业途径获得。[0047]实施例1[0048]本实施例提供了一种细胞保存液，1000ml保存液中含有以下各组分：6g/l的氯化钠、0.5g/l的氯化钾、0.02g/l的氯化钙、0.8g/l的磷酸氢二钠、0.2g/l的硫酸镁、48g/l的右旋糖酐40、3.9g/l的甘露醇、1.5g/l的葡萄糖、4g/l的hepes、1g/l的腺苷、0.05g/l的还原型谷胱甘肽、0.1g/l的维生素c和补充10％复方氨基酸20ml，余量为无菌注射用水或双蒸水。药品搅拌混匀得混合溶液调节细胞缓冲液的ph为7.4。[0049]实施例2[0050]本实施例提供了一种细胞保存液，1000ml保存液中含有以下各组分：：6g/l的氯化钠、0.5g/l的氯化钾、0.02g/l的氯化钙、0.8g/l的磷酸氢二钠、0.2g/l的硫酸镁、0.5g/l的碳酸氢钠、52g/l的右旋糖酐40、3.7g/l的甘露醇、1.5g/l的葡萄糖、4.8g/l的hepes、1g/l的腺苷、1g/l的海藻糖、0.05g/l的还原型谷胱甘肽、0.1g/l的维生素c、0.02g/l的五味子乙素和补充10％复方氨基酸15ml，余量为无菌注射用水或双蒸水。搅拌混匀得混合溶液调节细胞缓冲液的ph为7.2。[0051]实施例3[0052]本实施例提供了一种细胞保存液，1000ml保存液中含有以下各组分：：6g/l的氯化钠、0.5g/l的氯化钾、0.02g/l的氯化钙、0.8g/l的磷酸氢二钠、0.2g/l的硫酸镁、0.5g/l的碳酸氢钠、50g/l的右旋糖酐40、3.7g/l的甘露醇、1.5g/l的葡萄糖、4.7g/l的hepes、1g/l的腺苷、1g/l的海藻糖、0.05g/l的还原型谷胱甘肽、0.1g/l的维生素c、0.02g/l盐酸川芎嗪和补充10％复方氨基酸15ml，余量为无菌注射用水或双蒸水。药品搅拌混匀得混合溶液调节细胞缓冲液的ph为7.3。[0053]实施例4[0054]本实施例提供了一种细胞保存液，1000ml保存液中含有以下各组分：：6g/l的氯化钠、0.5g/l的氯化钾、0.02g/l的氯化钙、0.8g/l的磷酸氢二钠、0.2g/l的硫酸镁、1g/l的碳酸氢钠、52g/l的右旋糖酐40、3.7g/l的甘露醇、1.5g/l的葡萄糖、4.7g/l的hepes、1g/l的腺苷、0.05g/l的还原型谷胱甘肽、0.15g/l的维生素c、0.02g/l的儿茶素和补充10％复方氨基酸15ml，余量为无菌注射用水或双蒸水。药品搅拌混匀得混合溶液调节细胞缓冲液的ph为7.3。[0055]对实施例1～实施例4的保存液进行48h细胞活性实验。待细胞生长达到对数生长期时，消化收集细胞，调整细胞密度为2×105/ml，接种在六孔培养板中，每孔加液量达2ml，37℃二氧化碳培养箱贴壁培养24小时后待细胞生长达到80％汇合度。吸除原先各孔培养液，pbs 2ml冲洗。分别加入2ml实施例1～实施例4中的保护液，置于2℃～8℃环境中保存48小时。分别取样进行台盼蓝(trypan blue)染色，测定细胞存活率，结果如表1所示。[0056]表1[0057]分组48h存活率实施例173.8％实施例289.1％实施例381.4％实施例475.9％[0058]根据表1可知，添加五味子乙素的保存液相比于不加五味子乙素的保存液、添加盐酸川芎嗪的保存液或儿茶素的保存液具有更好的保存护细胞活性的效果，添加五味子乙素的保存液中细胞存活率更高。[0059]实施例5[0060]利用实施例2中的保存液以及htk液、uw液、林格液进行对比，使用同一方法对同一来源的l-02肝细胞进行保存试验研究，并记录保存结果进行比较。细胞培养板为corning公司生产，1640培养基购买至生工生物工程(上海)股份有限公司，五味子乙素等药品购买至上海麦克林生化科技有限公司。[0061]一、ldh细胞活性检测实验：[0062]细胞受损细胞膜破裂，ldh被释放出来，因此可以用乳酸脱氢酶(ldh)含量评价细胞的存活状态。使用试剂盒测定不同组细胞乳酸脱氢酶(ldh)的释放量。[0063]待培养瓶中肝细胞的融合度达到80％以上时，进行传代操作并按照3×106个/ml的密度铺6孔板，2ml/孔，37℃，5％co2，二氧化碳培养箱贴壁培养24h后并分组：经过冷保存48h后使用pbs洗涤，各组均加入完全培养基置于培养箱重新培养6h；取各组细胞上清液，离心待用。使用ldh检测试剂盒(南京建成生物公司提供)进行检测各组上清液中ldh漏出量。试验步骤如下：[0064](1)按表1所示进行加样，每组三个复孔；[0065]表2[0066] 空白孔标准孔测定孔对照孔超纯水(μl)255 50.2mmol/l标准液(μl) 20ꢀꢀ待测样本(μl))ꢀꢀ2020基质缓冲液(μl)25252525辅酶(μl)ꢀꢀ5 [0067](2)加入完全后，微微混匀，在37℃恒温箱中孵育15min；[0068](3)(3)各孔均加入2,4-二硝基甲苯25μl，混匀并在37℃恒温箱中孵育15min；[0069](4)各孔均加入0.4mmol/lnaoh溶液250μl，室温放置5min，使用多功能酶标仪测定波长在450nm下各孔的od值；[0070](5)按照计算公式计算ldh活性：ldh活性(u/l)＝(测定od-对照od)/(标准od-空白od)×标准品浓度×1000(注：标准品浓度为0.2mmol/l)。[0071]表3[0072]分组ldh含量(u/l)htk组193.25uw组165.02林格液233.45实施例1147.37实施例2136.36正常组87.12[0073]ldh试剂盒检测的各组各组上清液ldh含量实验结果如表3所示。根据表3可知，细胞在低温保存48h后复苏再培养后，实施例2组的状态较好，与林格氏液组、htk液组相比在细胞复苏后有显著性差异，对细胞的保存效果明显优于林格氏液组、htk液。与uw液组ldh释放量无显著性差异。[0074]结果证明实验组中实施例2组对于肝细胞的生物活性维护的最好，添加五味子乙素有利于增强保存效果，对于减少肝脏细胞的凋亡，起到了积极的作用；能在长时间保存和运输中，维持肝细胞的存活率及生物活性。[0075]二、长时间冷保存细胞活率检测试验[0076]细胞培养：在细胞培养箱进行常规细胞培养,每3天传代一次,细胞生长汇合度达到80％后消化收集肝细胞，使用细胞培养基重悬后，以2×105/ml细胞密度接种在六孔细胞培养板中，每孔加液量2ml，37℃二氧化碳孵箱贴壁培养24小时后待细胞生长达到80％汇合度，4℃低温保存。[0077]2.低温保存：吸除原先各孔培养基，使用pbs缓冲液冲洗两遍后，在六孔培养板每孔分别加入2ml按照实施例2配制的保存液，置于4℃冰箱中冷保存，封口膜对培养板封口，冷保存时间为1至6天。[0078]3.台盼蓝染色法测存活率：经过冷保存1至6天时按时将细胞培养板从4℃冰箱取出，吸尽各组保存液后，收集细胞使用台盼蓝拒染试验测定1至6天冷保存时间的细胞存活率。取样进行台盼蓝(trypanblue)染色，计数活细胞和死细胞数，计算细胞活率，细胞活率＝活细胞数目/(活细胞数目+死细胞数目)。台盼蓝染色结果如图1所示。台盼蓝拒染3min左右使用细胞计数仪测细胞活率，收集数据建立细胞保存试验结果对比表，结果如表4所示。[0079]表4冷保存1-6天的细胞活率表[0080]分组细胞存活率冷保存1天91％冷保存2天85.6％冷保存3天77.8％冷保存4天70.1％冷保存5天50.5％冷保存6天44.6％[0081]4.细胞再增殖实验：将经过冷保存1至6天后的细胞收集起来，离心使用完全培养基重悬后，通过血球计数板计细胞总数，计数后每组以2.5×105/孔细胞密度重新培养于六孔板中，放置于37℃、5％co2培养箱中正常培养48小时，用胰酶消化细胞收集所有细胞，统计细胞总数，根据初始密度分别计算所述细胞经48h再增殖后的增值倍数，结果如表5所示，统计数据并分析。[0082]表5[0083]分组细胞总数/孔增殖倍数冷保存1天1.42×1065.68冷保存2天1.33×1065.32冷保存3天1.09×1064.36冷保存4天8.1×1053.24冷保存5天6.4×1052.56冷保存6天4.5×1051.80[0084]采用台盼蓝染色法评价肝细胞的活性，根据表4可知，采用实施例2的保存液在低温保存肝细胞，24h细胞存活率可达90％以上，48h细胞存活率可达85％以上，72h细胞存活率可达75％以上。细胞存活率在50％以上被认为肝细胞活性保持较好，因此实施例2的保存液对于肝细胞的存活率起到良好的保护作用，当细胞存活率在50％以上时使用本发明的保存液可以低温保存5天左右。根据表格5可知，本发明的保存液对于肝细胞的生理状态起到良好的保护作用，光学显微镜发现再增殖后细胞形态正常。因此本发明实施例2的细胞保存液对细胞的保护效果极佳，具有良好的应用开发前景。[0085]三、肝脏低温保存试验验证[0086]1、提取离体肝脏：选取spf级健康雄性sd大鼠术前12小时禁食不禁水。后肢肌内注射麻醉速眠新0.6ml/kg。麻醉成功后将大鼠固定于手术台上，腹部去毛，使用75％酒精消毒。剃毛后大鼠腹部行十字切口，切口上缘至剑突，下缘为耻骨联合。用棉签将腹腔内胃肠轻推至左髂区，盐水纱布覆盖保湿，钝性分离肝周韧带及腹主动脉，露出肝脏。游离肝下腔动、静脉，游离门静脉进行在体灌洗。经腹主动脉进行插管处理后使用肝素化生理盐水40ml冲洗，肝下腔静脉剪断作为出口，将肝脏缓慢冲至土黄色。随后进行门静脉置管，经门静脉注射约20ml的4℃的各组保存液冲洗肝脏，充分游离并将肝脏离体。[0087]2、肝脏冷保存：取肝后将其置于装有4℃的100ml保存液的器官保存袋中，充分浸润肝脏，然后密封器官保存袋，将器官浸润在保存液中，置于4℃环境下冷保存24h后取样用于分析。保存液样品经3000rpm，离心5min后，取上清液于-80℃超低温冰箱保存，用全自动生化分析仪检测ast含量。采用黄嘌呤氧化酶法进行sod测定，sod的生成量由相应的市售试剂盒按照生产厂家(南京建成生物工程研究所)的说明书测定肝脏样本。所述器官保存液分组依次为实施例2保存液、uw液、htk液，每组样本量为4只。实验结果以均数±标准差表示，具体如图2所示。[0088]根据图2可知，在保存结束后分别检测的保存液中ast含量以及肝脏组织sod含量，表明实施例2的保存液可以有效的抗氧化应激损伤，保护肝脏组织。在低温保存肝脏24h后，本发明组与uw液保存组的ast含量无明显差异，但明显优于htk液组，保存效果较好。实施例2保存液组的sod含量最高，且与其他两种存在显着差异，实施例2保存液的抗氧化应激效果较好。本发明的保存液为低温保存肝器官提供了较好的保存效果，而且保存液生产成本低，具有实际的应用价值。[0089]以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。[0090]以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。









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