GmMPK6基因在抑制大豆结瘤中的应用

有机化合物处理,合成应用技术gmmpk6基因在抑制大豆结瘤中的应用技术领域1.本发明属于农业微生物领域，具体涉及gmmpk6基因在抑制大豆结瘤中的应用。背景技术：2.大豆是我国重要的经济作物，能提供大量优质的植物蛋白及油脂。氮是构成大豆产量与品质的重要元素，为追求更高的产量，现阶段我国大豆的生产上高度依赖工业氮肥的使用。随之而来的较高的农业成本，较低的氮肥利用率，农业污染等问题制约我国现代农业的发展。大豆与根瘤菌的共生固氮作用可为大豆的生长发育提供必需的氮源，充分利用大豆—根瘤菌的共生体系，发挥大豆固氮作用对提高大豆产量及推动农业可持续发展具有重要意义。根瘤菌分泌的ⅲ型效应因子在大豆与根瘤菌共生建立的早期分子对话中发挥了重要作用。而ⅲ型效应因子在根瘤菌侵染时的机制研究较少，对该机制的解析，有利于提高大豆结瘤能力和固氮效率，并为豆科植物的共生固氮应用提供了充分的理论基础。3.由于豆科植物的结瘤与共生固氮是一个耗能的过程，需要大量消耗光合产物，因此结瘤数量受到地上部的长距离调控，并且存在复杂的反馈机制，以保证豆科植物不会过度结瘤，从而适应环境的变化，这个过程被称为结瘤自调。技术实现要素：4.本发明的目的是为了控制大豆的结瘤。在降低人工人本的前提下，减少根瘤的数量，解决了很难控制大豆根瘤数量的技术问题。5.本发明提供一种gmmpk6基因在抑制大豆结瘤中的应用。6.进一步地限定，所述抑制大豆结瘤是通过抑制侵染线的形成。7.进一步地限定，所述抑制大豆结瘤是减少根瘤数目和根瘤干重。8.进一步地限定，所述应用的步骤如下：9.克隆gmmpk6a或gmmpk6b基因，并构建含有gmmpk6a或gmmpk6b基因核苷酸序列的表达载体，将构建的表达载体转入发根农杆菌中，利用发根农杆菌侵染大豆，经鉴定后获得阳性的大豆毛状根材料，然后接种根瘤菌hh103。10.进一步地限定，所述gmmpk6a的序列如seq id no:1所示。11.进一步地限定，所述gmmpk6b的序列如seq id no:2所示。12.进一步地限定，所述表达载体为双元载体psoy10。13.本发明提供一种控制大豆结瘤的方法，所述方法的步骤如下：14.将大豆的gmmpk6基因进行超表达，获得基因超表达的转基因的大豆，然后利用根瘤菌hh103或大豆根瘤菌hh103 rhcn突变体接种基因超表达的转基因的大豆；或者将大豆的gmmpk6基因进行敲除，获得基因敲除的转基因的大豆，然后利用根瘤菌hh103或大豆根瘤菌hh103 rhcn突变体接种基因敲除的转基因的大豆。15.进一步地限定，所述gmmpk6基因进行超表达为超表达gmmpk6a或gmmpk6b基因。16.进一步地限定，所述gmmpk6基因进行敲除为敲除gmmpk6a和gmmpk6b基因。17.有益效果：对过表达gmmpk6及基因敲除的毛状根的结瘤鉴定表明，不同于ljmpk6，gmmpk6 负调控大豆共生结瘤。接种rhcn突变体时，敲除与空载体的毛状根根瘤数与根瘤干重均没有显著差异， gmmpk6可能通过介导效应因子的信号传递，并影响宿主免疫，从而影响大豆与根瘤菌共生的建立。通过对过表达gmmpk6毛状根的侵染线观察结果，表明gmmpk6抑制侵染线的形成。为后续研究大豆‑ꢀ根瘤菌共生体系形成提供了基础，为提高大豆与根瘤菌的共生效率提供了可能性。附图说明18.图1为大豆gmmpk6基因与部分植物基因系统进化分析；19.图2为mpk6基因结构分析；20.图3为mpk6基序分析；21.图4为gmmpk6基因在大豆组织中的表达模式；qrt-pcr检测中以gmukn1作为内参基因使用2^(‑ꢀδct)计算相对表达量。各组织表达量数据均为3次生物学重复的均值±标准差。22.图5为gmmpk6s与ⅲ型效应因子响应关系；qrt-pcr检测中以gmukn1作为内参基因使用2^(‑ꢀδδct)计算相对表达量，数据为3次生物学重复的均值±标准误。23.图6为gmmpk6a与gmmpk6b基因启动子元件分析；plantcare分析gmmpk6a与gmmpk6b基因启动子原件，a：gmmpk6a(glyma.02g138800)；b：gmmpk6b(glyma.07g206200)。24.图7为psoy10 gmmpk6spro:gus载体构建；m：dna marker 2k plusⅱ；a：gmmpk6启动子连入fu76载体pcr鉴定；其中1：fu76 gmmpk6apro 2：fu76 gmmpk6bpro；a：psoy10 gmmpk6spro:gus 的pcr鉴定；其中1：psoy10 gmmpk6apro:gus：psoy10 gmmpk6bpro:gus。25.图8为gmmpk6:3×myc过表达载体构建；a：fu48 gmmpk6a:3×myc和fu48 gmmpk6b:3×myc 的菌液pcr检测，泳道1为gmmpk6a，泳道2为gmmpk6b；m：trans 2k plus dna marker。b：psoy10 ubi:gmmpk6a:3×myc和psoy10 ubi:gmmpk6b:3×myc的菌液pcr检测，泳道1为gmmpk6a，泳道 2为gmmpk6b；m：trans 2k plus dna marker。26.图9为gmmpk6s过表达毛状根qrt-pcr检测及免疫印迹分析；a：空载体、psoy10 ubi:gmmpk6a:3ꢀ×myc和psoy10 ubi:gmmpk6b:3×myc毛根转化后，目的基因mpk6a和mpk6b的相对表达量。使用 gmukn1(glyma.12g020500)作为内参基因，数据为3次生物学重复的均值±标准误，student’s t test进行显著性分析，**代表p《0.01，***代表p《0.001。b：免疫印迹分析阳性根，并使用actin抗体检测蛋白提取效率。ev代表psoy10空载、oe-mpk6a代表psoy10 ubi:gmmpk6a:3×myc、oe-mpk6b代表psoy10 ubi:gmmpk6b:3×myc。27.图10为gmmpk6a和gmmpk6b过表达毛状根结瘤表型；a：psoy10 ubi:gmmpk6a:3×myc、psoy10 ubi:gmmpk6b:3×myc和空载体分别接种hh103以及rhcn突变体的毛状根表型图，ev代表psoy10空载、oe-mpk6a代表psoy10 ubi:gmmpk6a:3×myc、oe-mpk6b代表psoy10 ubi:gmmpk6b:3×myc，比例尺为1cm。b：毛状根转化并过表达gmmpk6的根瘤表型的箱线图，使用student’s t test进行显著性分析，其中“***”代表p《0.001，“**”代表p《0.01。n＝20。28.图11为gmmpk6a和gmmpk6b基因编辑的结构示意；gmmpk6a和gmmpk6b基因编辑的结构示意图，包含sgrna的靶序列、pam位点信息以及mpk6a-cas-tf(r)和mpk6b-cas-tf(r)所在位置。29.图12为gmmpk6a和gmmpk6b基因编辑情况检测；a：通过pcr鉴定检测5株基因编辑的大豆毛状根材料的编辑情况。m：dl5000 dna marker；0：东农50野生型；1-15基因编辑的毛状根。b：经过测序后，确定的gmmpk6a和gmmpk6b基因编辑位点情况。30.图13为敲除gmmpk6的结瘤表型；a：psoy10 gmmpk6-cas9和空载体psoy10分别接种hh103 以及rhcn突变体毛状根表型图，ev：空载体psoy10；ko：knockout即psoy10 gmmpk6-cas9。比例尺为1cm。b：毛状根转化psoy10 gmmpk6-cas9的根瘤表型的箱线图，使用student’s t test进行显著性分析，其中“***”代表p《0.001，“*”代表p《0.05，“ns”代表p＞0.05。n＝15。31.图14为gmmpk6表达模式，a是在根尖里表达；b是gmmpk6a与gmmpk6b在大豆根中的表达模式；32.图15为pfaj1702 nptⅱ:gfp的pcr检测；pfaj1702 nptⅱ:gfp的菌液pcr检测m：trans 2k plusⅱꢀdna marker。1：pfaj1702 nptⅱ:gfp。33.图16为三亲杂交单克隆菌落的镜检；白色箭头所指的即是gfp阳性的单克隆菌落。34.图17为gfp标记的根瘤菌的pcr检测；从上至下分别检测的基因为nptⅱ:gfp、ttsi及其上游片段以及nifh，p：positive control，faj1702 nptⅱ:gfp；n：negative control，hh103野生型；m：trans 2k plus dna marker。35.图18为hh103和hh103-gfp的结瘤能力鉴定；a：hh103和hh103-gfp(28dpi)的根瘤数统计。b： hh103和hh103-gfp(28dpi)的干重箱型图。c：hh103和hh103-gfp(28dpi)的根瘤豆血红蛋白含量柱状图。d：hh103和hh103-gfp(28dpi)的根瘤固氮酶活。a-d均使用t测验进行显著性分析，ns”代表p＞0.05。36.图19为过表达gmmpk6的侵染事件统计，a：构建的gfp标记根瘤菌菌液在荧光体式显微镜下的形态；b：foci、it以及rit的卡通模式图；c：荧光根瘤菌观测到的三种侵染事件示意图，比例尺均为 20μm；d：过表达gmmpk6a和gmmpk6b的大豆毛状根在接种荧光标记根瘤菌后的侵染事件统计箱线图(24hpi)。foci代表侵染点；it代表未进入皮层的侵染线；rit代表已经进入皮层细胞的侵染线；ev 代表psoy10空载；oe-mpk6a代表psoy10 ubi:gmmpk6a:3×myc；oe-mpk6b代表psoy10 ubi:gmmpk6b:3×myc；24hpi代表接种荧光标记根瘤菌24h；“***”代表p《0.001“ns”代表p＞0.05。n＝24。具体实施方式37.大豆根瘤菌hh103 rhcn突变体记载在函西,吕浩,郭广雨,等.大豆根瘤菌hh103 rhcn突变对结瘤能力的影响[j].中国农业科学,2021,54(6):13.[0038]hh103ωttsi(效应因子不表达突变体)记载在田博宇,孙志君,刘函西,等.根瘤菌ttsi突变体构建及结瘤表型鉴定[j].中国油料作物学报,2020,v.42；no.179(01):21-28.[0039]peasy-t1载体，helper(km)载体，pfaj1702(tet)载体和pgwc载体均为商业购买，商业购买。[0040]pjq200sk载体(gm)记载在quandt,j.,&hynes,m.f.(1993).versatile suicide vectors which allowdirect selection for gene replacement in gram-negative bacteria.gene,127(1),15–ꢀ21.doi:10.1016/0378-1119(93)90611-6文献中。[0041]全基因组导入系群体(chromosome segments substitution lines，cssl)记载在文章_陈庆山，“作物回交导入系的构建与应用”。[0042]重组自交系群体(recombinant inbred lines，ril)记载在[1]王宏林.大豆重组自交系群体的构建,鉴定及其主要农艺性状qtl定位的研究[d].南京农业大学,2001.[0043]绥农14(suinong14，sn14)，东农50(dongnong50，dn50)、野生豆zyd00006绥农14、charleston、东农594、合00-23、红丰11、绥02-339、紫花2号、nattosan、黑农44、黑农35和北丰11均是黑龙江常见的品种，来自东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室。[0044]快生型费氏中华根瘤菌hh103(源于西班牙塞维利亚大学francisco javier lópez-baena实验室，记载在weidner s,becker a,bonilla i,et al.genome sequence of the soybean symbiont sinorhizobium frediihh103[j].journal of bacteriology,2012,194(6):1617.)。[0045]大肠杆菌(escherichia coli)菌株dh5α；根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)菌株eha105；发根农杆菌(agrobacterium rhizogenes)菌株k599；快生费氏中华根瘤菌(sinorhizobium fredii)菌株 hh103，均是常见的菌种。[0046]2×ty液体培养基：胰蛋白胨(bacto-tryptone)16g、酵母提取物(bacto-yeast extract)10g、nacl 5g、水1000ml,ph7.2，121℃灭菌30min.[0047]fu系列载体包括fu48、fu76、fu76-cas9、fu79-gus以及fu79-2×sgrna均由傅永福研究员(中国农业科学院作物科学研究所)惠赠；植物表达载体psoy10由傅永福研究员(中国农业科学院作物科学研究所)惠赠；植物泛素启动子fu76-ubi由fu76改造，本实验室保存提供。真核表达载体pgwb5由 tsuyoshi nakagawa教授提供。[0048]dpi，days post inoculation，接种后天数。[0049]hpi，接种后小时，hours post inoculation。[0050]下述在途来自于文章lu m,cheng z,zhang x m,et al.spatial divergence of phr-pht1 modulesmaintains phosphorus homeostasis in soybean nodules[j].plant physiology,2020.文章的编号在论文中的参考文献中都有对应。[0051]载体骨架记载网站：tair-home page(arabidopsis.org)。[0052][0053][0054]fu79-2×sgrna是在fu79的载体上连接序列1：aagccaccatcatgcccatcgg和序列2：ccctccgtgaaatcaagctgctt。序列1和序列2是sgrna。序列1：aagccaccatcatgcccatcgg是gmmpk6a的sgrna，序列2：ccctccgtgaaatcaagctgctt是gmmpk6b的sgrna。[0055]gfp基因序列：(seq id no.10)。[0056]fu76-ubi载体是指在fu76载体上连接ubi序列，ubi序列如seq id no.11所示。[0057]fu48-融合3个myc标签是指在fu48载体上连接3个myc序列。3个myc序列如seq id no.12所示。[0058]fu79-gus是指在fu79载体上连接gus序列。gus序列如seq id no.13所示。[0059]fu76-cas9是指在fu76载体上连接gmmpk6a和gmmpk6b的sgrna序列。[0060]实施例1.构建mpk6基因过表达载体[0061]大豆材料均在25℃的长日照条件下(16hr光照/8hr黑暗)下恒温生长；本氏烟草在23℃的长日照条件恒温生长(16hr光照/8hr黑暗)。[0062]1.转录组测序及分析：根瘤菌的接种与取材：28℃，200rpm活化根瘤菌活化后的菌液接种于50ml 的ty(胰蛋白胨5g·l-1、酵母粉3g·l-1、氯化钙0.4g·l-1)液体培养基中，28℃，200rpm培养至 od600＝0.6后，5000rpm、8min弃上清并用10mm的mgso4重旋菌液2次。加入无菌10mm的mgso4，至菌液od600为0.6，每棵苗接种2ml菌液；自接种开始按照0hpi.、24hpi和48hpi对大豆植株根部从上至下3cm左右进行取材，用水将根部洗净，吸干水分后锡纸包裹后放入液氮，完成取材并交予百迈客公司进行测序。[0063]2.mpk6基因家族序列比对及生物信息学分析：大豆gmmpk6相关基因的获取[0064]从phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)下载大豆mpk6蛋白序列，将该序列作为查询序列，与拟南芥、苜蓿等进行在线比对。在基于e值(e《1×10-5)筛选高度匹配的序列。使用interproscan 分析gmmpk6蛋白质序列的保守结构域。[0065]mpk6系统进化分析：从phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)blast获得2个单子叶以及3个双子叶的同源蛋白序列，包括拟南芥、水稻、玉米、小豆以及向日葵。使用mega软件进行系统进化分析。[0066]mpk6启动子元件分析：选取gmmpk6基因组序列上游2000bp作为该基因的启动子区域，利用plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站对该基因的启动子进行元件分析。[0067]结果：(1)gmmpk6的系统发育：以大豆gmmpk6的蛋白质序列在phytozome上blast比对2 个单子叶以及3个双子叶的同源蛋白序列，包括拟南芥、水稻、玉米、小豆以及向日葵。使用mega软件进行系统进化分析(图1)。结果表明mpk6蛋白根据进化关系的远近可以聚类成3个亚家族，其中小豆与苜蓿的mpk6与大豆亲缘关系较近，同时同属于豆科，在根瘤菌与大豆共生建立时可能具有类似的功能。[0068](2)gmmpk6基因结构及编码蛋白质结构域分析：为了分析gmmpk6以及同源基因的基因结构，从phytozome数据库下载mpk6的gff3文件，使用tbtools分析gmmpk6以及同源基因的基因结构，得到基因结构模式构图(图2)结果表明通过基因结构可以聚类3个亚家族。其中gmmpk6b (glyma.07g206200)相比于gmmpk6a(glyma.02g138800)多一个外显子，而其他基因均具有较为相似的基因结构表明mpk6基因家族进化上是保守的。[0069]为分析mpk6基因编码蛋白质的保守基序，通过phytozome数据库下载蛋白序列，使用tbtools将结果进行可视化，所有蛋白均具有相同的基序结构(图3)，表明这些蛋白可能行使相似的功能。而在共生结瘤上mtr.4g087620可能与gmmpk6具有相似功能。[0070](3)gmmpk6基因在大豆中的表达模式分析[0071]为分析gmmpk6在不同组织的表达情况，本研究利用qrt-pcr检测大豆根、茎、叶、根瘤、花以及荚六个组织中gmmpk6的基因表达水平，如图(图4)所示，gmmpk6在大豆根瘤组织表达水平最低，在根部表达量较高，这与phytozome公共数据库转录组数据相似。由于根瘤发育过程中，宿主需要抑制根瘤组织的免疫反应，而mpk6作为免疫信号的关键组分，可能在该组织存在抑制，而这可能是造成 gmmpk6在大豆根瘤组织与根部表达量差异较大的原因。[0072](4)gmmpk6响应效应因子的表达分析：为研究gmmpk6在共生结瘤过程中，侵染前期响应ⅲ型效应因子的表达模式，本研究利用qrt-pcr分别检测接种hh103、hh103ωrhcn以及mgso4(mock) 的不同大豆根部。如图(图5)所示，gmmpk6a与gmmpk6b的表达模式相似，并且接种hh103的0h 到12h时gmmpk6a与gmmpk6b表达趋势与接种hh103ωrhcn相反。接种12h后，接种hh103ωrhcn 的大豆根部gmmpk6s的表达量均高于接种hh103菌株，并在12hpi达到极值。该分析结果与转录组数据相吻合，表明在根瘤侵染前期，根瘤菌ⅲ型效应因子在抑制共生建立时的免疫反应具有重要意义，同时部分效应因子可能通过抑制免疫关键基因mpk6的表达来抑制免疫反应。[0073](5)gmmpk6启动子元件分析：为解析gmmpk6的转录调控特点，对gmmpk6a和gmmpk6b两个基因启动子区(转录起始位点2kb)进行启动子元件分析。结果显示gmmpk6a和gmmpk6b均具有参与抗逆调控的顺式作用元件(图6)，表明gmmpk6可能参与共生过程中的植物免疫防御反应。同时， gmmpk6a和gmmpk6b启动子区也存在生长素以及赤霉素响应元件，说明gmmpk6基因的信号通路可能涉及调控根瘤菌侵染和根瘤原基形成过程。除此之外，gmmpk6b启动子区存在与黄酮合成基因的相关的myb转录因子结合位点，表明gmmpk6b的表达与黄酮合成可能受相似的转录因子调节，而黄酮类物质是大豆与根瘤菌共生建立的早期的重要对话者，再次表明gmmpk6可能参与早期共生建立的信号传导。[0074](6)gmmpk6基因的启动子活性分析：为了进一步研究gmmpk6基因的表达模式，将转录起始位点(transcriptional start site,tss)上游2000bp片段(gmmpk6apro,2000bp)、gmmpk6b tss上游2000 bp片段(gmmpk6bpro，2000bp)分别用ecor i和ecorⅴ克隆位点酶切连接至入门载体fu76，结果如图(图7)，载体命名为fu76 gmmpk6apro和fu76 gmmpk6bpro，然后通过lr反应将fu76 gmmpk6apro、 fu76 gmmpk6bpro上目标片段与fu79-gus转移至真mpk6bcasgene-f ctccgccggccgacaccgtg，mpk6bcasgene-r：ctgtacggacaaaatggcct tt引物分别进行pcr扩增，进行基因编辑效率以及编辑方式检测，由于设计的两个靶点分别相距344bp 和340bp，基因编辑时，两个靶点均被编辑时，有概率发生片段缺失产生见图(图12中的a)。mpk6a 与mpk6b均存在片段丢失，其中经过基因编辑有三分之一的mpk6a发生片段丢失。为进一步确定短片段为预期的基因编辑片段，通过连接t载体进行测序鉴定，结果如图(图12中的b)所示，符合实验预期。综上，获得的psoy10 gmmpk6-cas9载体可以发生预期的基因编辑，可以为后续的进一步mpk6基因功能研究提供材料基础，并有较好的编辑效率，可以用与毛状根转化验证敲除gmmpk6后的结瘤表型。[0093]2.毛状根转化：[0094]挑取饱满的大豆种子使用氯气熏蒸法灭菌8hr后取出置于超净台内吹净氯气，用灭菌的超纯水浸泡 16hr至胚根伸长。[0095]将含有目标载体的k599农杆菌,挑取单克隆鉴定(转化及pcr鉴定方法同2.2.5.1),活化后用yep 培养基(5g·l-1酵母提取物；10g·l-1蛋白胨；5g·l-1nacl；ph＝7.0)振荡培养至菌液od600值在1.0 左右，rcf＝1700g离心20min，并重悬于lccm液体培养基(1/10×gamborg b5盐；30g·l-1蔗糖；3.9 g·l-1mes；ph＝5.4；灭菌后加入40mg·l-1乙酰丁香酮)；[0096]将浸泡好的大豆胚根部分切下,保留靠近子叶节的下胚轴和子叶,将外植体浸于重悬菌液中浸泡20 min完成侵染。侵染后将外植体放于滤纸上吸干浸染液，而后转移至共培养基(1/10×gamborg b5盐；30 g·l-1蔗糖；3.9g·l-1mes；4.25g·l-1琼脂；ph＝5.4；灭菌后加入400mg·l-1cysteine；154.2mg·l-1 dithiothrietol；40mg·l-1乙酰丁香酮),暗培养48hr。[0097]将共培养后的大豆外植体的下胚轴垂直插入含有毛状根诱导培养基(1×gamborg b5盐；30g·l-1蔗糖；0.59g·l-1mes；7g·l-1琼脂；ph＝5.7；灭菌后加入100mg·l-1timentin；100mg·l-1cefotaxime) 的组培瓶中,16hr光照、8hr黑暗下培养14d。[0098]待毛状根生长至2cm时,从培养基上移出,使用荧光体式显微镜筛选阳性根，剪去非阳性根，获得转基因毛状根用于后续实验。[0099]psoy10 gmmpk6-cas9的大豆crispr cas9系列载体分别导入发根农杆菌k599菌株中进行大豆毛状根转化,分别获得不同转基因的毛状根。[0100]3.基因编辑效率检测：提取镜检后的gmmpk6基因编辑阳性毛状根液氮磨碎分装0.2g于1.5ml离心管中，进行大豆dna提取。dna提取方法如下：[0101](1)分装样品的1.5ml离心管加入小钢珠，震荡研磨仪60％额定功率研磨3min；[0102](2)加入ctab提取液500μl，用涡旋振荡器摇匀，使组织粉末完全分散在ctab提取液中；[0103](3)将1.5ml离心管置于烘箱中，65℃处理一个小时，期间轻摇数次；[0104](4)上述反应液室温，rcf＝12000g离心20min；[0105](5)离心完成后，取上清液，加入600μl氯仿，离心机离心，rcf＝12000g，离心20min；[0106](6)取上清液，加入200μl的-20℃预冷异丙醇；[0107](7)离心机离心rcf＝12000g，离心20min弃上清，分别加入无水乙醇和75％乙醇洗启动子与gfp 克隆至pfaj1702上，测序成功后，获得载体重新命名为pfaj1702 nptⅱ:gfp。[0115]2.rna提取及qrt pcr:大豆总rna提取：使用trizol对大豆组织的总rna提取，qrt pcr检测基因表达：对提取的大豆总rna进行cdna合成，使用hiscript ii reverse transcriptase反转录酶购自诺唯赞 cdna-20℃保存用于后续检测基因表达。[0116]使用gmukn1(glyma.12g020500)做为定量内参基因，设计gmmpk6s及结瘤marker基因特异性定量引物，定量结果使用2-δδct算法进行基因表达水平的相对定量分析，使用2-δct算法进行gmmpk6组织特异性表达分析。[0117]实施例4.荧光根瘤菌构建及鉴定[0118]gfp标记的hh103菌株构建：通过根瘤菌三亲杂交将回补荧光质粒pfaj1702 nptⅱ:gfp转移至根瘤菌hh103中。根瘤菌三亲杂交具体步骤如下：[0119]将根瘤菌hh103和hh103ωrhcn(此菌是突变体根瘤菌，不能正常结瘤，作为实验对照使用)划线与含rif(50mg/ml)的ty固体培养基，28℃培养直至长出单克隆；[0120]挑取单克隆于rif(50mg/ml)的ty液体培养基，活化根瘤菌，次日将回补载体菌株(pfaj1702 nptⅱ:gfp，tet+)与自主转移菌株helper(prk2013，km+)划线与相应抗性的lb固体培养基上，过夜培养至长出单克隆；[0121]挑取回补菌株(pfaj1702 nptⅱ:gfp，tet+)与自主转移菌株helper(prk2013，km+)单克隆于相应抗性的液体lb培养基，37℃活化；[0122]分别吸取50μl三种菌液与10ml相应培养基中培养od600值至0.6-0.8(根瘤菌od600值为0.3时，再培养两种大肠杆菌，三种菌od600值可几乎同时到0.6；[0123]三种菌培养到相同od600值,取三种菌各500μl于1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，弃上清， 1ml无抗ty重悬；[0124]调整根瘤菌:pfaj1702 nptⅱ:gfp:自主转移菌株的菌液比例为1:2:2，即重悬过后的hh103菌液100 μl，pfaj1702 nptⅱ:gfp菌株和自主转移菌株helper各200μl，加入到1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，弃上清，用30μl无抗ty重悬；[0125]将20μl的混合菌液滴到无抗ty固体培养基平板上28℃培养36hr-48hr；[0126]刮取菌苔到含有rif与tet的ty固体培养基28℃培养，直至长出单克隆；[0127]挑取单克隆于含抗生素的ty固体培养基28℃培养，进行筛选，重复2-3次。[0128]挑取筛选后的候选菌落于含有rif与tet的ty液体培养基中，28℃培养用于后续pcr鉴定。[0129]gfp-tagged hh103的pcr鉴定：通过pcr鉴定候选菌液，鉴定无误后将gfp-tagged的hh103命名为hh103-gfp。鉴定引物使用gfp-f(r)以及根瘤菌保守基因引物nifh-f(r)和ttsi-f(r)。[0130]利用以下实验验证实验效果：[0131]1.大豆结瘤试验：大豆于双层钵中培养至第一片三出复叶展开时(大豆毛状根移栽至双层钵后缓苗2-3天)分别接种快生根瘤菌(sinorhizobium fredii)hh103以及hh103ωrhcn，放置在温室中正常培养，培养条件大豆材料均在25℃的长日照条件下(16hr光照/8hr黑暗)下恒温生长；本氏烟草在23℃的长日照条件恒温生长(16hr光照/8hr黑暗)。培养根瘤菌hh103的ty培养基配方为：3g·l-1酵母提取物,5g·l-1蛋白胨,0.4g·l-1氯化钙ph＝7.0。植物低氮营养液配方：0.5μm硫酸锌、0.25μm硫酸镁、2μm 硼酸、1mm氯化钙、1μm硫酸锰、0.25μm硫酸钾、0.2μm硫酸铜、0.1μm硫酸钴、100μm磷酸二氢钾、10μm柠檬酸铁、0.1μm钼酸钠以及1μm硝酸钾，ph调至5.8。[0132]结果：过表达gmmpk6抑制结瘤发生：将携带有psoy10 ubi:gmmpk6a:3×myc和psoy10ubi:gmmpk6b:3×myc真核表达载体的发根农杆菌k599进行大豆毛状根转化，并使用psoy10空载作为阴性对照。由于psoy10载体存在dsred筛选标记，使用荧光体式显微镜镜检，去除非阳性根。[0133]筛选阳性根后分别接种根瘤菌hh103以及rhcn突变体，接种28d后统计根瘤表型，结果如图所示 (图10)，过表达gmmpk6a以及gmmpk6b在接种hh103和rhcn突变体后根瘤数以及根瘤干重显著减少。同时过表达gmmpk6a以及gmmpk6b在接种根瘤菌后瘤数上无显著差异，而瘤干重具有较大的差异，表明gmmpk6a和gmmpk6b在根瘤菌侵染期，具有相似功能，而gmmpk6b也作用于根瘤发育过程，结合启动子元件分析以及组织表达的qrt-pcr，推测gmmpk6b可能在结瘤后期抑制根瘤的发育。综上，gmmpk6a与gmmpk6b均负调控共生结瘤，并且在根瘤共生建立时行使相似的功能。[0134]接种rhcn突变体时，过表达gmmpk6a和gmmpk6b与ev相比，根瘤数明显减少，结合上文qrt-pcr 结果表明，gmmpk6可能响应共生建立时的宿主免疫，而效应因子能够抑制gmmpk6表达。[0135]敲除gmmpk6促进共生结瘤：利用携带有psoy10 gmmpk6-cas9质粒的k599菌株，使用psoy10 空载作为阴性对照，进行毛状根转化，进一步验证mpk6缺失后的结瘤表型。通过荧光体式显微镜，554 nm激发光观测载体上荧光标签蛋白dsred，并去除非阳性根。分别接种hh103以及rhcn突变体，接种后28d统计根瘤数目以及根瘤干重结瘤表型，结果如图(图13)所示。与过表达表型相反，敲除gmmpk6 后，接种hh103根瘤数以及根瘤干重显著增加，进一步证明gmmpk6负调控大豆结瘤。而接种rhcn突变体时，敲除与空载体的毛状根根瘤数与根瘤干重均没有显著差异，结合转录组以及组织表达的结果，表明gmmpk6可能通过介导效应因子的信号传递，并影响宿主免疫，从而影响大豆与根瘤菌共生的建立。[0136]2.gus染色：gus表达的组织化学染色主要参考jefferson等人的方法进行，并有所修改。将接种了 s.fredii hh103与hh103ωrhcn的转基因发根植株生长48hr后,在流水下轻柔清洗地下部(保证至少10 个独立的单株)，获取的全根为新鲜组织为材料,将新鲜材料在-20℃预冷的90％丙酮中真空固定10min, 在冰上静置20min后，用50mm磷酸缓冲液冲洗去除丙酮残留,用预先冷却的gus染液(50mm磷酸钠缓冲液,0.2％triton x-100,5mm k4fe(cn)6,5mm k3fe(cn)6,2mm x-gluc)冰上真空渗透10min,并在37℃下避光孵育12hr。然后通过乙醇(15％,30％,60％,80％)梯度脱水,将样品在体式显微镜下观察。[0137]结果：为分析gmmpk6在大豆与根瘤菌共生建立时的组织表达模式，将含psoy10 gmmpk6apro:gus 和psoy10 gmmpk6bpro:gus的转化毛状根植株移栽到蛭石生长2d后，分别接种hh103以及hh103ω rhcn两种菌株48h取其根进行gus染色，结果如图14中的a所示gmmpk6在大豆根尖存在较高表达，同时gmmpk6a与gmmpk6b表达模式相似，在维管组织内存在更高表达，并且在接种根瘤菌hh103ω rhcn 48h后，转化gmmpk6apro与gmmpk6bpro的gus积累量明显多于接种根瘤菌hh103的一组(图 14中的b)，表明接种hh103ωrhcn能够诱导gmmpk6a与gmmpk6b的表达，这部分结果与前文qrt-pcr 分析结果相似，进一步证明rhcn的突变可以诱导mpk6的表达，并促进免疫反应。[0138]3.根瘤菌侵染线观察[0139]将psoy10 ubi:gmmpk6a:3×myc和psoy10 ubi:gmmpk6b:3×myc的k599菌株，空载体psoy10 作为对照，通过毛状根转化，获得gmmpk6a和gmmpk6b过表达的毛状根材料，转移蛭石中培养2d 后，接种gfp标记的根瘤菌hh103，每株选取3条阳性根(24hpi，接种后小时，hours post inoculation)，选择靠近下胚轴切口处1cm的根剪下，共8组重复。经组织透明化处理，组织透明化方法参考nadzieja 等人clear see的方法，略有改进。获得的待检测组织置于4％多聚甲醛溶液中固定过夜，固定后使用清洗缓冲液(80mm hepes，ph＝7.5)清洗3次，每次10min，以便除尽甲醛。之后使用透明缓冲液(8m 尿素、50％v/v甘油、0.5％triton x-100以及40mm hepes ph＝7.5)透明化处理，待组织完全透明后使用zeiss lsm700荧光共聚焦显微镜观察荧光，并统计侵染事件，包括侵染点，侵染线以及深入皮层的侵染线。[0140]过表达gmmpk6抑制侵染线的形成：大豆与根瘤菌共生建立离不开根瘤菌侵染线的形成，由于 gmmpk6在侵染前期(12hpi)具有显著表达差异，并可能通过介导宿主免疫，抑制共生信号传导，推测 gmmpk6会影响侵染线的形成，为了进一步分析gmmpk6对共生建立时的影响，本研究通过构建gfp 标记的hh103用以观测统计gmmpk6对侵染事件影响。[0141]通过同源重组将细菌强启动子nptⅱ基因序列如seq id no.7所示，与从fu28上扩增的egfp克隆至pfaj1702上，并转化大肠杆菌，菌液pcr鉴定单克隆，条带大小均符合预期(图15)，测序成功后，将获得载体命名为pfaj1702 nptⅱ:gfp。[0142]通过三亲杂交将pfaj1702 nptⅱ:gfp质粒转移至根瘤菌hh103中。简言之，将活化后的携带faj1702 nptⅱ:gfp质粒的大肠杆菌、helper菌株以及野生型根瘤菌按照2:2:1比例混合，在无抗ty固体培养基上28℃培养48h，刮取菌苔用500μl无抗ty培养基重悬，涂抹至含有tet以及rif抗性的固体ty培养基上，28℃培养至长出单克隆，利用荧光体式显微镜筛选gfp阳性的单克隆，如图(图16)所示。挑取gfp为阳性单克隆进行菌液pcr验证。由于野生型根瘤菌不含有nptⅱ:gfp片段，所以野生型并不能扩增该片段，另外，使用根瘤菌保守基因nifh以及ttsi基因上下游片段分别扩增候选菌落(ttsi基因序列如seq id no.8所示，nifh基因序列如seq id no.9所示，用以证明候选的阳性菌落为根瘤菌。结果如图17所示：除16号以及17号菌液外，其余菌落的pcr产物大小均符合预期，表明完成pfaj1702 nptⅱ:gfp质粒的导入，结合荧光体式显微镜镜检结果，证明突变体构建成功。[0143]为确定荧光片段的导入对gfp标记hh103结瘤能力没有影响，对hh103以及hh103-gfp进行结瘤能力鉴定，结果如图18所示：接种28天后，hh103与hh103-gfp在根瘤数、根瘤干重、豆血红蛋白含量以及固氮酶活性均没有显著差异，证明gfp荧光的导入不影响hh103的结瘤能力，可以用作后续侵染线观测的实验材料。[0144]使用上文提到的psoy10 ubi:gmmpk6a:3×myc和psoy10 ubi:gmmpk6b:3×myc的k599菌株，空载体psoy10作为对照，通过毛状根转化，获得gmmpk6a和gmmpk6b过表达的毛状根材料，转移蛭石中培养2d后，接种gfp标记的根瘤菌hh103(24hpi)通过荧光共聚焦显微镜观测并统计侵染事件。即每株选取3条阳性根，选择靠近下胚轴切口处1cm的根剪下，共8组重复。经组织透明化处理后，通过荧光共聚焦显微镜，统计1cm根的全部侵染事件。侵染事件包括侵染点(foci，infection foci)、未进入皮层内部侵染线(its，infection threads)以及生长进入皮层内部的侵染线(rits，infection threads extendinginto a cortex cell)，侵染事件模式图，以及观测到的实际的侵染事件见图19中的b和c，图19中的a 是证明标记gfp的根瘤菌成功，并且可以发出绿色荧光。[0145]侵染事件统计结果如图(图19中的d)所示：过表达gmmpk6a和gmmpk6b后，侵染点以及未进入皮层的侵染线显著减少，表明过表达gmmpk6抑制侵染线的形成。ev(empty vector空载体)与过表达gmmpk6在生长进入皮层内部的侵染线(rits)表型上之间没有显著性差异，可能是由于观测时间仅为接种后24小时，生长进入皮层的侵染线较少，导致没有显著性差异。综上，结合上述结果可知，gmmpk6 能响应根瘤菌侵染前期的免疫信号，通过影响侵染线的形成，抑制大豆结瘤。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!