一种meso-氯甲基卤代氟硼二吡咯光敏剂及其应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于光动力治疗、光致产酸剂技术领域，具体涉及一种meso-氯甲基卤代氟硼二吡咯光敏剂，以及该具有光动力特征的光敏剂在光致产酸剂上、光动力治疗上的应用。背景技术：2.目前应用癌症治疗的光动力疗法存在缺氧限制，在细胞低氧环境产生活性氧的效率低。为了解决缺氧限制问题，尚已开发氧气载体将氧气直接运输到肿瘤区域，原位产生o2/自由基的两种策略。然而这些策略局限于增氧产生活性氧，直接解决缺氧限制的问题，忽略了癌细胞内碱外酸的基本特征。生物体的病理性变化会导致酸碱失衡，如癌细胞的ph失调已成为了显著的标志，同样调控酸碱平衡，也会给疾病治疗带来转机。癌细胞呈现内碱外酸，在碱性ph条件下繁殖速度快，降低ph可以使得癌细胞选择性受损。目前调节微环境ph的方法主要包括间接使用离子蛋白抑制剂和直接利用小分子碱性药物，采用药物治疗容易出现耐药性等问题。因此，将光动力疗法和调节细胞微环境等多种癌症治疗方法协同，是实现精确精准医疗的必然趋势。3.使用光致产酸剂调节微环境的酸碱平衡，是一种直接产生氢质子降低ph的策略。光致产酸剂(pag)是一种化合物，能为环境提供所需的质子。它在光照下发生反应或解离，通过自由基等途径进行光解，通常需要从周围的化合物或溶剂中提取质子，并释放或lewis酸。光致产酸剂当作光引发剂，在光刻胶、电子封装材料、胶粘剂、油墨、涂料、3d打印有广泛的应用。目前已有多种商业化应用的光致产酸剂，比如二芳基碘鎓盐、三芳基硫鎓盐、芳茂铁盐、三氯甲基三嗪类。商业化应用的光致产酸剂多集中于工业领域，目前关于生物体内应用的光致产酸剂的研究很少。工业应用的光致产酸剂集中紫外波段，而紫外光对人皮肤、眼睛、免疫系统有伤害，所以开发可见光乃至近红外光区的光致产酸剂很有意义。4.meso-甲基bodipy结构光笼(bodipy-lg)作为一类具有光剪切功能的光响应分子已在下述文献中有所报道j.am.chem.soc.2017，139，15168-15175。光笼在特定波长光辐照断键后形成碳正离子和对应的阴离子对，在亲核试剂(nuh)进攻后，生成对应光产物(光笼-nu，h-lg)。光笼在特定波长光辐照断键，被亲核试剂进攻后释放被保护基团(lg)的特性，已被应用于生物体中酶、前药等转运物质的光控释放。光笼相关光控释放的研究多局限于转运药物、酶等，对光产物h-lg的研究很少，目前光致产酸剂多应用于紫外光区的光固化领域，光笼与光致产酸剂结合的研究尚缺乏实验探索。技术实现要素：5.针对现有光动力治疗存在的缺氧限制的问题，本发明人提供了一种卤代氯甲基氟硼二吡咯光敏剂(光致产酸剂)的结构。这类结构的光致产酸剂在与吸收波长匹配的光源照射下，烯丙基氯发生断裂，夺取乙腈、甲醇、水等溶剂的h，产生氢离子。不仅有高单线态氧产率，还具备较高的光酸量子产率。该类光敏剂可应用于缓解光动力治疗光敏剂缺氧限制的问题，同时具备细胞荧光成像的能力。6.本发明的技术方案如下：7.一种基于meso-氯甲基卤代氟硼二吡咯光敏剂，所述光敏剂具有如下通式i的分子结构：[0008][0009]其中：[0010]r1、r2分别独立地选自氢、氰基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氨基、烷氰基、芳基、芳烷基、噻吩基、环烷基中的一种；[0011]x为卤素中的一种，更优选地，x选自br、cl或i；[0012]r选自氯甲基，三氯甲基，苄氯基中的一种。[0013]对于上文所述的技术方案，更优选地，所述的r1、r2分别独立地选自烷基、芳烷基、噻吩基、环烷基中的一种。[0014]对于上文所述的技术方案，更优选地，所述的氯甲基在苯环的领位、间位或对位。[0015]本发明的另一方面，在于公开了一种基于meso-氯甲基卤代氟硼二吡咯光敏剂的制备方法，包括以下步骤：[0016]步骤(1)：在氮气保护下，吡咯衍生物和酰氯于无水二氯中反应，待反应颜色变成深红色，冷却到室温，加入三乙胺搅拌，待颜色褪去，加入三氟化硼乙醚，制得中间体a；具体反应式如下：[0017][0018]步骤(2)：将得到的中间体a溶于无水二氯和甲醇的混合溶液，在氮气的气氛下，加入卤化试剂，避光室温反应，得到meso-氯甲基卤代氟硼二吡咯b。[0019][0020]对于上文所述的技术方案，更优选地，酰氯选自氯乙酰氯、三氯乙酰氯、4-(氯甲基)苯甲酰氯，3-(氯甲基)苯甲酰氯，2-(氯甲基)苯甲酰氯中的一种。[0021]对于上文所述的技术方案，更优选地，所述的卤化试剂选自nis、ncs、nbs中的一种；[0022]对于上文所述的技术方案，更优选地，吡咯衍生物与酰氯的摩尔比为2:1.05，吡咯衍生物和三乙胺的摩尔比为1:2～4，吡咯衍生物和三氟化硼乙醚的摩尔比为1：2～4。[0023]对于上文所述的技术方案，更优选地，所得meso-氯甲基氟硼二吡咯a(中间体a)和卤化试剂的摩尔比为1：2.05。[0024]对于上文所述的技术方案，更优选地，二甲基吡咯与酰氯反应2～5h，三乙胺搅拌15min～30min，加入三氟化硼乙醚后再反应3～12h。[0025]对于上文所述的技术方案，更优选地，步骤(2)反应结束后，还包括洗涤、萃取、干燥、过滤、旋干、纯化的步骤；其中，萃取采用二氯甲烷，干燥用无水硫酸钠，纯化采用硅胶柱。[0026]对于上文所述的技术方案，更优选地，硅胶柱采用的洗脱液为二氯甲烷与石油醚按照体积比4～20:1。[0027]对于上文所述的技术方案，更优选地，反应溶剂采用无水二氯与甲醇按照1：1的体积比混合，反应时间10min～2h。[0028]本发明的另一方面在于公开上文所述光敏剂(meso-氯甲基卤代氟硼二吡咯)的应用，具体包括，利用此光敏剂具备的光致产酸的特性，调节细胞微环境酸碱平衡中以缓解光动力缺氧限制的应用；以及作为光敏剂在癌症组织的细胞成像和光动力治疗中的应用。对于上文所述的技术方案，更优选地，所述的光致产酸剂(meso-氯甲基卤代氟硼二吡咯)通过光源照射的方式进行氢离子释放的应用。[0029]对于上文所述的技术方案，更优选地，所述的产酸的光照强度和光照时间在生物活体可接受的光照强度内，更优选地，光照强度为4～20mw/cm2，光照时间为3～30min。[0030]对于上文所述的技术方案，更优选地，所述的meso-氯甲基卤代氟硼二吡咯结构的化合物具备光动力特性，在中性或酸性条件下稳定地产生单态氧，暗毒性小光毒性强，可成为光动力治疗的潜在药物。[0031]有益效果[0032](1)本发明所制备基于meso-氯甲基卤代氟硼二吡咯光敏剂，合成方法简单，条件温和，具有大批量生产的商业应用前景。[0033](2)本发明基于meso-氯甲基卤代氟硼二吡咯光敏剂，具有光致产酸特性和光动力效果，在调控细胞微环境，增强光动力治疗效果有应用前景。[0034](3)本发明基于meso-氯甲基卤代氟硼二吡咯光敏剂，光酸量子产率较高，是可见光波段的光致产酸剂。附图说明[0035]图1为光敏剂b-i-cl、b-i-oh的核磁氢谱图，其中：图a为实施例1光敏剂b-i-cl的核磁氢谱图，图b对比例1b-i-oh的核磁氢谱图。[0036]图2为光敏剂b-i-cl、b-i-oh的质谱图。其中：图a为实施例1光致产酸剂b-i-cl的质谱图，图b对比例1b-i-oh的质谱图。[0037]图3为实施光敏剂b-i-cl在(550nm，10mw/cm2)绿光照射下光降解紫外光谱。[0038]图4为不同时间的光敏剂b-i-cl(10μm，乙腈)和四溴酚兰(550nm，10mw/cm2)光照射的紫外光谱图。[0039]图5为550nm单色光照射光敏剂b-i-cl，单线态氧探针dpbf的紫外吸收光谱。[0040]图6为实施例1b-i-cl和对比例b-i-oh的光毒性和暗毒性的数据对比图。[0041]图7为实施例1b-i-cl在mcf-7细胞中的单光共聚焦的细胞摄取图、和商业线粒体、溶酶体定位染料的共定位分析图(上排为线粒体定位，下排为溶酶体定位)。[0042]图8为细胞内ph荧光探针(bcecf am)监测光照前后摄取b-i-cl的mcf-7细胞内ph变化的单光子共聚焦照片(上排为光照前，下排为光照后)。具体实施方式[0043]下面结合实施例对本发明作进一步说明，但应当理解本发明的保护范围并不受实施例的限制。[0044]本发明中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。[0045]以下通过实施例(但不限于此实施例)来说明本发明光致产酸剂的合成。[0046]根据本发明，术语“光致产酸剂”和“光敏剂”是可互换的，代指卤代氯甲基氟硼二吡咯结构的化合物。[0047]实施例1光致产酸剂b-i-cl的合成[0048]准确称取2，4-二甲基吡咯(200mg)溶于20ml无水二氯，在氮气的气氛下，慢慢滴入氯乙酰氯0.15ml，反应液由无色变成血红色，室温搅拌下反应3小时。在冰水浴条件下，慢慢加入三乙胺8ml，加完之后继续搅拌15min，再慢慢滴加三氟化硼乙醚8ml，室温下反应3h。反应结束后，反应混合物用h2o(3×100ml)洗涤，并将溶液用二氯甲烷萃取，合并后的二氯甲烷用无水硫酸钠干燥并过滤，用旋转蒸发仪旋干，得到粗制的产品。粗制的产品通过硅胶柱纯化(二氯甲烷：石油醚＝1:1)，得到中间产物化合物8-氯甲基-4，4'-二氟-1，3，5，7-四甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂吲哚，为亮红色固体(35％)。中间产物与溶于无水二氯：甲醇＝1：1，在氮气的气氛下，加入n-碘代丁二酰亚胺，避光室温反应20min。反应结束后，反应混合物用硫代硫酸钠(3×100ml)洗涤，并将溶液用二氯甲烷萃取，合并后的二氯甲烷用无水硫酸钠干燥并过滤，用旋转蒸发仪旋干，得到粗制的产品，粗制的产品通过硅胶柱纯化(二氯甲烷：石油醚＝4:1)，得到最终产物4，4'-二氟-2，6-二碘-8-氯甲基-1，3，5，7-四甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂吲哚(b-i-cl，为紫色结晶，80％)。[0049]测试例1b-i-cl核磁、质谱测试[0050]测试方法：将b-i-cl固体粉末取3mg溶于0.5ml氘代氯仿于核磁管内，将核磁管放于核磁共振波谱仪bruker avance ii 400测试，表征结果见图1a、图2a，已经标出各峰的归属。取少许固体粉末溶于二氯甲烷，测高分辨质谱(hrms-maldi)[0051]1h nmr(400mhz，cdcl3):δ(ppm)4.63(s，2h，ch2)，2.60(s，6h，2ch3)，2.49(s，6h，2ch3).[0052]hrms-maldi-m/z:[m]-calcd for c14h14bclf2i2n2 547.8996，found 547.9009.[0053]测试例2不同照射时间的光致产酸剂的变化光谱[0054]测试方法：将b-i-cl溶解于dmso配置成5mm的dmso母液，取6μl母液稀释于3ml乙腈(浓度为10-5mol·l-1后加入到干净的石英皿内，设置扫描波长范围：200～800nm，在550nm氙灯以10mw/cm2照射石英皿，依次测试光照时间为0s，10s，20s，30s，5min的样品，即可得到一系列不同的吸光度曲线。[0055]如图3所示，b-i-cl的光谱随着光照时间的变化，在30s发生快速的光谱变化，最大吸收波长蓝移了10nm，波形从双峰变成了单峰，且摩尔吸光系数有轻微的下降，30s后紫外吸收光谱维持不变，说明b-i-cl对光很敏感。[0056]测试例3光酸量子产率测试[0057]测试方法：以四溴酚蓝作为氢离子探针，按照一定的浓度溶解于乙腈溶剂，然后加入浓度经过标定的三氟乙酸溶液，通过紫外—可见光分光光度计测定四溴酚蓝特征峰吸光度的变化，绘制以酸浓度为横坐标、以吸光度的变化为纵坐标的酸浓度的一元函数图，即标准工作曲线。将b-i-cl溶解于dmso配置成5mm的dmso母液，取6μl母液稀释于3ml乙腈(浓度为10-5mol·l-1)与四溴酚蓝溶于有机溶剂后加入到干净的石英皿内，设置扫描波长范围：200～800nm，在550nm 10mw/cm2下照射石英皿，用紫外-可见光分光光度计跟踪混合液在不同光照条件下四溴酚蓝的吸光度变化δabs(图4b)。以四溴酚蓝在不同氢质子浓度和吸光度的标准工作曲线(图4a)为参比，根据δabs即可得到对应的酸的浓度，通过公式(1)计算可以得到在溶液中的光酸量子产率φh+＝0.64，产酸能力远远强于meso修饰三芳基硫盐(doi.org/10.1021/acs.orglett.0c00118)。[0058]计算公式测试例4光致产酸剂产生活性氧的性能[0059]通过单重态氧的量子产率来检测光致产酸剂的光动力活性。以亚甲基兰为标准物(二氯甲烷中的φδ＝0.57)，在二氯甲烷溶剂中，将单线态氧捕获试剂1，3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)的吸光度调到1.0左右，然后，将光致产酸剂添加到比色皿中，并将吸光度调整为0.2-0.3。用550nm的单色光照射比色皿10秒钟，每次光照后多次测量吸光度。如图5a所示，单线态氧捕获试剂1，3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)对单线态氧的检测很灵敏。图5b可知，dpbf在415nm的吸光度变化值和时间呈现线性关系,计算了在415n处dpbf的吸光度与时间的函数图，算出φδ＝0.79。[0060]计算公式[0061]其中abs是吸光度[0062]k是dpbf在415nm吸光度变化值和时间的斜率[0063]测试例5光致产酸剂b-i-cl的线粒体和溶酶体共定位成像[0064]取100μl的mcf-7细胞2ml培养基的共聚焦皿中在37℃、5％co2环境下培养24h后，加入光致产酸剂b-i-cl孵育1h，用pbs清洗2遍，加入1μl线粒体和溶酶体商业定位染料(mito-tracker green，λex＝488nm，λem＝500～550nm；lyso tracker green，λex＝488nm，λem＝500～550nm)孵育30min后，用pbs清洗2遍，加入新鲜的培养基。共聚焦进行成像观察，并且记录荧光通道图像，并进行叠加光致产酸剂检测的定位，由图7可见，绿色通道采集到mito-tracker green染料信号(或lyso tracker green)与红色通道b-i-cl的荧光信号有很好的叠加,溶酶体共定位系数为0.71，线粒体共定位系数为0.71，说明b-i-cl大部分能进环境下培养24h后，加入光敏剂b-i-cl孵育1h，用pbs清洗2遍，加入10mm bcecf am母液1μl(λex＝488nm，λem＝500～530nm)孵育30min后，用pbs清洗2遍，加入新鲜的培养基，然后进行光照(550nm，10mw/cm2，10min)。共聚焦进行成像观察，并且记录光照前后的荧光通道图像。如图8所示，光照后的mcf-7细胞中bcecf am荧光强度明显弱于光照前，说明b-i-cl能降低细胞内部的ph值。[0070]以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。









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