一种嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的巨噬细胞及应用的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及肿瘤治疗领域，具体涉及细胞免疫治疗肿瘤，尤其涉及nkg2dcar-m细胞免疫疗法，更具体地涉及一种嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的巨噬细胞及应用。背景技术：2.2018年全球肿瘤统计结果显示，仅仅一年，全球新增患者1,810万，死亡患者高达960万，其中单单我国就有新增病例380.4万，死亡病例29.6万。如此严峻的形势严重威胁着我国国民健康，并为社会经济造成巨大的负担。尽管随着医药科技的飞速发展，越来越多的方法手段被用于肿瘤的治疗，但是远远还不够。因此，在未来很长的一段时间内开发研究肿瘤治疗的新方法依旧是重中之重。3.一直以来，恶性肿瘤的治疗疗效不足、治愈率低，使之成为严重威胁着人类健康的重大疾病。传统的放化疗法旨在直接消灭肿瘤，但肿瘤常复发转移，又会杀伤正常组织细胞。肿瘤的细胞免疫治疗的目的则是促进或修饰免疫细胞攻击癌细胞，同时保持正常细胞的完整性。与传统的放化疗相比，细胞的过继治疗具有良好的特异性、安全性、有效性和持久性，在2013年十大科技进步中排名第一。4.近年来，以dcs、t细胞、nk细胞等为基础的过继性细胞治疗在肿瘤治疗中取得了较好的效果。尤其是以嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell,car-t)为代表的免疫细胞治疗技术在血液肿瘤的治疗上展现出了强大的疗效和巨大的发展潜力，已然成为人类对抗癌症的新希望。嵌合抗原受体(car)t细胞免疫疗法是一种肿瘤过继细胞免疫疗法，基本原理是利用基因工程修饰t淋巴细胞，使其表达嵌合抗原受体，以非主要组织相容性复合体(mhc，major histocompatibility complex)限制性的方式杀伤肿瘤细胞。虽然cart细胞在临床及临床试验中取得了较好的效果，但同时也出现了较为严重的副作用，包括细胞因子释放综合征、神经毒性和脱靶效应等。而且，car-t细胞疗法对血液系统恶性肿瘤的治疗效果十分强大，尤其是在对抗急性淋巴母细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)方面，但用car-t细胞治疗实体瘤的效果并不理想。在实体瘤的治疗中，car-t细胞治疗未取得较大突破有以下几个原因：首先，car-t细胞必须运输并渗透到肿瘤中，这是一个需要外渗，趋化性和基质组织渗透的过程。car-t细胞必须穿过粘附分子减少的异常肿瘤血管，经历趋化因子/趋化因子受体失配，并且必须通过密集的细胞和基质屏障迁移。进入肿瘤微环境(tumor microenvironment,tme)后，效应细胞会遇到不利条件，例如低氧和酸性环境、免疫检查点配体的表达以及大量免疫抑制细胞，如肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage,tam)、髓源性抑制细胞(myeloid derived suppressor cell,mdsc)和调节性t细胞(regulatory cells,t-regs)。此外，长期的抗原接触会导致t细胞衰竭，从而降低car t细胞的效应子功能。即使car-t细胞在tme中存活，实体瘤也经常具有异质的表面抗原表达，这可能导致逃避car t细胞检测，肿瘤清除不完全以及抗原阴性肿瘤细胞的最终生长。这在使用靶向egfrviii的car t细胞治疗胶质母细胞瘤中得到了明确的证明，在治疗后5/7的患者中egfrviii的表达下降了。最后，car-t细胞可能会识别正常组织和细胞中的肿瘤相关抗原，从而导致在靶/脱肿瘤毒性(on-target/off tumor toxicity)，这也是实体肿瘤细胞治疗的另一个障碍。因而，开发新型的抗肿瘤免疫细胞类型，有可能能弥补car-t在这方面的不足，抵抗实体瘤局部肿瘤微环境免疫抑制性的影响，从而起到协同抗肿瘤的效应。5.nkg2d作为c型凝集素超家族中的一员，是固有免疫系统中一个重要的激活性受体，在nk细胞、cd8+t细胞、活化的巨噬细胞和肿瘤浸润的γδt细胞表面均有表达。nkg2d的配体主要有两类：一类是mhc i类链相关的a/b分子(mic-a/b)，另一类ul16结合蛋白1-6(ulbp1-6)。nkg2d配体(nkg2dl)主要在大多数上肿瘤细胞上表达，如胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌等，在正常细胞上几乎不表达。nkg2d/nkg2dl对肿瘤的免疫调节起着相当重要的作用，在肿瘤发生早期启动机体固有免疫监视及清除作用。免疫细胞上的nkg2d通过识别肿瘤细胞表面诱导产生的nkg2d配体来传递活化信号并激活免疫系统，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。但是癌症患者体内的免疫系统往往比较弱，体内免疫细胞的数量较少、杀伤肿瘤细胞的能力较差。6.近年来，巨噬细胞杀伤肿瘤的潜能逐渐受到关注。巨噬细胞拥有其强大的吞噬功能，通过细胞表面受体识别肿瘤细胞，然后对肿瘤细胞进行吞噬。虽然巨噬细胞在肿瘤微环境中也受到免疫抑制性因素的负面影响，但目前对这些负调控因素的研究已经相对充分，而且已经有相应的手段对这些因素进行控制。因而，通过借鉴car-t靶向增强效应t细胞肿瘤杀伤功能的理念，值得探讨将巨噬细胞作为免疫细胞治疗的细胞载体的可能性。技术实现要素：7.为了解决现有技术中car-t治疗实体瘤存在的障碍，包括肿瘤异质性、car-t难以浸润到肿瘤内部、实体瘤免疫抑制微环境的影响，本发明旨在提供一种嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的巨噬细胞及应用。8.本发明的技术方案如下：9.本发明第一方面提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体一级蛋白结构从氨基端到羧基端顺次为：信号肽、nkg2d胞外区、铰链区、跨膜区和胞内信号区；10.所述nkg2d胞外区为人nkg2d的胞外域，其氨基酸序列如seq id no.2所示。11.进一步地，所述信号肽选自cd8α信号肽、cd28信号肽、cd4信号肽或gm-csf信号肽；12.所述铰链区选自cd8α铰链区或cd28铰链区；13.所述跨膜区选自cd8α跨膜区或cd28跨膜区；14.所述胞内信号区选自cd3ζ或fcrγ。15.进一步地，所述信号肽源于人cd8α，其氨基酸序列如seq id no.1所示；16.所述铰链区源于人cd8α，其氨基酸序列如seq id no.3所示；17.所述跨膜区源于人cd8α，其氨基酸序列如seq id no.4所示；18.所述胞内信号区为cd3ζ，其氨基酸序列如seq id no.5所示。19.本发明第二方面提供所述嵌合抗原受体的编码基因。20.本发明第三方面提供含有所述嵌合抗原受体的编码基因的表达载体。21.进一步地，所述表达载体选自慢病毒表达载体、逆转病毒表达载体或腺病毒表达载体。22.本发明第四方面提供一种表达嵌合抗原受体的巨噬细胞，其包含所述嵌合抗原受体的编码基因或所述嵌合抗原受体的编码基因的表达载体。23.进一步地，所述巨噬细胞源自健康人体或癌症患者；24.所述巨噬细胞选自自体巨噬细胞、异体巨噬细胞或ipsc诱导的巨噬细胞；25.优选地，所述巨噬细胞为原代巨噬细胞。26.本发明第五方面提供所述的表达嵌合抗原受体的巨噬细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用。27.进一步地，所述肿瘤为nkg2d配体表达的肿瘤；28.所述肿瘤为血液瘤或实体瘤；29.优选地，所述肿瘤为白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、脑胶质瘤、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌或乳腺癌。30.本发明的有益效果为：31.1、本发明以nkg2d胞外段天然序列作为car识别区，使嵌合抗原受体具有低免疫原性、易表达等优势，可以在巨噬细胞上正常表达，为制备特异性杀伤/吞噬肿瘤细胞的嵌合抗原受体巨噬细胞(car-m)提供基础。优选地以cd3ζ作为胞内信号区，cd3ζ含有的itam结构赋予car-m更好的吞噬/杀伤肿瘤效果。32.2、本发明嵌合抗原受体巨噬细胞(car-m)是在巨噬细胞上装上本发明设计的car，其可以靶向nkg2d配体，从而特异性的杀伤/吞噬肿瘤细胞，实施例中car-原代巨噬细胞证明了car-m的治疗效果。car-m与car-t相比，除了可以直接杀伤肿瘤细胞之外，其优势在于：可以改善实体瘤肿瘤免疫微环境；在吞噬肿瘤细胞后可以作为抗原呈递细胞呈递抗原；更容易浸润到肿瘤内部，协同其他免疫细胞浸润肿瘤等。因此，本发明靶向nkg2d配体的car-m细胞在治疗肿瘤(尤其是实体瘤)方面具有重要应用价值。附图说明33.图1：nkg2d嵌合抗原受体(nkg2d car)的示意图。34.图2：nkg2d car-m细胞car阳性率。35.图3：杀伤48小时后各组的杀伤率统计(效应细胞：靶细胞＝1)。具体实施方式36.为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。37.实施例138.本实施例提供一种nkg2d嵌合抗原受体(nkg2d car)，nkg2d car一级蛋白结构从氨基端到羧基端顺次为：信号肽(signal pep)、nkg2d胞外区(nkg2d ecd)、铰链区(hinge)、跨膜区(tm)和胞内信号区。其中，信号肽可以选自人cd8α、cd28、cd4、gm-csf等的信号肽；铰链区和跨膜区可以选自人cd8α、cd28等的铰链区和跨膜区；胞内信号区可以选自cd3ζ、fcrγ等。39.在一个具体的实施方式中(图1)，信号肽源于人cd8α，其氨基酸序列如seq id no.1所示；nkg2d胞外区为人nkg2d(nm_007360.4)的胞外域，其氨基酸序列如seq id no.2所示；铰链区和跨膜区源于人cd8α，cd8α铰链区氨基酸序列如seq id no.3所示，cd8α跨膜区氨基酸序列如seq id no.4所示；胞内信号区为cd3ζ，cd3ζ提供激活信号，其氨基酸序列如seq id no.5所示。具体核苷酸序列：cd8α信号肽(seq id no.6)、nkg2d胞外区(seq id no.7)、cd8α铰链区(seq id no.8)、cd8α跨膜区(seq id no.9)、cd3ζ胞内信号区(seq id no.10)通过人工合成，得到nkg2d嵌合抗原受体(nkg2d car)序列。40.本实施例中氨基酸和核苷酸序列如下：41.cd8α信号肽氨基酸序列(seq id no.1)：42.malpvtalllplalllhaarp43.nkg2d胞外区氨基酸序列(seq id no.2)：44.iwsavflnslfnqevqipltesycgpcpknwicyknncyqffdesknwyesqascmsqnasllkvyskedqdllklvksyhwmglvhiptngswqwedgsilspnlltiiemqkgdcalyassfkgyiencstpntyicmqrtv45.cd8α铰链区氨基酸序列(seq id no.3)：46.tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd47.cd8α跨膜区氨基酸序列(seq id no.4)：48.iyiwaplagtcgvlllslvitlyc49.cd3ζ胞内信号区氨基酸序列(seq id no.5)：50.rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr51.cd8α信号肽核苷酸序列(seq id no.6)：52.atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg53.nkg2d胞外区核苷酸序列(seq id no.7)：54.atatggagtgctgtattcctaaactcattattcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagaggaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattccaacaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaaaactgttcaactccaaatacgtacatctgcatgcaaaggactgtg55.cd8α铰链区核苷酸序列(seq id no.8)：56.accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat57.cd8α跨膜区核苷酸序列(seq id no.9)：58.atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc59.cd3ζ胞内信号区核苷酸序列(seq id no.10)：60.agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc61.实施例262.(一)本实施例提供nkg2d car-m细胞的制备，具体步骤如下：63.1.nkg2d car腺病毒构建64.nkg2d car腺病毒采用padeasy system重组腺病毒的包装体系进行包装，ad5f35腺病毒包装所用的骨架载体是ad5f35 helper。使用pei对ad5f35相关包装质粒在hek 293细胞中进行转染，待混匀后置于co2培养箱中培养。培养14天后3500g离心收集细胞，加入腺病毒冻存液后重悬沉淀，将悬液在-80℃及37℃反复冻融四次，冻融完成后，12000g离心2min，收集上清。将收集起来的病毒上清平均滴加到10个10cm培养皿中，混匀后置于co2培养箱中培养。2-3天后离心收集上清和细胞，病毒上清加入peg8000和nacl，混匀后4℃直立放置过夜，第二天离心收集上清；细胞沉淀置于-80℃保存，后续加入腺病毒冻存液后重悬后反复冻融4次，高速离心后收集上清。剩余的细胞行超声破碎，离心后收集样本上清。将所有收集的样本混合后，用碘克沙醇密度梯度离心法对病毒进行纯化，最后将纯化好的的病毒溶液通过0.22微米滤膜过滤后分装低温保存。65.2.全血分离人外周血单个核细胞(pbmc)66.在50ml离心管中加入全血25ml，再加入25ml pbs与其混匀；往50ml离心管中加入15ml ficoll试剂，然后沿壁缓慢加入30ml上述稀释好的全血；离心机20℃，2110r/min，升2降2，离心30min；离心之后液体分四层，将最上层黄色液体去掉，转圈吸取第二层白膜层，所得白膜层液体均分成两管，加pbs至40-45ml混匀，离心机20℃，1800r/min，升9降9，离心8min；去上清，加40ml pbs把两管重悬成一管，离心机20℃，1200r/min，升9降9，离心8min；去上清，加40ml pbs重悬计数，剩下的细胞20℃，1200r/min，升9降9，离心8min；去上清，用冻存液冻存备用。67.3.分离人cd14+细胞68.将复苏的pbmc细胞置于离心机中300g离心5min，丢弃上清；4-5ml左右的mojosorttm缓冲液重悬。用70μm的细胞筛网过滤细胞，离心机300g离心5min后去上清，然后用适当体积的mojosorttmbuffer重悬并调整细胞浓度至1×108/ml。往100μl细胞悬液(107个细胞)中加入5μl human trustain fcxtm(fc受体封闭溶液)，混合均匀后室温下孵育10-15min。如果分离更多的细胞，则相应比例增加试剂用量。加入10-20μl biotin-antibody cocktail，混合均匀后冰上孵育15min。如果分离更多的细胞，则相应比例增加试剂用量。加入10-15μl通过最大速度涡旋重悬的streptavidin nanobeads，混合均匀后冰上孵育15min。如果分离更多的细胞，则相应比例增加试剂用量。加入4ml的mojosorttm缓冲液以洗涤细胞，置于入离心机300g离心5-10min后丢弃上清。加入2.5-5ml mojosorttm缓冲液重悬细胞于干净的流式管中，并将其放在磁力架中静置5min。倒出并收集液体于一新的15ml离心管中备用。然后用2.5ml mojosorttm缓冲液重悬剩下的沉淀。将收集好的液体合并，置于离心机300g离心5min后用制备好的人原代巨噬细胞培养基(rpmi-1640培养基中加入10％的fbs、1％的ps和终浓度为10-50ng/ml的人gm-csf)重悬并计数，接种于非tc处理的6孔板中培养。可以另取一小部分细胞用作于流式染色，以检测其纯度。69.4.人原代巨噬细胞的培养70.用配制好的人原代巨噬细胞培养基培养分离好的人cd14+细胞于非tc处理的6孔板中(3-10×105/ml)，37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。于第三天轻轻吸取上清半量换液，第五天全量换液后获得的贴壁细胞则为人原代巨噬细胞。71.5.腺病毒感染人原代巨噬细胞72.分离好的人cd14+细胞计数后培养于非tc处理的6孔板中(3-8×105/ml)；5天后按照moi＝200-1000的病毒滴度加入腺病毒(对照病毒及nkg2d car腺病毒)；24-48h后换成不带病毒的培养基；48-60h后用检测car-m的阳性率：将消化下来的car-m进行流式染色检测car的表达。73.流式结果显示(附图2)：nkg2d car-m的阳性率》50％。表明成功制得得到靶向nkg2d的人原代car-m细胞。74.(二)通过下述方法检测人原代car-m对肿瘤细胞的杀伤作用75.采用spectrostar omega酶标仪对荧光强度进行采集分析进行细胞杀伤实验。首先把nkg2d car-m、empty m(以腺病毒感染)和utd-m(未加病毒处理)细胞以2-5×104/孔接种至不透光的96孔细胞培养板中，每组5-10个复孔，静置24-48h。24h后按照效应细胞：靶细胞＝1：1的比例加入稳定表达luciferase的pc-3细胞(无血清，无m-csf的dmem培养基)，与各组bmdm共培养。实验共分为4组：blank组；utd-m组(未加病毒感染)；empty m细胞组(加入腺病毒对照组)和nkg2d car-m组(加入nkg2d car腺病毒组)。76.37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24-48h后，向不透光96孔板中加入浓度为100-200μg/ml的d-luciferin，potassium salt底物，37℃避光孵育10min后，使用spectrostar omega酶标仪对荧光强度进行采集分析，并通过以下公式nkg2d car-m对pc-3靶细胞的溶解进行计算：77.％细胞溶解(lysis％)＝【1-(共培养细胞的荧光信号-背景荧光信号)/78.(单独培养pc-3细胞荧光信号-背景荧光信号)】*10079.pc-3细胞的杀伤结果如附图3所示：utd-m组和empty组细胞对肿瘤细胞的杀伤作用均比较弱，nkg2d car-m组对肿瘤细胞的杀伤作用显著增强，证明了nkg2d car-t的靶向杀伤功能。80.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。









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