一种预防与治疗老年人行动迟缓的细胞疗法的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及医学领域，尤其涉及一种预防与治疗老年人行动力迟缓的方法。背景技术：2.全世界的人口老龄化正在加速。预计到2050年世界65岁以上人口将达到20亿。我国的老龄化问题同样日趋严重。随着年龄的增长，老年人的身体器官和生理机能开始下降，主要体现为适应和感知环境的能力开始逐渐减弱，中枢及周围神经系统功能开始退化，骨骼及肌肉系统功能退化，这些变化不仅严重影响了老年人的生活质量，还为老年人的照顾者增添了看护负担。3.免疫系统的老化是老年人生理机能下降的开端，其特征是干细胞减少、t淋巴细胞生成改变、b细胞导致的抗体反应减弱以及中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的吞噬活性降低，这会进一步导致其他系统如大脑、内分泌系统的紊乱，进而加剧老年人的衰弱。4.淋巴细胞回输是一种细胞免疫治疗方法。主要方式为收集患者的淋巴细胞在体外培养和扩增，然后回输到患者体内。输注的自体免疫细胞能够促进免疫系统的重建。目前这种方法已经被广泛应用于癌症和自身免疫性疾病的治疗，表明这种方法具有一定的安全性和可靠性。因此，通过淋巴细胞回输的方法增强老年人的免疫能力可能是缓解老年人的生理机能退化的新方法。技术实现要素：5.鉴于背景技术存在的不足，本发明涉及一种预防与治疗老年人行动迟缓的细胞疗法，可以解决老年人反应迟缓、记忆力衰退和运动力下降的问题。6.本发明涉及一种采用患者自身的外周血的淋巴细胞治疗行动力迟缓症状的细胞疗法。7.进一步的，所述治疗行动力迟缓症状包括治疗老年人神经退化导致的行动力迟缓与治疗因疾病引发的神经疾病导致的行动力迟缓。8.本发明还提供了一种采用患者自身的外周血的淋巴细胞预防行动力迟缓症状的细胞疗法。9.进一步的，所述预防行动力迟缓症状包括预防老年人中枢神经系统退化与预防老年人罹患神经退行性疾病。10.本发明还提供一种用于缓解老人行动迟缓的方法，具体包括如下步骤：11.s1、提取患者外周血的淋巴细胞；12.s2、对淋巴细胞进行体外培养扩增；13.s3、对扩增的淋巴细胞进行筛选，输至患者体内。14.本发明还提供了一种治疗动物行动迟缓的细胞免疫疗法，所述细胞免疫疗法的方式为一周回输至体内，且具有4周-6周的间隔期。15.本发明还提供了一种治疗大鼠行动迟缓的细胞免疫疗法。16.本发明的主要有益效果：17.1、本发明能增强小胶质细胞和星形胶质细胞活力，起到防止老年人中枢神经系统退化和降低老年人罹患神经退行性疾病的风险；18.2、治疗以促进神经细胞再生和免疫力发挥作用；19.3、通过细胞免疫治疗后，增强老年探索能力、活跃能力、体能和记忆力；20.4、降低老年人发生神经退行性疾病的风险；21.5、降低老年人中枢神经系统退化。附图说明22.图1是本发明免疫荧光检测脑组织海马区ki67，iba1和gfap的表达。具体实施方式23.以下将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述和讨论，显然，这里所描述的仅仅是本发明的一部分实例，并不是全部的实例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。24.为了便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以具体实施例为例作进一步的解释说明，且各个实施例不构成对本发明实施例的限定。25.本发明的实施例1，涉及一种预防与治疗老年人行动力迟缓的方法，具体实验方法如下：26.1、动物分组：27.实验前准备5只雌性青年sd大鼠(200～250g)和10只雌性老年sd大鼠(250～290g)。随机将雌性老年sd大鼠为治疗组和正常组，每组5只，青年大鼠正常饲养，并分别对各组大鼠1～5号进行编号。实验分成三组，治疗老年大鼠组，正常老年大鼠组和正常青年大鼠组。治疗老年大鼠接受淋巴细胞回输，正常老年大鼠和正常青年大鼠正常饲养。28.2、淋巴细胞提取：29.加入适量的磷酸缓冲液(pbs)在5支15ml离心管中。对5只老年大鼠眼眶静脉丛取血，然后将全血收集并加入对应编号有pbs的离心管里稀释。在另外5支15ml离心管里加入适量外周血淋巴细胞分离液，将稀释后的大鼠血液平铺于分离液上方。室温，水平转子500-1000g，离心20-30min，离心转速最大不超过1200g。离心后，弃上清，加5ml的pbs重悬细胞，在25t培养瓶里加入完全培养基(22.5ml dmem细胞培养基+22.5ml f12细胞培养基+5ml胎牛血清)，将重悬的细胞放入培养瓶，再把细胞放入37℃二氧化碳培养箱培养。30.3、体外扩增大鼠淋巴细胞：31.25t培养瓶里的大鼠淋巴细胞培养3-4天后进行传代，收集淋巴细胞，用生理盐水重悬细胞。32.4、淋巴细胞回输：33.分别在第0天、第7天、第13天，将不同编号的老年大鼠血液提取的淋巴细胞用注射器通过尾静脉注入对应编号的老年大鼠体内。34.其实验结果如下：35.1、大鼠的体重和精神状态：36.治疗后的老年大鼠在治疗后的第13天和第14天比正常大鼠体重高。大鼠的精神状态正常。如表1所示。37.表1、大鼠体重记录表[0038][0039]注：“**”表示p＜0.01，“*”表示p＜0.05，下同。[0040]关于大鼠行为学实验：[0041]1、矿场实验[0042]在80cm×80cm×80cm的旷场箱底部标记5×5个16cm×16cm的正方形方格。实验开始前两组大鼠适应环境10min，后将大鼠置于旷场箱底部正中央，记录5min内大鼠中央停留时间、总穿格次数，总站立次数，总梳毛次数。停止记录后，酒精清扫旷场箱，避免气味残留后进行下一只大鼠实验。连续测定2次，取平均值。[0043]结果如表7-8所示，与正常老年大鼠相比，治疗后老年大鼠中央停留时间长(p＜0.05)，穿格次数多(p＜0.05)，站立次数多(p＜0.05)差异具有显著性。虽然治疗老年大鼠梳毛次数多于正常老年大鼠，但差异没有显著性(p＞0.05)。[0044]2、握力实验：[0045]实验前训练两组大鼠，以保证能在光滑塑料棒上保持一定的时间，正式试验前，清理塑料棒，将大鼠放在棒上，使肌肉处于静力紧张状态，用秒表记录大鼠由于肌肉疲劳从棒上跌落时间，连续进行3次，取平均值。[0046]结果如表9-10所示，与正常老年大鼠相比，治疗后老年大鼠握力试验坚持时间更长(p＜0.05)。[0047]表2、大鼠握力试验坚持时间[0048][0049]3、埋珠实验：[0050]将实验鼠放入上述旷场实验旷场箱中适应10min。然后将实验鼠轻轻拿出。将20颗玻璃弹珠以4×5的排列均匀地放置在垫料上。实验前将实验鼠小心地放入装有玻璃弹珠的矿场箱中，允许其自由活动30min。计算其掩埋玻璃弹珠的数量(垫料覆盖面积超过2/3)。[0051]结果如表6所示，与正常老年大鼠相比，治疗老年大鼠埋珠数量更多，但不存在显著性差异(p＞0.05)。[0052]表3、大鼠埋珠试验结果[0053][0054]三、免疫荧光[0055]收集各组大鼠脑组织制作石蜡切片(4μm)。70℃烘片40min，脱蜡至水，pbs缓冲液(ph7.4)冲洗3次，每次3min，过氧化氢去除内源性过氧化物，pbs缓冲液(ph 7.4)冲洗3次，每次3min，柠檬酸钠抗原修复液修复20min，pbs缓冲液(ph 7.4)冲洗3次，每次3min，甩去pbs，孵育5％山羊血清封闭液30min，甩掉封闭液，每张切片滴加50μl一抗(ki67，iba1和gfap)，4℃过夜。第二天室温复温30min，甩去一抗，pbs缓冲液(ph 7.4)冲洗3次，每次3min，滴加二抗，室温孵育2小时。pbs缓冲液(ph 7.4)冲洗3次，每次3min，dapi孵育，抗荧光衰减剂封片。[0056]ki-67表达量无显著性差异，由图1可知，正常组老年大鼠和正常组青年大鼠iba1在脑海马区及周边表达阳性小胶质细胞无明显区别，治疗后的老年大鼠iba1在脑海马区及周边表达阳性小胶质细胞较正常组老年大鼠表达强，活化的小胶质细胞表达增多，呈分枝状，细胞体较大。正常组老年大鼠和青年大鼠gfap在脑海马区及周边表达无明显区别，治疗后的老年大鼠gfap表达明显高于正常组老年大鼠表达。[0057]最后应说明的是：以上所述实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。









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