大豆GmNAC039或GmNAC018在调控植物根瘤固氮和/或调控产量中的应用

有机化合物处理,合成应用技术大豆gmnac039或gmnac018在调控植物根瘤固氮和/或调控产量中的应用技术领域1.本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及大豆gmnac039或gmnac018在 调控植物根瘤固氮和/或调控产量中的应用。背景技术：2.豆科植物与根瘤菌互作形成根瘤进行共生固氮，宿主植物为根瘤菌提供碳 源，而根瘤菌为植物提供生长所需的氮素。豆科植物需要严格控制根瘤的数目、 发育及衰老来调控共生固氮效率，最终实现宿主植物利益最大化。大豆是人类 植物蛋白和植物油的主要来源，在我国粮食结构中占有重要地位，但我国大豆 产量不足以满足人们的需求。因此，有待于提高大豆的产量来满足人们日增增 长的需求。大豆根瘤共生为植物全生育期提供大部分氮素，为解决大豆后期氮 需求增加与固氮效率降低之间的矛盾，可以适当延缓根瘤衰老、延长根瘤固氮 时间来提高大豆生育期总固氮量和保障生殖生长时期氮素充足供应，有效缓解 氮肥引起的环境问题，实现农业生态可持续发展。3.豆科植物根瘤衰老是一个高度受控的过程，发育和环境因素都能导致根瘤 衰老，如干旱和高硝酸盐水平。在根瘤衰老过程中，类菌体裂解，在侵染细胞 的细胞质内形成大量囊泡，随后侵染细胞衰老。在豆科模式植物苜蓿中， mtnac920直接激活衰老相关基因半胱氨酸蛋白酶mtcp2转录，促进根瘤衰老 (de zelicourt et al.,2012)。苜蓿nac潜在的靶基因mtcp6和mtvpe的基因 沉默能够延缓根瘤衰老，延长根瘤生长和固氮时间(perez guerra et al.,2010； pierre et al.,2016)。同样，在豆科植物根瘤早衰突变体中存在大量nac转录因 子的上调表达(wang et al.,2016；wang et al.,2019)。目前尚未有关于gmnac039 或gmnac018在调控植物根瘤衰老的报道。技术实现要素：4.本发明的目的在于提供大豆gmnac039或gmnac018转录调控单元在调控 植物根瘤固氮和/或调控产量中的应用。本发明所述gmnac039和gmnac018 能够调控植物根瘤衰老。5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：6.本发明提供了大豆gmnac039或gmnac018在调控植物根瘤固氮和/或调 控产量中的应用，所述调控植物根瘤固氮包括以下1)～5)方面的一种或几种：7.1)调控植物根瘤衰老；8.2)调控植物根瘤发育；9.3)调控植物根瘤数目；10.4)调控植物根瘤中固氮酶活性；11.5)调控植物根瘤固氮效率；12.所述gmnac039编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述 gmnac018编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。13.优选的，所述调控植物根瘤衰老包括通过负调控gmnac039或gmnac018 的表达来延缓植物根瘤衰老。14.优选的，所述调控植物根瘤发育包括通过正调控gmnac039或gmnac018 的表达来促进植物根瘤发育。15.优选的，所述调控植物根瘤数目包括通过正调控gmnac039或gmnac018 的表达来增加植物根瘤数目。16.优选的，所述调控产量包括通过负调控gmnac039或gmnac018的表达来 提高产量。17.优选的，所述调控植物根瘤中固氮酶活性包括通过负调控gmnac039或 gmnac018的表达来增强植物根瘤中固氮酶活性。18.优选的，所述调控植物根瘤固氮效率包括通过负调控gmnac039或 gmnac018的表达来提高植物根瘤固氮效率。19.本发明还提供了大豆gmnac039或gmnac018在高产植物分子育种中的应 用，所述gmnac039编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述 gmnac018编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。20.优选的，所述植物包括豆科植物。21.优选的，所述豆科植物包括大豆、苜蓿和百脉根中的一种或几种。22.有益效果：23.本发明提供了大豆gmnac039或gmnac018在调控植物根瘤固氮和/或调 控产量中的应用，所述调控植物根瘤固氮包括以下1)～5)方面的一种或几种： 1)调控植物根瘤衰老；2)调控植物根瘤发育；3)调控植物根瘤数目；4)调 控植物根瘤中固氮酶活性；5)调控植物根瘤固氮效率；所述gmnac039编码的 蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述gmnac018编码的蛋白的氨基酸 序列如seq id no.2所示。本发明所述gmnac039(glyma.06g157400)和gmnac018(glyma.04g208300)为同源基因，其在衰老的根瘤中上调表达，预 示该基因在根瘤衰老过程中的功能。本发明所述基因的应用国内外均未报道过。24.而且，本发明通过在大豆根瘤中超表达，与对照相比，超表达该基因的植 株根瘤固氮酶活性性明显降低且根瘤早衰，说明该基因调控了根瘤衰老过程； 运用crispr-cas9技术，通过大豆毛根转化方法敲除gmnac039和gmnac018 基因后，根瘤固氮酶活性显著高于对照组，根瘤延迟衰老，根瘤有效固氮时间 延长，在豆科作物上具有应用前景。附图说明25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例中所需要使用的附图作简单地介绍。26.图1为gmnac039和gmnac018蛋白序列比对图；27.图2为荧光定量pcr检测gmnac039和gmnac018的表达图，其中，a为lba 的表达水平，b为lbc1的表达水平，c为gmnac039的表达水平，d为gmnac018 的表达水平；28.图3为gmnac039超表达植株生长状况图，其中a为植株表型，b为对照根 瘤，c为gmnac039超表达根瘤；29.图4为gmnac018超表达植株生长状况图，其中a为植株表型，b为对照根瘤， c为gmnac018超表达根瘤；30.图5为gmnac039和gmnac018超表达植株根瘤石蜡切片图，其中，a为 gmnac039超表达根瘤，b为gmnac018超表达根瘤；31.图6为gmnac039和gmnac018 crispr敲除植株基因编辑情况；32.其中，图3、图4和图5中，control为转入空载体植株，nac039-oe和 nac018-oe为超表达植株；图6中control为转入空载体植株，crispr-nac 为敲除植株；33.*表示在control和超表达植株直接的差异性比较(t-检验)，其中，*表示 显著水平0.01＜p≤0.05时，差异显著；**表示显著水平0.001＜p≤0.01时，差 异显著性介于显著与极显著之间；***表示p≤0.001时，差异极显著。具体实施方式34.本发明提供了大豆gmnac039或gmnac018在调控植物根瘤固氮和/或调 控产量中的应用，所述调控植物根瘤固氮包括以下1)～5)方面的一种或几种： 1)调控植物根瘤衰老；2)调控植物根瘤发育；3)调控植物根瘤数目；4)调 控植物根瘤中固氮酶活性；5)调控植物根瘤固氮效率；35.所述gmnac039编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体为：36.mkgelelppgfrfhptdeelvnhylcrkcagqpiavpiikevdlykfdpw qlpeigyygekewyffsprdrkypngsrpnraagsgywkatgadkaigkpk algikkalvfyagkapkgvktnwimheyrlanvdrsaskknnnnlrlddw vlcriynkkgkiekynttapkmnlemihsfehenetkpeihklgneqllytet sdsvprlhtdssssehvvspdvrcerevqsdpkwnnddydlglqlenafdfq fnylddnnlsvdddpfgtvqyqmgqlsplqdmfmylqkm*；37.所述gmnac018编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，具体为：38.mkgelelppgfrfhptdeelvnhylcrkcagqpiavpvikevdlykfdp wqlpeigfygekewyffsprdrkypngsrpnraagsgywkatgadkpigkp kalgikkalvfyagkapkgvktnwimheyrlanvdrsaskkknnnlrldd wvlcriynkkgkiekyntgaakmnvemvhsfehenetkpeihklgneqlym etsdsvprlntdssssehvvspdvtcerevqsdpkwnddldlklenafdfqf nylddnnlsvddylfgtvqyqmgqlsplqdmfmylqkm*。39.在本发明中，所述gmnac039的核苷酸序列优选的如seq id no.29所示， 具体为：40.atgaagggagaattagagttgccaccagggttcagatttcaccccact gatgaagaattggtgaatcactacttgtgtaggaagtgcgcgggtcaacc aatcgcggttcccatcatcaaagaggtcgatttgtacaagtttgatccatg gcagcttccagaaattggctactacggcgagaaagaatggtacttcttttc tcctcgggatcggaaatacccgaacggttcacggccgaaccgtgccgccg gaagcggctattggaaagccaccggcgccgataaggcgatcggaaaaccg aaagcgctagggatcaagaaagctctggttttttacgccggaaaagcccc caaaggagtgaaaaccaattggatcatgcacgaatatcgcctcgccaatgt tgaccgatctgcctccaagaaaaacaacaacaacttgaggcttgatgatt gggtgttgtgtcgaatctacaacaagaaagggaagattgagaaatacaac acgaccgcaccgaagatgaatcttgaaatgattcatagttttgagcacgag aacgagacgaagcctgagattcataagcttggaaatgagcaattgttgta cacggagacttcagattcggtgccaaggttgcacacggactcgagcagct cggagcacgtggtttcgcccgatgtgaggtgcgagagggaagtgcagag cgaccccaagtggaataacgatgattatgatctgggcctacagctagaaaa cgcgtttgattttcagtttaattacttggacgataataacctttccgtcgac gatgacccctttggcactgttcagtaccaaatgggtcagctctcgcccttg caggacatgttcatgtacctacagaagatgtcas9技术敲除gmnac039或gmnac018后，能够达到提 高根瘤固氮酶活的效果。55.本发明运用crispr-cas9技术敲除gmnac039或gmnac018后，能够延 长根瘤的有效固氮时间，进而保证达到提高植物根瘤菌固氮效率。56.本发明还提供了大豆gmnac039或gmnac018在高产植物分子育种中的应 用，所述gmnac039编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述 gmnac018编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。57.在本发明中，所述植物包括豆科植物，更优选包括大豆、苜蓿和百脉根中 的一种或几种。58.本发明运用crispr-cas9技术，通过大豆毛根转化方法敲除gmnac039和 gmnac018，提高了豆科植物的根瘤酶活、延长了根瘤衰老时间和根瘤有效固氮 时间，提高植物的氮含量，进而增加植物的生物量和产量。59.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的大豆 gmnac039或gmnac018在调控植物根瘤固氮和/或调控产量中的应用进行详 细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。60.实施例161.gmnac039(glyma.06g157400)和gmnac018(glyma.04g208300)蛋白 序列对比，在大豆数据phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝org_gmax)中获得 gmnac039(glyma.06g157400)和gmnac018(glyma.04g208300)的蛋白质序 列，在线用clustal omega(https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/)进行序列比 对。比对后的序列在线用espript 3.0 (https://espript.ibcp.fr/espript/cgi-bin/espript.cgi)进行着色，结果如图1所示； 可见gmnac039和gmnac018为同源蛋白。62.实施例263.荧光定量pcr检测gmnac039和gmnac018在根瘤中的表达 在野生型植株williams 82(wm82)上接种(bradyrhizobium diazoefficiens)usda110 (usda-ars culture collection,nrrlb-4361)，每棵接种量为2ml，od600＝0.1， 分别收取接种根瘤菌(bradyrhizobium diazoefficiens)usda110(usda-ars culturecollection,nrrlb-4361)后4周(w)、8w、12w的根瘤，分别提取4w、8w、 12w的根瘤的rna，荧光定量pcr检测gmnac039和gmnac018的表达水平。64.rna提取方法为：用rna抽提试剂盒(aidlab,rn3302)提取大豆根瘤的 总rna。具体方法参照试剂盒操作手册。rna洗脱后，用nanodrop 2000 (thermo)检测rna的浓度和纯度，样品可于-70℃保存。65.反转录方法为：用反转录试剂盒(abcloanl,rk20403)进行反转录。具体 方法参照试剂盒操作手册。66.荧光定量pcr引物为：67.nac039:gmnac039-qrt-f/gmnac039-qrt-r；68.nac018:gmnac018-qrt-f/gmnac018-qrt-r；69.act11-qrt-f:atcttgactgagcgtggttattcc，seq id no.3；70.act11-qrt-r:gctggtcctggctgtctcc，seq id no.4；71.gmnac039-qrt-f:gagcgaccccaagtggaata，seq id no.5；72.gmnac039-qrt-r:ctgaacagtgccaaaggggt，seq id no.6；73.gmnac018-qrt-f:agcacgagaacgagacgaag，seq id no.7；74.gmnac018-qrt-r:aggtccagatcatcgttccac，seq id no.8；75.gmlba-qrt-f：gaaggcataattagtatctattg，seq id no.9；76.gmlba-qrt-r：tatcaggaacttgtctaatag，seq id no.10；77.gmlbc1-qrt-f:acaataaaggaagctgttggcgg，seq id no.11；78.gmlbc1-qrt-r:ttacactttacggcaatgcag，seq id no.12。79.荧光定量pcr体系为(10μl)：sybr select master mix(abi，2×)5μl、pcr forward primer(10μm)0.4μl、pcr reverse primer(10μm)0.4μl、cdna模板0.4μl和ddh2o 3.8μl；80.荧光定量pcr程序为：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15sec，60℃ 1min，40 个循环。81.以大豆看家基因act11为内参基因作为内参来标准化基因表达水平，定量方 法采用相对定量△△ct法，相对表达量为目的基因的表达量与内参基因表达量的比值， 结果详见图2。可知，在根瘤衰老过程中，豆血红蛋白基因lba、lbc1表达量逐 步降低，gmnac039和gmnac018被显著诱导表达。82.实施例383.gmnac039和gmnac018超表达对植株的影响。84.1、载体构建85.根据gmnac039和gmnac018全长cdna设计引物，以大豆根瘤cdna为模 板，分别用引物gmnac039-f/r和gmnac018-f/r分别扩增出nac039和 nac018片段；再分别以nac039和nac018片段为模板，用引物 gmnac039/018-xbai(gibson)-f/gmnac039/018-stui(gibson)-r进行第二轮 扩增，得到最终的gmnac039和gmnac018片段。86.扩增相应的基因。引物如下：87.gmnac039-f:acaaagagaggaagaaacgcga，seq id no.13；88.gmnac039-r:tcctatcatccatcattcggct，seq id no.14；89.gmnac018-f:aaaccacccagtgtgtcctc，seq id no.15；90.gmnac018-r:cttggcctagcccacatcac，seq id no.16；91.gmnac039/018-xbai(gibson)-f：tgatgtgattacagtctagaatgaag ggagaattagagttgc，seq id no.17；92.gmnac039/018-stui(gibson)-r：ggatccactagtaggcatcttctgt aggtacatgaac，seq id no.18；93.pcr扩增使用max super-fidelity dnapolymerase(vazyme)， pcr扩增体系为(20μl)：2×phantamax buffer 10μl、dntp(10mm earch) 0.5μl、f-primer(10μm)0.5μl、r-primer(10μm)0.5μl、phanta max super-fidelity dna polymerase 0.5μl、模板dna 1μl和ddh2o 7μl；pcr扩增程序为：[0094][0095]载体pub-gfpc-3xflag来源于(yu,h.,et al.,suppression of innate immunitymediated by the cdpk-rboh complex is required for rhizobial colonization inmedicago truncatula nodules.new phytol,2018.220(2):p.425-434.)，用限制性 内切酶pstꢀⅰ和xbaꢀⅰ(thermo，fd0684)酶切，用苜蓿的豆血红蛋白启动子 替换原来的ubiqitin启动子，最终得到超表达载体plb2-gfp-c’3xflag。该 载体用xbaꢀⅰ/stuꢀⅰ双酶切，再通过ginson反应分别与gmnac039和gmnac018 连接；将得到的两个重组载体，分别转化大豆发根农杆菌(agrobacterium.rhizogenes) k599(ncppb no.2659)，得到含有gmnac039的大豆发根农杆菌k599和含 有gmnac018的大豆发根农杆菌k599。[0096]载体酶切的限制性内切酶为xbaⅰ(thermo，fd0684)和stuⅰ(thermo， er0421)，酶切体系为50μl：载体2μg、xbaꢀⅰꢀ1.5μl、stuꢀⅰꢀ1.5μl、10×缓 冲液5μl和余量的ddh2o；[0097]载体分别与gmnac039和gmnac018连接，采用gibson反应方法(yeasen， 10911es20)，反应体系为5μl：2×hieffenzyme premix 2.5μl、基因 片段80～100ng、载体300ng和余量的ddh2o；[0098]gibsion反应条件为：50℃反应20min[0099]2大豆毛根转化[0100]fm液体培养基配方为：0.5mm mgso4·h2o、0.7mm kh2po4、0.8mmna2hpo4·2h2o、50μm fe-edta(用feso4和disodium edta配制)、0.1μgmnso4、0.1μg cuso4、0.1μg znso4、0.1μg h3bo3、0.1μg na2moo4，加ddh2o 调节至1l，调节ph至6.5，灭菌，常温保存5～6个月；fm培养基配方参照(toth, k.,j.batek,and g.stacey,generation of soybean(glycine max)transienttransgenic roots.currprotoc plant biol,2016.1(1):p.1-13.)，可以先配置母液， 再稀释使用，固体培养基加入1％(w/v)agar。[0101]hm液体培养基配方为：0.125g na2hpo4、0.25g na2so4、0.32g nh4cl、0.18g mgso4·7h2o、0.25g yeast extract、1g d-arabinose、1g sodium gluconate、0.004g fecl3、0.001g cacl2、1.30g hepes、和1.10g mes，加ddh2o调节至1l，用 naoh调节ph到6.6；[0102]hm固体培养基：在液体培养基的基础上加入1.5％(w/v)琼脂。[0103]lb培养基配方为：10g tryptone，5g yeast extract，10g nacl，加ddh2o 调节至1l，用naoh调节ph到7.2，固体培养基加入1.5％(w/v)琼脂。[0104]⑴植物材料：氯气消毒大豆种子过夜，无菌水冲洗6次，将种子泡在无菌 水中3h，使其吸胀，之后用灭菌的滤纸将大豆种子卷起来，放置于灭菌的塑料 烧杯中，向塑料烧杯中加入1/2体积的fm(fahraeus medium)液体培养基，最 后用塑料薄膜将烧杯封口。置于26℃暗培养2d后，再置于光照培养箱(16h光 照，8h黑暗)中26℃继续培养2d。[0105]⑵菌株：将对照载体plb2-gfp-c’3xflag和载体构建步骤中所得含有 gmnac039的大豆发根农杆菌k599和含有gmnac018的大豆发根农杆菌k599 分别于含质粒抗性(kanamycin，50μg/ml)的平板活化，活化后，挑取单菌落 于lb液体培养基，28～30℃振荡培养24h。吸取200μl菌液涂布在lb固体平 板，28～30℃培养箱培养，使其形成含有对照载体plb2-gfp-c’3xflag、 gmnac039的大豆发根农杆菌k599的菌膜和含有gmnac018的大豆发根农杆菌 k599的菌膜。[0106]⑶侵染与培养：刮取含有对照、gmnac039的大豆发根农杆菌k599的菌膜 和含有gmnac018的大豆发根农杆菌k599的菌膜，并将步骤(1)获得的大豆幼 苗在下胚轴白绿相间处斜切以切掉下胚轴，切除下胚轴的大豆再分别蘸取含有 对照、gmnac039的大豆发根农杆菌k599的菌和含有gmnac018的大豆发根农 杆菌k599的菌，置于fm固体培养基上共培养；共培养的步骤为：先在26℃培 养箱黑暗培养2天，用无菌水将幼苗上农杆菌冲洗干净，然后将幼苗置于新的 fm固体培养基上，在26℃光照培养箱(16h光照，8h黑暗)中继续培养6天 左右。[0107]⑷生根：将大豆幼苗取出，置于加入fm液体培养基的生根盒中，在光照 培养箱(16h光照，8h黑暗)中26℃培养8～10天。[0108]⑸阳性转基因根鉴定：在体视荧光显微镜下，通过gfp筛选标记，挑选 阳性幼苗，去除非阳性根。[0109]⑹根瘤菌接种：根瘤菌(bradyrhizobium diazoefficiens)usda110在hm (hepes-mes)固体平板上活化后，再挑取根瘤菌于hm液体培养基中，28℃ 震荡培养2-3天。7000r/min离心5min，收集菌体，用fm培养基重悬菌体，调 节浓度至od600≈0.02，接种于大豆幼苗根部，得毛根转化植株。4周后，观察表 型，结果如图3和图4所示：与对照相(空载体)比，gmnac039和gmnac018 超表达植株发黄，根瘤也发白或变绿，表现为提前衰老，说明gmnac039和 gmnac018超表达促进根瘤和植株衰老。[0110]实施例4[0111]gmnac039和gmnac018超表达对固氮酶活性和根瘤数目的影响[0112]1大豆根瘤固氮酶活性性测定[0113]实施例3得到的毛根转化植株接种大豆根瘤菌usda110 4w后，将大豆地 下部分放入40ml玻璃瓶中，先用注射器从玻璃瓶中抽出3ml的空气，再用注 射器往玻璃瓶中注入2ml的乙炔气体。将玻璃瓶置于装有水的塑料盒中，28℃ 反应2小时后取出，用气相色谱仪检测。[0114]2乙烯标准曲线制作[0115]用微量进样器往玻璃瓶中注入一定体积的乙烯标准气体，每个浓度设置3 个重复，用气相色谱仪检测乙烯峰。在excel表格上绘制乙烯体积与乙烯峰面积 的标准曲线。[0116]3固氮酶活性的计算[0117]根瘤固氮酶活性性即为乙炔还原活性(acetylene reduction activity, ara)，可表示为单位重量的根瘤在单位时间内还原乙炔的摩尔数，计算公 式为：乙炔还原活性＝乙烯的摩尔数/鲜根瘤重×反应时间(酶活的单位通常是： μmol/g.h)。[0118]根据气体的摩尔数与体积、温度，压力的关系，摩尔数可由乙烯体积求得：[0119]c2h4(μmol)＝c2h4体积(μl)×1/22.4×273/(273+t℃)×p/760，式中：t℃：the cdpk-rboh complex is required for rhizobialcolonization in medicago truncatula nodules.new phytol,2018.220(2):p. 425-434.)。[0134]引物具体如下：[0135]f1：cgattcccggctggtgcatttgatccatggcagcttccgttttaga gctagaaatag，seq id no.23；[0136]r1：ccggaagcggctattggaaatgcaccagccgggaatc，seq id no.24；[0137]f2：tttccaatagccgcttccgggttttagagctagaaatag，seq id no.25；[0138]r2：attggatcatgcacgaatattgcaccagccgggaatc，seq id no.26；[0139]f3：atattcgtgcatgatccaatgttttagagctagaaatag，seq id no.27；[0140]r3：ctatttctagctctaaaacatcatcaagctgtgcaccattgcacc agccgg gaatcg，seq id no.28。[0141]2大豆毛根转化同实施例3[0142]3大豆根瘤固氮酶活性测定同实施例3。[0143]4乙烯标准曲线制作同实施例3。[0144]5固氮酶活性的计算同实施例3。[0145]分别统计每棵植株的根瘤数目，并称量根瘤的鲜重。结果如表3所示：与 对照相比，gmnac039和gmnac018 crispr敲除植株固氮酶活性提高，根瘤数 目增加，说明gmnac039和gmnac018 crispr敲除延缓根瘤衰老。[0146]表3[0147][0148]6、基因组抽提[0149]将实施例3中2大豆毛根转化中步骤6根瘤菌接种中获得的毛根转化植株接 种6w后，收取根瘤于1.5ml离心管。将离心管于液氮冷冻后，用研磨棒研磨， 重复数次，直至植物组织成粉末状，之后加入300μl抽提缓冲液(即基因组提取 缓冲液，ctab 4g、nacl 16.364g、1m tris-hcl 20ml(ph8.0)和0.5m edta8ml，先用70ml ddh2o溶解，再定容至200ml灭菌)，充分颠倒混匀，于 65℃水浴锅内孵育30min，每隔5min颠倒混匀1次，然后加入200μl苯酚、氯仿 和异戊醇的混合液(苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25:24:1)，充分颠倒混匀， 室温静置2min，12000r/min离心10min。[0150]吸取上清液250μl，加入等体积异丙醇和10wt.％3m naac，充分混匀，-20℃ 沉淀30min后，12000r/min离心10min，弃上清，加入1ml预冷的体积百分含量为 75％的乙醇，12000r/min离心5min，弃上清；用烘干机烘干沉淀，加入约40μl 的ddh2o溶解，即得到植物的基因组dna。[0151]7、基因编辑检测[0152]对上述得到的植物的基因组dna，进行pcr检测。[0153]pcr引物如下：[0154]gmnac039-f：acaaagagaggaagaaacgcga，seq id no.13；[0155]gmnac039-r：tcctatcatccatcattcggct，seq id no.14；[0156]gmnac018-f：aaaccacccagtgtgtcctc，seq id no.15；[0157]gmnac018-r：cttggcctagcccacatcac，seq id no.16。[0158]pcr程序和反应体现同实施例3。[0159]pcr检测基因编辑结果显示，gmnac039和gmnac018都发生了大片段缺失。[0160]综上所述，nac转录因子gmnac039和gmnac018在调控大豆根瘤衰老中 具有重要的功能。gmnac039和gmnac018在衰老根瘤中诱导表达，gmnac039 和gmnac018超表达使固氮酶活性性显著降低，根瘤数目显著增加，gmnac039 和gmnac018被敲除后，固氮酶活性性显著增加，根瘤数目也显著增加，表明 gmnac039和gmnac018在应用于提高大豆固氮效率以及产量方面有重要的意 义。[0161]尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实 施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得 其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!