一种表面增强拉曼散射免疫层析试剂盒及其制备和应用

测量装置的制造及其应用技术1.本发明属于分子光谱学与免疫学交叉的检测技术领域，具体涉及一种表面增强拉曼散射免疫层析试剂盒及其制备和应用。背景技术：2.真菌毒素、抗生素、违禁药物等残留均属于小分子污染物，由这类污染物所带来的食品安全问题已成为全球关注的重大问题。通常情况下，小分子污染物在样本中的含量非常低，属于痕量物质。随着食品种类的不断丰富，污染物的种类也日益增多，因此需要快速、可靠、高灵敏的检测手段才能满足大量样本检测的需求。3.目前，利用免疫学方法检测此类小分子污染物的应用已经非常广泛，例如酶联免疫(elisa)试剂盒，胶体金/荧光免疫层析试纸，放射性免疫检测试剂盒等。这些方法具有简单、快速、高通量、低成本等优势，但也存在不同程度的缺点：(1)酶联免疫试剂盒具有较高的灵敏度，但需要一些配套的专业仪器和专业的人员进行操作，对检测环境有一定的要求，检测时间较长，不适合现场检测使用。(2)胶体金免疫层析试纸条具有成本低，快速，操作便捷等特点，但是灵敏度不高，一般只用于定性或者半定量检测。(3)与胶体金免疫层析试纸相比，荧光层析试纸具有更高的灵敏度，但是在光照条件线容易发生荧光淬灭现象，影响了试纸条的灵敏度和稳定性。4.因此，需不断研究，以期获得一种快速、可靠、高灵敏的检测手段以满足大量样本检测的需求。技术实现要素：5.本发明在于克服现有技术中的一些不足，提出一种内嵌有拉曼信号分子的金银核壳型双金属纳米颗粒及其制备方法，并将其应用于表面增强拉曼免疫层析检测试剂中，通过优化其应用方法，不仅实现了定量分析，还具有较高的灵敏度和稳定性。6.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：7.本发明首先提供一种表面增强拉曼散射免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括免疫层析试纸条和密封微孔；所述免疫层析试纸条包括层析膜，所述层析膜上设置检测线(c线)和控制线(t线)，t线上附着包被抗原a，c线上附着有抗体ii；所述密封微孔中装有冻干试剂，所述冻干试剂由内嵌有拉曼信号分子的金银核壳型纳米颗粒标记抗体i制得。8.所述免疫层析试纸条还包括底衬、样品垫和吸水垫，所述样品垫、层析膜和吸水垫依次相连附着于底衬上。9.本发明中所述的底衬为不透水物质，优选为聚氯乙烯(pvc)。10.所述样品吸收垫的材质优选为玻璃纤维。11.所述层析膜的材质优选为硝酸纤维素膜。12.所述吸水垫的材质优选为吸水纸。13.所述抗原a为小分子半抗原与载体蛋白的偶联物，优选为玉米赤霉烯酮半抗原与牛血清白蛋白(bsa)的偶联物。14.所述抗体i为抗小分子的单克隆抗体，优选为抗玉米赤霉烯酮的单克隆抗体。15.所述抗体ii优选为羊抗鼠二抗。16.所述冻干试剂为冷冻干燥后的sers探针，所述sers探针的制备方法，包括以下步骤：17.(1)制备适当粒径大小的金纳米颗粒；18.(2)将拉曼信号分子标记到金纳米颗粒表面；19.(3)在标记信号分子的金纳米颗粒表面覆盖一定厚度的银层；20.(4)在银层表面标记能够特异性识别小分子的抗体，并加入蛋白封闭多余位点。21.其中，步骤(1)中所述金纳米颗粒的制备方法包括：将100ml浓度为0.01％(w/v)的氯金酸溶液加热至沸腾，在持续搅拌(500rpm)下，迅速加入1.6ml 1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液，当溶液颜色由淡黄色变为酒红色之后，继续煮沸5min，得到直径为30-40nm的金纳米溶液。22.步骤(2)中所述将拉曼信号分子标记到金纳米颗粒表面的方法包括：将100μl(0.1mm)的4-巯基苯甲酸溶液逐滴加入到10ml步骤(1)制备的金纳米溶液中，室温下缓慢搅拌(350rpm)1h，离心去掉上清液，将下层沉淀物重新溶解于10ml超纯水中，即为标记了拉曼信号分子的金纳米溶液aumbanps。23.步骤(3)中所述标记信号分子的金纳米颗粒表面覆盖一定厚度的银层的方法包括：向10ml步骤(2)制备的aumbanps溶液中加入200μl 1％的柠檬酸三钠溶液和500μl 10mm抗坏血酸溶液，然后在搅拌下(350rpm)逐滴加入500μl 10mm的硝酸银溶液，当溶液变为橙黄色之后继续反应30min，得到银层平均厚度为9nm的核壳型纳米增强基底aumba@ag nps。24.步骤(4)中所述在银层表面标记抗体并加入蛋白的方法包括：用0.2m碳酸钾将10ml aumbanps溶液的ph调节至9.0，在搅拌下(350rpm)逐滴加入40μl浓度为1mg/ml的单克隆抗体，室温反应30min；再加入1ml浓度为10mg/ml的牛血清白蛋白，室温反应30min，离心，去上清，再用10ml复溶液重新分散，得到aumba@ag nps-abi溶液。25.所述的室温为20～30℃；所述的逐滴为18～20μl/40s；所述的离心的条件为8000rpm离心10分钟。26.所述的复溶液优选为：含5％海藻糖、2％bsa、2％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)k30和0.1％吐温-20的0.01m磷酸盐缓冲液。27.所述密封在微孔中的冻干试剂的制备过程如下：按照50μl/孔，在微孔板中加入适当浓度的sers探针溶液，即aumba@ag nps-abi溶液，经过冷冻干燥之后，在微孔板表面热封一层铝箔纸，于4℃长期储存。28.所述免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：29.(1)将包被抗原a和抗体ii呈直线型固定在层析膜上，形成t线和c线；30.(2)在底衬上，粘贴层析膜、样品垫、吸水垫，完成组装后烘干，得到免疫层析试纸条。31.进一步的，所述步骤(1)中通过划膜仪或者喷膜仪将包被抗原a和抗体ii呈直线型固定在层析膜上；步骤(2)中所述在底衬上，依次设有样品垫、层析膜、吸水垫；所述样品垫与层析膜之间设有重叠部分，所述吸水垫与层析膜之间设有重叠部分；优选的，所述重叠部分为1-2mm。32.本发明还提供一种表面增强拉曼散射免疫层析检测小分子污染物的方法，包括如下步骤：33.将待测目标物的标准品加入密封微孔中，反应一段时间后；将免疫层析试纸条样品垫一端插入微孔中继续反应一段时间后取出；采集试纸条上c线和t线的拉曼光谱，获得t线和c线拉曼光谱强度的比值，建立traman/craman与待测目标物的标准品浓度呈反比的定标曲线，依据建立的定标曲线按照待测目标物的标准品检测方法检测待测目标物中小分子污染物的含量。34.其中，所述加入待测目标物的标准品或待测目标物为100-200μl；所述待测目标物的标准品或待测目标物加入微孔中反应时间为3-5min；所述免疫层析试纸条插入微孔中反应时间为5-10min。35.本发明还提供所述的试剂或所述检测方法在检测小分子污染物中的应用，优选的，所述小分子污染物包括玉米赤霉烯酮。36.进一步的，所述试剂与台式拉曼光谱仪、便携式拉曼光谱仪、手持式拉曼光谱仪中的任何一种配合使用，实现样本中小分子物质的定量分析。37.表面增强拉曼散射(surface enhancement of raman scattering)，简称sers，sers技术具有无损、快速、灵敏度高、操作简单等优点，本发明中将金银双金属复合纳米增强材料与高灵敏的sers检测仪器和免疫层析技术相结合，开发出既操作简单，快速灵敏，又适合现场检测的定量分析工具。38.本发明以内嵌了拉曼信号分子的aumba@ag双金属核壳纳米结构为增强基底，将其与抗体i偶联制备sers探针。sers探针上的抗体i与c线上的抗体ii不同，抗体i是能够识别目标待测物的特异性抗体，抗体ii是能够识别抗体i的第二抗体。39.在检测小分子的过程中，遵循免疫竞争法的原理，即待测小分子和t线上的抗原a竞争性结合标记有抗体i的sers探针。当待测溶液为阴性时，在第一步反应过程中，微孔中sers探针上的抗体i没有结合目标物，因此当插入试纸条之后，随着层析反应的进行，sers探针被t线上的抗原a捕获并产生强的拉曼信号，过量的sers探针继续向上被c线上的抗体ii结合也能产生一定拉曼信号；当待测溶液为阳性时，在第一步反应过程中，微孔中sers探针上的抗体首先与目标物结合，当插入试纸条之后，随着层析反应的进行，没有或者少量的sers探针被t线上的抗原a捕获，因此t线的拉曼信号减弱，结合了目标物的sers探针可以继续向上，被c线上的抗体ii结合并产生拉曼信号；因为t线上拉曼信号强度与待测物的浓度呈反比，利用拉曼信号的变化可以实现待测物的高灵敏定量分析。40.所以，在本发明中，以内嵌有拉曼信号分子的金银双金属核壳型纳米材料作为拉曼增强基底，制备了能够检测小分子污染物的表面增强拉曼散射免疫层析试剂，并将该试剂应用于真菌毒素的检测，结合便携式拉曼系统，实现了样本中微量真菌毒素的定量分析。相比于传统检测方法，本发明提供的sers免疫层析试剂不仅实现了快速定量分析，配合便携式或者手持式拉曼光谱仪还可以进行现场检测，是一种具有潜在应用价值和开发应用前景的新型检测方法。41.本发明的有益效果:42.(1)现有技术中通常采用的au、ag或au@ag作为增强基底，拉曼信号分子被标记在纳米材料的外表面，而本发明将拉曼信号分子嵌入金银核壳纳米结构之间，形成了aumba@ag三明治结构，这不仅在金银交界处的微小纳米间隙中形成大量了“热点”，而且一定厚度的银壳对夹层中的拉曼信号分子起到保护作用，防止信号分子的脱落，从而提高了拉曼信号灵敏度和稳定性。43.(2)传统的免疫层析试纸条是将信号标记物固定在试纸条的结合垫上，本发明中将sers探针冷冻干燥后密封于微孔中，并在溶液中加入了保护抗体和稳定纳米材料的成分(复溶液)，在密封的环境下sers探针避免与空气接触，在长期保存过程中避免纳米颗粒表层的银发生氧化作用，有利于试纸条和检测试剂的长期储存。44.(3)传统的试纸条在检测时，是将待测液直接滴加到样品孔或者将试纸条直接插入待测液中一步反应完成检测，本发明中sers探针与试纸条是分离的，因此在检测的过程可以采用两步反应，在第一步反应过程中目标物可以与sers探针上的抗体充分结合，这种检测模式可以进一步提高检测灵敏度。45.(4)传统的胶体金免疫层析试纸条是利用肉眼进行结果判断的，存在一定的主观性，而且通常都是定性或者半定量的。本发明采用具有高灵敏度的拉曼光谱仪对试纸条c线和t线的拉曼信号进行采集，采集时间小于1min，可以实现快速定量分析。46.(5)现有技术中利用拉曼光谱仪对免疫层析试纸进行定量分析时，通常仅利用t线的拉曼信号和待测物浓度之间的关系建立标准曲线。本发明中以t线和c线拉曼信号的比值作为纵坐标，以待测物浓度的对数作为横坐标，建立标准曲线，可以消除检测温度、湿度等环境条件以及试纸条条间差异等引入的误差，提高建立的标准曲线的准确性和抗干扰性。附图说明47.图1为本发明中检测小分子的表面增强拉曼免疫层析试剂的检测原理示意图。48.图2是实施例1中所制备的sers探针aumba@ag-abi的结构示意图，其中，21-金核、22-拉曼信号分子、23-银壳、24-抗体i、25-封闭蛋白。49.图3是实施例1中所制备的金纳米溶液的紫外图和透射电镜图。50.图4本实施例1中所制备的金核银壳纳米溶液的紫外图和透射电镜图。51.图5是本发明实施例中表面增强拉曼免疫层析试纸条的结构示意图，其1-样品垫、2-层析膜、3-检测线、4-控制线、5-底衬、6-吸水垫、7-装有sers探针的微孔。52.图6是本发明中制备的装有冻干sers探针检测试剂的密封微孔示意图。53.图7是金纳米颗粒(au)、银纳米颗粒(ag)、金银核壳纳米颗粒(au@ag)分别在外层标记信号分子与将信号分子嵌入核壳结构之间的aumba@ag四种纳米增强基底的sers性能对比图。54.图8是本发明实施例中试纸条检测不同浓度zen获得的拉曼光谱图。55.图9是本发明实施例中，以traman/craman和待测物浓度呈反比的关系建立的定标曲线。具体实施方式56.为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。57.本发明的实施例中，没有多作说明的都是采用常规实验方法完成，实施例中所涉及过程都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，没有特殊说明的材料或试剂，均为常规市售材料，因此不再详细描述。58.本发明的实施例中，以检测玉米赤霉烯酮(zen)为例说明表面增强拉曼免疫层析检测试剂及其制备方法，并将其用于实际检测，以说明本发明的优势；但是根据待检测物的不同，替换相应的抗体抗原均可达到预期效果，均在本发明保护范围，在本发明的实施例中，不再赘述。59.实施例1：60.本实施例以检测玉米赤霉烯酮(zen)为例说明表面增强拉曼免疫层析检测试剂的制备。封闭蛋白选用bsa，检测线包被抗原a选用zen-bsa，标记抗体选用zen单克隆抗体，拉曼信号分子选用4-巯基苯甲酸(4-mba)。61.表面增强拉曼免疫层析检测试剂的制备方法包括以下步骤：62.sers探针的制备，包括以下步骤：63.(1)制备适当粒径大小的金纳米颗粒：64.将浓度为0.01％(w/v)的100ml氯金酸溶液加热至沸腾，在持续搅拌(500rpm)下，迅速加入1.6ml 1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液，当溶液颜色由淡黄色变为酒红色之后，继续煮沸5min，得到直径约为30nm的金纳米溶液；如图3是本实施例中制备的金纳米溶液的紫外图和透射电镜图。65.(2)将拉曼信号分子标记到金纳米颗粒表面：66.将100μl 0.1mm的4-巯基苯甲酸溶液逐滴加入到10ml aunps中，室温下缓慢搅拌(350rpm)1h，离心去掉上清液，将下层沉淀物重新溶解于10ml超纯水中，即为标记了拉曼信号分子的金纳米溶液aumbanps。67.(3)在标记信号分子的金纳米颗粒表面覆盖一定厚度的银层：68.向10ml aumbanps溶液中加入200μl 1％的柠檬酸三钠溶液和500μl10 mm抗坏血酸溶液，然后在搅拌下(350rpm)逐滴加入500μl10 mm的硝酸银溶液，当溶液变为橙黄色之后继续反应30min，即得壳层厚度大约为9nm的核壳型纳米增强基底aumba@ag nps。如图4是本实施例中所制备的金核银壳纳米溶液的紫外图和透射电镜图。69.(4)在银层表面标记能够特异性识别小分子的抗体，并加入蛋白封闭多余位点：70.取10mlaumbanps溶液，用0.2m碳酸钾调节ph至9.0，在搅拌下(350rpm)逐滴加入40μl浓度为1mg/ml的单克隆抗体，室温反应30min；再加入1ml浓度为10mg/ml的牛血清白蛋白，室温反应30min，离心，去上清，再用20ml复溶液(含5％海藻糖、2％bsa、2％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％吐温-20的0.01m磷酸盐缓冲液)重新分散，得到aumba@ag nps-abi溶液即为sers探针。71.制备装有sers探针的密封微孔：72.按照50μl/孔，在96孔微孔板中加入aumba@ag nps-abi溶液，经过冷冻干燥之后，在微孔板表面热封一层铝箔纸，储存于2-8℃，有效期12个月。73.免疫层析试纸条的制备：74.所述免疫层析试纸条包括底衬、样品吸收垫、层析膜和吸水垫，所述样品吸收垫、层析膜和吸水垫依次紧密相连附着于底衬上，所述层析膜上设置检测线(c线)和控制线(t线)，t线上附着包被抗原a，c线上附着有抗体ii；所述密封微孔中的冻干试剂为冷冻干燥后的sers探针，sers探针由内嵌有拉曼信号分子的金银核壳型纳米颗粒标记抗体i制得。75.本发明中所述的底衬为不透水物质，优选为聚氯乙烯(pvc)。76.所述样品吸收垫的材质优选为玻璃纤维。77.所述层析膜的材质优选为硝酸纤维素膜(nc膜)。78.所述吸水垫的材质优选为吸水纸。79.所述抗原a为小分子半抗原与载体蛋白的偶联物，优选为玉米赤霉烯酮半抗原与牛血清白蛋白(bsa)的偶联物。80.所述抗体i为抗小分子的单克隆抗体，优选为抗玉米赤霉烯酮的单克隆抗体。81.所述抗体ii优选为羊抗鼠二抗。82.所述免疫层析试纸条的制备方法包括：83.(1)nc膜上检测线和控制线的固定：用0.01m pbs缓冲液(1％海藻糖，ph7.4)稀释包被抗原zen-bsa(0.3mg/ml)和羊抗鼠二抗(1mg/ml)，在biodot xyz 3060喷金划膜仪上将两者固定在nc膜上，形成t线和c线，固定量为1.0μl/cm,将包被好的nc膜置于37℃条件下干燥24h，备用。84.(2)免疫层析试纸的组装：在pvc底板上依次组装样品垫、层析膜、吸水垫；所述样品垫与层析膜之间设有重叠部分，所述吸水垫与层析膜之间设有重叠部分；优选的，所述重叠部分为1-2mm。用切条机将其切成宽度约4mm的试纸条，储存于2-8℃，有效期12个月。85.实施例2：86.本实施例以玉米赤霉烯酮检测为例说明本发明的检测方法，以实施例1制得的试纸条进行试验：87.标准曲线的建立：88.(1)用磷酸缓冲液将玉米赤霉烯酮(zen)标准品配置成不同浓度的标准溶液：0、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20、50ng/ml。所述磷酸缓冲液的浓度为0.01m，ph值为7.4(含10％乙醇，0.1％吐温-20)。89.(3)将100μl标准溶液加入到装有冻干sers探针的微孔中，用移液枪反复抽吸3-5次使其充分混匀，室温反应5min后，插入试纸条，溶液在吸水垫的吸力作用下，依次经过nc膜的t线和c线，经过t线时，sers探针与zen-bsa相结合，未被结合的sers探针经过c线时与羊抗鼠二抗相结合，反应8min后取出试纸条，撕掉样品垫终止反应。90.(4)用拉曼光谱仪在785nm激发光下，分别采集t线和c线中间区域10个点的拉曼光谱，每个点积分时间2秒，取平均值进行分析，采集的拉曼光谱如附图6所示。91.(5)以traman/craman为纵坐标，以zen标准溶液浓度的对数作为横坐标，建立标准曲线，如附图7所示，从标准曲线可知，zen标准溶液最低的定量限为0.5ng/ml，检出限为0.18ng/ml。92.实施例3：93.本实施例中设计了两种实验用于验证本发明中表面增强拉曼免疫层析检测试剂的准确性和实用性。94.一是以阴性玉米样本为空白对照，通过加入不同浓度zen标品，验证其加标回收率；二是以自然污染的玉米样本为检测对象，通过将hplc法和表面增强拉曼免疫层析检测方法的结果进行对比，验证两者的符合率。95.验证方法如下：96.(1)称取5份阴性玉米样本于50ml离心管中，每份5g，分别加入一定量zen标准品储备液，使其含量分别为0、30、60、100、200ng/g，放置过夜后进行后续的样品提取过程，自然污染的玉米样本直接进行提取。97.(2)向5g玉米样本中加入20ml提取液(50％乙醇)，并在涡旋仪上充分震荡提取5min。98.(3)将离心管于5000rpm转速下离心5min，取上清液1ml加入4ml稀释液(0.01mpbs，ph 7.4，0.1％吐温-20)混匀即为待测溶液。99.(4)取100μl待测溶液加入到装有冻干sers探针的微孔中，用移液枪反复抽吸使其充分混匀，室温反应5min后，插入试纸条继续反应8min，然后取出试纸条，撕掉样品垫终止反应。100.(5)用拉曼光谱仪在785nm激发光下，分别采集t线和c线中间区域10个点的拉曼光谱，每个点积分时间2秒，取平均值进行分析。根据实施例2中获得的标准曲线，计算检测结果，如表1和表2所示。101.表1.阴性玉米样品加标回收实验结果102.加标浓度(ng/g)稀释倍数理论浓度(ng/ml)检测浓度(ng/ml)回收率(％)30201.51.39893.2602032.85795.231002054.69293.8420020109.25492.54103.从表1的检测结果可以看出，本发明提供的检测方法可实现玉米样本中zen的检测，加标回收率均大于92％，回收率比较满意。104.表2.自然污染的玉米样品hplc法和sers免疫层析试纸检测结果对比105.样本编号hplc结果(μg/kg)sers试纸结果(μg/kg)符合率(％)130.228.193.04233.934.9102.95337.341.1110.18450.746.491.52568.474.7109.21678.383.1106.137124.2114.792.358201.2187.493.149295.7312.5105.68106.从表2的检测结果可以看出，本发明提供的检测方法对于实际污染的玉米样本检测结果与hplc方法相比，具有很好的符合率，说明本发明提供的检测方法具有很高的准确性。107.以上内容是对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。









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