一种基于BRET的磷酸盐生物传感器、构建方法及其应用

测量装置的制造及其应用技术一种基于bret的磷酸盐生物传感器、构建方法及其应用技术领域1.本发明属于环境生物领域，特别涉及一种基于bret的磷酸盐生物传感器、构建方法及其应用。背景技术：2.磷是导致水体富营养化的主要因素之一。随着不断增加的工农业磷排放，给水环境带来了巨大威胁，亟需建立针对水体磷酸浓度的快速、灵敏和高通量方法，提高环境监测的效率，进而更有效的防范富营养化危害。然而现有的磷酸盐检测方法存在诸多不足之处：传统的比色分析对低浓度样品不灵敏，耗时长且使用有毒化学试剂；色谱分析需要昂贵的设备和专业的操作；电化学传感器容易受到杂质的严重干扰；纳米酶传感器容易引入有毒污染物。因此，有必要研发特异性强、快速、高通量、环境友好的磷酸盐检测新方法。3.近年来，基于生物发光-共振-能量转移(bret)的生物传感器由于其灵敏度高、能避免光漂白和自体荧光等优点已被广泛应用于医学、食品等领域。bret生物传感器由与配体特异性结合的敏感(识别)元件、生物发光供体及荧光受体组成。由于生物传感器与配体结合后会发生构象变化，影响生物传感器的光学性质，通过建立光学性质与配体浓度的相关关系即可实现配体化合物的识别与检测。4.在细菌中，磷酸盐特殊转运系统(phosphate specific transport，pst)是无机磷酸盐(pi)吸收转运的关键系统。pst系统一般由psts、pstc、psta、pstb和phou5个蛋白组成。其中，磷酸盐结合蛋白psts，为ⅱ型外周质结合蛋白，该蛋白与无机磷酸盐(pi)具有极高的亲和性，负责感知和结合周质空间的pi；该蛋白包括2个相似的球状结构域和一个磷酸盐结合位点。其中，2个球状结构域是psts蛋白的基本骨架，中间以双铰链连接。磷酸盐结合位点是psts蛋白的活性中心，位于2个球状结构域中间(缝隙)。该结合位点由10个氨基酸组成，与球状结构域中的1,2,6-α螺旋的n末端相连，可通过氢键和疏水作用与非溶剂化的pi结合，当其与pi(配体)结合时会发生很大的构象变化，因此可以作为磷酸盐生物传感器的敏感元件。不同菌株的psts蛋白的结构大致相同，其不同之处主要是psts蛋白n端环状结构的有无，相关研究表明，铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，pa)磷酸盐结合蛋白psts的n端含有该环状结构。5.纳米荧光素酶(nanoluc)是一种来自深海虾的工程化萤光素酶，是一种体积小(19kda)、亮度高但稳定的蛋白质，与其他萤光素酶相比，它产生增强和持续的发光。因此，nanoluc可用于作为构建bret生物传感器检测的的生物发光供体。技术实现要素：6.本发明通过对磷酸盐生物传感器进行设计，旨在提供一种基于bret的磷酸盐生物传感器、构建方法以及应用，通过以铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白psts作为敏感元件，以纳米荧光素酶nanoluc为生物发光供体，以黄色荧光蛋白venusδc10为荧光受体，构建了一种用于水体中磷酸盐检测的生物传感器，利用纳米荧光素酶nanoluc能够催化底物呋喃嗪产生460nm的生物发光，并通过共振能量转移激发黄色荧光蛋白venusδc10产生528nm的发射光，当生物传感器结合磷酸盐后会发生构象变化，导致纳米荧光素酶nanoluc与黄色荧光蛋白venusδc10的bret比率改变，且bret比率变化的数值与结合的磷酸盐浓度呈线性相关，由此可实现对磷酸盐的精准检测，从而解决现有磷酸盐检测方法存在化学试剂污染大、反应时间长、操作步骤繁琐、灵敏度低等缺陷。7.为了实现上述目的，本发明技术方案如下：8.一种基于bret的磷酸盐生物传感器，所述生物传感器为对磷酸盐特异性响应的铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白pa pbp、纳米荧光素酶nanoluc和黄色荧光蛋白venusδc10融合得到的融合蛋白，氨基酸序列如seq id no.2所示；其中，所述铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白pa pbp与纳米荧光素酶nanoluc及黄色荧光蛋白venusδc10均通过柔性肽接头连接，所述铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白pa pbp选自铜绿假单胞菌磷酸盐特殊转运系统pst的周质亚基，去除周质前导序列，氨基酸序列如seq id no.1所示；并将所述磷酸盐生物传感器命名为venusδc10-pa pbp-nluc。9.优选的，所述柔性肽接头的氨基酸序列选自(ast c.，等，nat commun，2017，8，431)，序列为glyglythr-glyglyser，即ggt-ggs。10.优选的，所述黄色荧光蛋白venusδc10选自(dippel，a.b.，等，acs chem biol，2020，15，904)，其氨基酸序列如seq id no.3所示；所述纳米荧光素酶nanoluc选自(hall，m.p.，等，acs chem biol，2012，7，1848)，其氨基酸序列如seq id no.4所示。11.本发明目的之二在于提供上述基于bret的磷酸盐生物传感器的构建方法，包括以下步骤：12.s1、质粒的合成：全基因合成黄色荧光蛋白venusδc10与由ggt-ggs柔性接头连接的纳米荧光素酶nanoluc，以venusδc10-ggt-ggs-nluc作为模板，进行pcr基因扩增，并克隆至pet-24b(+)载体，获得重组质粒pet-venusδc10-nluc；全基因合成铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白psts，以其作为模板，进行pcr基因扩增，并插入pet-venusδc10-nluc柔性接头ggt与ggs之间，获得重组质粒pet-venusδc10-pa pbp-nluc；13.s2、转化与表达：将步骤s1构建的重组质粒pet-venusδc10-pa pbp-nluc在表达载体大肠杆菌e.coli bl21(de3)菌株中转化，并涂布在卡那霉素抗性lb平板中培养，待其长出菌落，每个菌落即为一个单克隆，挑选培养得到的单克隆菌株接种至卡那霉素抗性lb液体培养基中，培养至od600＝0.6～1.0，经iptg诱导表达后，离心，收集细菌；14.s3、裂解与纯化：将步骤s2收集的细菌重悬至tbs缓冲液中，向其中添加pmsf和溶菌酶，超声裂解，离心收集上清液，纯化，保存，得到生物传感器蛋白。15.优选的，步骤s2中，所述卡那霉素抗性lb固体培养基的质量体积浓度为100μg/ml，所述卡那霉素抗性lb液体培养基的质量体积浓度为50μg/ml；所述诱导表达条件为：0.1～1mm iptg，温度为16～30℃，转速为100～200rpm；所述在卡那霉素抗性lb液体培养基中培养条件：温度为30～37℃，转速为100～200rpm。16.优选的，步骤s3中，所述裂解条件为：裂解温度为0～4℃，功率为100～150w，裂解时间为15～30min。17.本发明的目的之三在于提供所述基于bret的磷酸盐生物传感器在水体中磷酸盐检测中的应用。18.优选的，将磷酸盐生物传感应用于水体中磷酸盐检测的方法，包括如下步骤：19.a1、采集水样：对所需测定的水体进行取样，得到水体样本，然后在得到的水体样品中加入ph调节剂，调节ph值至6～8，过滤，得到待测水样试样；20.a2、配制检测缓冲液、呋喃嗪使用液、磷酸盐标准储备液、磷酸盐标准使用液及生物传感器蛋白溶液，备用；21.a3、配制磷酸盐标准溶液：分别吸取不同体积的磷酸盐标准储备液和磷酸盐标准使用液于离心管中，用超纯水稀释配制成浓度为0.0001mg/ml、0.0005mg/ml、0.001mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.50mg/ml、1.00mg/ml、5.00mg/ml、10.00mg/ml、50.00mg/ml的磷酸盐系列标准溶液；22.a4、绘制标准曲线：将步骤a2中配制的磷酸盐系列标准溶液分别置于酶标板中，向其中加入生物传感器蛋白溶液，并在室温下孵育8～12min，再加入呋喃嗪使用液，得到生物发光共振能量转移检测体系，在双波长发光测量模式下测定发光强度bl，其中，双波长参数设置分别为460/40nm和528/20nm，然后根据下式(1)计算bret比率，再以bret比率为纵坐标，以磷酸盐标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线；[0023][0024]将绘制的曲线进行非线性拟合，得到拟合方程，见下式(2)：[0025][0026]式中，bretmax为bret比率的最大值，bretmin为bret比率的最小值，x为磷酸盐溶液的浓度，x0为拟合参数，h为hill斜率，s为控制因子；[0027]a5、获得待测水样中磷酸盐浓度：将待测水样试样代替磷酸盐标准溶液，重复步骤a3，得到生物发光共振能量转移检测体系，在双波长发光测量模式下测量发光强度，通过式(1)和式(2)，计算得到待测水样中磷酸盐浓度。[0028]优选的，步骤a2中，所述检测缓冲液由10～100mm tris与50～250mm nacl混合得到，ph为7.4～8.0；所述生物传感器蛋白溶液的工作浓度为1～20nm，所述呋喃嗪使用液的工作浓度为10～20μm。[0029]所述生物发光共振能量转移检测体系中，所述磷酸盐标准溶液、生物传感器蛋白溶液和呋喃嗪使用液的体积比为20μl：80μl：20μl。[0030]优选的，步骤a1中，还包括a1′、利用氧化剂对待测水样进行微波消解处理。该步骤适用于测定水样中的总磷含量，如果仅测定水样中无机磷酸盐含量，则省略此步骤；[0031]优选的，所述水样包括自来水、地表水和城市污水。[0032]与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：[0033](1)本发明通过将对磷酸盐特异性响应的铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白pa pbp插入黄色荧光蛋白venusδc10与纳米荧光素酶nanoluc之间，构建了生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc，该生物传感器对磷酸盐具备极强的选择性，通过耦合生物发光共振能量转移技术，能够将磷酸盐浓度信号转换为比率荧光信号输出，实现对水体中磷酸盐的快速、灵敏chem biol，2020，15，904)，其氨基酸序列如seq id no.3所示；所述纳米荧光素酶nanoluc选自(hall，m.p.，等，acs chem biol，2012，7，1848)，其氨基酸序列如seq id no.4所示；并将上述磷酸盐生物传感器命名为venusδc10-pa pbp-nluc；[0048]上述基于bret的磷酸盐生物传感器的构建方法，包括以下步骤：[0049]s1、质粒合成：全基因合成黄色荧光蛋白venusδc10与由ggt-ggs柔性接头连接的纳米荧光素酶nanoluc，以venusδc10-ggt-ggs-nluc作为模板，进行pcr基因扩增，并克隆至pet-24b(+)载体，获得重组质粒pet-venusδc10-nluc；从pdb数据库中获取铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白(pseudomonas aeruginosa，pdb id：4omb)序列，并删去其周质信号序列，全基因合成铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白psts，以其作为模板，进行pcr扩增，并插入pet-venusδc10-nluc柔性接头ggt与ggs之间，获得重组质粒pet-venusδc10-pa pbp-nluc，测序验证序列无误，保存于e.coli top10菌株中，获得的重组质粒pet-venusδc10-pa pbp-nluc的图谱如图1所示；[0050]s2、转化与表达：将步骤s1构建的重组质粒pet-venusδc10-pa pbp-nluc在表达载体大肠杆菌e.coli bl21(de3)菌株中转化，并涂布在100μg/ml卡那霉素抗性lb平板中培养，待其长出菌落，每个菌落即为一个单克隆，挑选培养得到的单克隆菌株接种至50μg/ml卡那霉素抗性lb液体培养基，在37℃，150rpm条件下培养至od600＝0.6～1.0，经0.5mm iptg在25℃，150rpm条件下诱导表达4h后，5000g，4℃离心，收集细菌；[0051]s3、裂解与纯化：将步骤s2收集的细菌重悬至tbs缓冲液(0.05m，ph 7.4)中，依次添加1mm pmsf和1mg/ml溶菌酶，在温度为4℃、功率为120w的条件下超声裂解15min，然后在转速为10000rpm下离心，收集上清液，再通过镍柱(ni-nta)纯化得到磷酸盐生物传感器蛋白，并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)表征生物传感器蛋白的表达纯化，如图2所示，为生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc表达纯化的sds-page验证结果示意图；由图2结果可知，本实施例构建的生物传感器蛋白的分子量均为预期的80kda左右，最后使用超滤离心管(截留分子量30kda)将磷酸盐生物传感器蛋白透析至保存缓冲液(25mm tris，250mm nacl)中，通过nanodrop one(thermo scientific)a280法定量生物传感器蛋白浓度，-80℃保存。[0052]对上述构建的生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc的结构和关键氨基酸进行说明，具体地，使用phyre2服务器对上述生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc进行多模板同源建模，并对建模结果进行验证(拉马钱德兰图、z-score等)，确定模型符合进一步研究的要求，并采用auto dock vina进行分子对接，获得结合口袋的相互作用关键氨基酸，如图3所示，为对生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc同源建模及分子对接结果的示意图。[0053]上述基于bret的生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc，其原理如图4所示，由于纳米荧光素酶nanoluc的发射光谱与黄色荧光蛋白venusδc10的激发光谱有很好的重叠，能产生有效的能量转移，当构建的生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc结合磷酸盐时，纳米荧光素酶nanoluc与黄色荧光蛋白venusδc10之间距离会拉近或角度发生旋转，即构象发生变化，导致nanoluc与venusδc10的bret比率改变，且结合的磷酸盐越多，bret比率变化越大，直至饱和。具体地，利用纳米荧光素酶nanoluc能够催化底物呋喃嗪产生450nm的生物发光，并通过共振能量转移激发黄色荧光蛋白venusδc10产生528nm的发射光，当磷酸盐生物传感器结合磷酸盐后，导致纳米荧光素酶nanoluc与黄色荧光蛋白venusδc10的bret比率改变，且bret比率改变的数值与磷酸盐浓度呈线性相关，由此可实现对磷酸盐浓度的精准检测。[0054]鉴于此，将上述构建的磷酸盐生物传感venusδc10-pa pbp-nluc应用于检测水体中的磷酸盐，包括如下步骤：[0055]a1、采集水样：采集100ml水样于采样瓶中(含磷量较少的水样，避免使用塑料瓶采样，因为磷酸盐易吸附在塑料瓶壁上)，得到水体样本，使用1m naoh或hcl调节ph值至6～8，然后使用滤膜孔径为0.45μm的针筒过滤器(水系，pes)过滤，去除样品中存在的悬浮颗粒物，于4℃保存；[0056]a2、试剂配制：[0057]检测缓冲液(25mm tris，250mm nacl)：称取7.3050g nacl溶解于12.50ml tris-hcl缓冲液(1m,ph 7.4)中，并用超纯水(18.2mω·cm)将其定容于1000ml容量瓶中，4℃下保存；[0058]呋喃嗪贮备液(1mm)：称取0.50mg呋喃嗪，溶解于1.3110ml二甲基亚砜中，于-20℃下保存。[0059]呋喃嗪使用液(20μm)：取出保存的呋喃嗪贮备液置于室温中缓慢溶解，取24μl呋喃嗪贮备液稀释至1200μl mes缓冲液(100mm,ph 6.0)中，此溶液现配现用；[0060]生物传感器蛋白溶液(5nm)：取出上述保存的生物传感器蛋白溶液(2μm)置于4℃冰浴中缓慢溶解，使用检测缓冲液将传感器蛋白稀释400倍，配制体积应大于10ml，置于4℃冰浴中保存，现配现用；[0061]磷酸盐标准贮备液(50mg/l)：取适量磷酸二氢钾(kh2po4)于110℃干燥2h，在干燥器中冷却后准确称量0.2197±0.001g，用超纯水溶解后将其定容于1000ml容量瓶中；[0062]磷酸盐标准使用液(50μg/l)：将1.0ml的磷酸盐标准贮备液转移至1000ml容量瓶中，用超纯水稀释至标线并混匀，此溶液现配现用；[0063]a3、配制磷酸盐标准溶液：[0064]分别吸取不同体积的磷酸盐标准储备液和磷酸盐标准使用液于36支10ml离心管中，用超纯水稀释配制成浓度为0.0001mg/ml、0.0005mg/ml、0.001mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.50mg/ml、1.00mg/ml、5.00mg/ml、10.00mg/ml、50.00mg/ml的磷酸盐系列标准溶液(每组浓度设置3组平行)，详见下表1：[0065]表1配置的磷酸盐标准溶液[0066]管号123456789101112磷酸盐标准贮备液(ml)0000000.020.10.21210磷酸盐标准使用液(ml)0.020.10.21210000000超纯水(ml)9.989.99.89809.989.99.8980磷酸盐标准溶液浓度(mg/l)0.00010.00050.0010.0050.010.050.10.5151050[0067]a4、绘制标准曲线：分别称取20μl步骤a2中配制的磷酸盐系列标准溶液(每组浓度设置3组平行)于96孔全黑酶标板中，向其中加入80μl生物传感器蛋白溶液，并在室温下孵育10min，再加入20μl呋喃嗪使用液，得到生物发光共振能量转移检测体系，同时以不加磷酸盐标准溶液作为空白溶液，使用酶标仪测定460/40nm与528/20nm处的发光强度，然后根据下式(1)计算bret比率，再以bret比率为纵坐标，以磷酸盐标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，即生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc对磷酸盐的标准曲线，如图5所示；[0068][0069]将绘制的曲线进行非线性拟合，得到拟合方程，见下式(2)：[0070][0071]式中，bretmax为bret比率的最大值，bretmin为bret比率的最小值，x为磷酸盐溶液的浓度，x0为拟合参数，h为hill斜率，s为控制因子；[0072]根据下式(3)计算δbret，δbret表示磷酸盐配体引起的生物传感器的动态范围：[0073][0074]式中，bret0表示不加磷酸盐(空白)测得的bret比率，bret100表示加磷酸盐标准溶液测得的bret比率，通过计算得到δbret为25.1％，表明本发明构建的生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc响应于磷酸盐浓度的增加，bret比率有显著地变化；[0075]根据下式(4)计算ec50，ec50表示50％bret比率变化对应的磷酸盐浓度：[0076][0077]得到ec50为355.91nm，由于ec50与表观解离常数kd数值相同，故表观解离常数kd为355.91，从而表明本发明构建的生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc对磷酸盐有极强的亲和力，由图5结果，可进一步得到生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc检测磷酸盐的检测限和检测范围分别为0.0048mg/l和0.0096～0.3700mg/l，与国家标准《gb 11893-89》钼酸钠分光光度法中检出限(0.01mg/l)和检测上限(0.6mg/l)相比，本发明生物传感器法检测磷酸盐具有更好的检出限和检测范围。此外，本实施例中采用96孔酶标板进行测量，每组水样设置3组平行的情况下，一次10min的读板可测定20个水样，具备在短时间内实现高通量检测的能力。[0078]实施例2[0079]与实施例1不同之处在于，[0080]对实施例1中构建的生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc进行选择性分析：[0081](ⅰ)干扰溶液配制：选择在水环境中与磷酸盐共存或易产生干扰的阴离子，即分别配制质量体积浓度为10mg/l的no3-、no2-、so42-、hcoo-、ch3coo-、cl-、f-以及1mg/l的aso43-，同时配制10mg/l的po43-溶液；[0082](ⅱ)生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc的动态范围δbret的测定：使用检测缓冲液(25mm tris、250mm nacl)将生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc蛋白稀释至5nm，得到生物传感器蛋白溶液，然后使用0.1m mes缓冲液配置20μm呋喃嗪使用液，在黑色96孔板中加入80μl上述生物传感器蛋白溶液，并分别与20μl上述干扰阴离子溶液、po43-溶液混合，然后在室温孵育10min后，加入20μl 20μm呋喃嗪使用液，同时以不加干扰离子或者po43-作为空白溶液，使用synergy h1(biotek)酶标仪测定460/40nm与528/20nm处的发光强度(设置3个平行样)，然后根据式(1)和下式(5)，计算bret比率变化的百分比，即干扰δbret，干扰δbret表示干扰离子引起生物传感器响应的动态范围；[0083][0084]式中，bret0为空白溶液测得的bret比率，bret100为不加po43-溶液或干扰离子溶液测得的bret比率；[0085](ⅲ)结果分析：如图6所示，为得到的上述八种干扰阴离子以及po43-引起的生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc动态范围的变化示意图；由图6可知，由于干扰离子aso43-与生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc靶标分子po43-在结构上具有极高的相似性，因此在10mg/l的aso43-作用下生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc产生了明显的信号响应，但该生物传感器对aso43-的亲和力远小于po43-，因此，在0.001～1mg/l范围内aso43-的存在不会对生物传感器检测无机磷酸盐(pi)产生干扰，而其他阴离子则完全不会造成干扰，从而表明本发明构建的生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc选择性优异。[0086]实施例3[0087]与实施例2不同之处在于：[0088]生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc检测自来水水样中磷酸盐的加标回收率实验，包括以下步骤：[0089](ⅰ)待测水样配制：采集适量南京市自来水，使用孔径为0.45μm的针筒过滤器(水系、pes)过滤，去除样品中存在的悬浮颗粒物，向处理后的水样中添加终浓度为0、0.04mg/l、0.2mg/l、0.6mg/l磷酸盐(pi)标准溶液，得到未加标(空白)自来水水样和加标系列自来水水样，设置3组平行；[0090](ⅱ)加标自来水回收率的测定：使用检测缓冲液(25mm tris、250mm nacl)将生物传感器蛋白稀释至5nm，得到生物传感器蛋白溶液，然后于0.1m mes缓冲液中配置20μm呋喃嗪使用液，在黑色96孔板中加入上述80μl生物传感器蛋白溶液，并分别与20μl梯度浓度的磷酸盐工作溶液(0.001mg/l、0.005mg/l、0.01mg/l、0.02mg/l、0.08mg/l、0.1mg/l、0.4mg/l、1mg/l、5mg/l、10mg/l，通过自来水配制，3组平行)以及未加标(空白)自来水水样和加标系列自来水水样混合，在室温孵育10min后，加入20μl 20μm呋喃嗪使用液，使用synergy h1(biotek)酶标仪测定460/40nm与528/20nm处的发光强度，然后根据式(1)计算得到bret比率，并以bret比率为纵坐标、磷酸盐(pi)工作溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图7所示，然后计算未加标(空白)自来水水样bret比率和加标自来水水样的bret比率，并将得到的bret比率带入拟合的logistic5参数方程(见式2)分别求得实测不加标自来水水样中磷酸盐的浓度x0和实测加标自来水水样中磷酸盐的浓度x；[0091]根据下式(6)计算测定磷酸盐生物传感器法检测自来水中磷酸盐的回收率：[0092][0093]式中，x为实测加标自来水水样中磷酸盐的浓度，x0为实测不加标自来水水样中磷酸盐的浓度，x加标为添加的磷酸盐标准溶液的浓度；[0094](ⅲ)实验结果分析：由图7可知，通过分别测定加入0、0.04mg/l、0.2mg/l和0.6mg/l的磷酸盐标准溶液的未加标(空白)自来水水样和加标系列自来水水样，得到结果依次为0.001mg/l、0.0542mg/l、0.1493mg/l和0.5429mg/l，得到回收率在74.65％～135.5％之间，进而证实了本发明构建的生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc能够用于自来水中磷酸盐的检测。[0095]实施例4[0096]与实施例2不同之处在于：[0097]生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc检测河水水样中磷酸盐的加标回收率实验，包括以下步骤：[0098](ⅰ)加标水样配制：采集适量南京大学天籁河河水，使用孔径为0.45μm的针筒过滤器(水系、pes)过滤，去除样品中存在的悬浮颗粒物；向处理后的水样中添加终浓度为0、0.04、0.12、0.36mg/l磷酸盐标准溶液，得到未加标(空白)河水水样和加标系列河水水样，设置3组平行；[0099](ⅱ)加标河水回收率测定：该步骤同实施例3，绘制的标准曲线如图8所示，然后再根据式(6)计算测定磷酸盐生物传感器法检测河水中磷酸盐的回收率；[0100](ⅲ)结果分析：由图8可知，通过分别测定加入0、0.04mg/l、0.2mg/l和0.6mg/l的磷酸盐标准溶液的未加标(空白)河水水样和加标系列河水水样，得到结果依次为0.0087mg/l、0.057mg/l、0.1439mg/l和0.3323mg/l，回收率在89.89％～120.75％之间，进而证实了本发明构建的生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc能够用于河水水样中磷酸盐的检测。[0101]实施例5[0102]与实施例2不同之处在于：[0103]生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc检测反应器模拟废水水样中磷酸盐的加标回收率实验，包括以下步骤：[0104](ⅰ)加标水样配制：采集适量反应器模拟废水，使用孔径为0.45μm的针筒过滤器(水系、pes)过滤，去除样品中存在的悬浮颗粒物；由于模拟废水中磷酸盐浓度过高，将其稀释10倍后备用；然后分别向处理后的进出水水样中添加终浓度为0、0.04mg/l、0.12mg/l、0.36mg/l磷酸盐标准溶液，得到未加标(空白)模拟废水水样和加标系列模拟废水水样，设置3组平行；[0105](ⅱ)加标模拟废水回收率测定：该步骤同实施例3，绘制的标准曲线如图9所示；再根据式(6)计算测定磷酸盐生物传感器法检测模拟废水中磷酸盐的回收率；[0106](ⅲ)结果分析：由图9可知，通过分别测定加入0、0.04mg/l、0.12mg/l和0.36mg/l磷酸盐标准溶液的未加标(空白)模拟废水水样和加标系列模拟废水水样，得到结果依次为0.2231mg/l、0.2532mg/l、0.3923mg/l和0.6439mg/l，回收率在75.25％～116.89％之间，进而证实了本发明制备的生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc能够用于模拟废水水样中磷酸盐的检测。[0107]序列设计表[0108]seq id no.1[0109]铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白pa pbp的氨基酸序列：mklkrlmaaltfvaagvgaasavaaidpalpeyqkasgvsgnlssvgsdtlanlmtmwaeeykrlypnvniqiqaagsstappaltegtanlgpmsrkmkdvelqafeqkygykptavpvavdalaifvhkdnpikgltmqqvdaifsatrlcgskqdvktwgdlgltgdwakkpvqlfgrnsvsgtygyfkeealckgdfrpnvneqpgsasvvqsvsqslngigysgigyktasvktvalakkegaafvedneqnalngtyplsrflyvyvnkapnkpldpleaqflklvlsktgqqvvvkdgyiplpakvaekaikelgl[0110]seq id no.2[0111]生物传感器venusδc10-pa pbp-nluc的氨基酸序列：[0112]masmtggqqmgrgsmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlklicttgklpvpwptlvttlgyglqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyitadkqkngikanfkirhniedggvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylsyqsalskdpnekrdhmvllefvtaagggtaidpalpeyqkasgvsgnlssvgsdtlanlmtmwaeeykrlypnvniqiqaagsstappaltegtanlgpmsrkmkdvelqafeqkygykptavpvavdalaifvhkdnpikgltmqqvdaifsatrlcgskqdvktwgdlgltgdwakkpvqlfgrnsvsgtygyfkeealckgdfrpnvneqpgsasvvqsvsqslngigysgigyktasvktvalakkegaafvedneqnalngtyplsrflyvyvnkapnkpldpleaqflklvlsktgqqvvvkdgyiplpakvaekaikelglggsmvftledfvgdwrqtagynldqvleqggvsslfqnlgvsvtpiqrivlsgenglkidihviipyeglsgdqmgqiekifkvvypvddhhfkvilhygtlvidgvtpnmidyfgrpyegiavfdgkkitvtgtlwngnkiiderlinpdgsllfrvtingvtgwrlcerilaklaaalehhhhhh*[0113]seq id no.3[0114]黄色荧光蛋白venusδc10的氨基酸序列：[0115]mvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlklicttgklpvpwptlvttlgyglqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyitadkqkngikanfkirhniedggvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylsyqsklskdpnekrdhmvllefvtaag[0116]seq id no.4[0117]纳米荧光素酶nanoluc的氨基酸序列：[0118]mvftledfvgdwrqtagynldqvleqggvsslfqnlgvsvtpiqrivlsgenglkidihviipyeglsgdqmgqiekifkvvypvddhhfkvilhygtlvidgvtpnmidyfgrpyegiavfdgkkitvtgtlwngnkiiderlinpdgsllfrvtingvtgwrlcerila[0119]本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所做出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。









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