一种检测IL-6的实时荧光定量PCR检测方法

有机化合物处理,合成应用技术一种检测il-6的实时荧光定量pcr检测方法技术领域1.本发明涉及生物检测技术领域，具体的说，涉及一种用于il-6的实时荧光定量pcr检测方法。背景技术：2.白细胞介素-6(interleukin-6,il-6)是细胞因子家族中的重要成员，属于白细胞介素的一种，由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、b/t淋巴细胞、肝细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、树突状细胞和成纤维细胞等多种免疫和基质细胞产生。il-6可作用于多种细胞，在免疫调节、炎症、造血、调节代谢和急性期反应等一系列过程中发挥重要功能。研究表明，il-6可通过多种免疫刺激机制调节宿主防御，包括诱导单核细胞向巨噬细胞的分化，调节抗原依赖的b细胞增殖和分化，增加b细胞产生igg型抗体，并通过抑制th1极化从而促进th2应答。在肝脏器官，il-6可介导肝脏的急性期反应，诱导肝细胞合成c反应蛋白和纤维蛋白原。此外，作为诱发“炎症风暴”(细胞因子风暴)的重要通路，il-6在炎症免疫反应中处于中心地位，具体表现为在术后、病原体例如新型冠状病毒感染、免疫异常疾病及某些肿瘤性疾病中，il-6的表达早于其他细胞因子明显升高，持续时间较长，是急性感染早期诊断和预后判断的灵敏指标，通过对il-6水平的动态观察，还可实时了解疾病进展并指导治疗。3.目前，对il-6的检测主要通过免疫学反应在蛋白质水平上或借助pcr技术在基因转录水平上对il-6进行定量。前者是临床常用的检测方法，该方法简单快速，对检测设备或平台要求不高，但存在灵敏度、准确度低等问题，可能导致“假阳/阴性”情况的发生。技术实现要素：4.本发明的目的在于提供一组用于检测il-6的特异性引物对和探针，还在于提供一种免核酸提取实时荧光定量pcr检测方法。5.本发明提供一种成套试剂，由名称为il-6的引物对和名称为il-6-p的探针组成，所述il-6由名称分别为il-6-f和il-6-r的单链dna组成；6.所述il-6-f为如下(a1)或(a2)：7.(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；8.(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；9.所述il-6-r为如下(a3)或(a4)：10.(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；11.(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；12.所述il-6-p的核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：13.(a5)序列表的序列3；14.(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的序列。15.其中，所述il-6-p的两端分别带有荧光报告基团和荧光淬灭基团。所述il-p的5'末端具有荧光报告基团fam，3'末端具有荧光淬灭基团bhq-1。16.上述il-6也应在本发明的保护范围之内。17.所述成套试剂或权利要求1中所述il-6的应用，为如下(b1)或(b2)：18.(b1)检测待测样本中是否含有il-6；19.(b2)制备用于检测待测样本中是否含有il-6的试剂盒。20.上述成套试剂中，所述il-6-f、所述il-6-r、所述il-6-p均可独立包装。所述il-6-f、所述il-6-r、所述il-6-p的摩尔比可为1:1:1。21.本发明还要求保护一种试剂盒，包括所述成套试剂或所述il-6；所述试剂盒的功能为检测待测样本中是否含有il-6。22.本发明还提供一种检测待测样本是否含有il-6的方法，包括：以待测样本为模板，采用所述成套试剂进行实时荧光pcr并检测荧光信号，如果显示阳性扩增曲线、待测样本含有或疑似含有il-6，如果不显示阳性扩增曲线、待测菌不含有或疑似不含有il-6。23.其中，所述实时荧光pcr的反应体系为:每25体积份数的反应液中包括：15体积分数的rt-pcr reaction mix；1体积分数的enzyme mix；1体积分数的il-6-f；1体积分数的il-6-r；1体积分数的il-6-p；2-2.5体积分数的待测样品；其余为dnase&rnase-free h2o。24.其中，所述rt-pcr reaction mix和enzyme mix来自卡尤迪生物科技(北京)有限公司的通用型免核酸提取qrt-pcr试剂盒。25.上述待测样本为咽拭子、血液或者血浆。26.相较于免疫学检测，本发明的基于pcr技术的检测方法具有灵敏度高、特异度高、准确度高的特点，在早期检测中发挥更大效能。附图说明27.图1为实施例2中显示采用本发明提供的il-6引物和探针进行il-6的实时荧光定量pcr检测结果。28.图2为实施例2中显示采用发表文献提供的il-6引物和探针进行il-6的实时荧光定量pcr检测结果。29.图3实施例3中显示采用本发明提供的il-6引物和探针进行il-6的实时荧光定量pcr检测方法敏感性测试结果。30.图4为实施例4中显示il-6实时荧光定量pcr方法在全血生物样品中的检测结果。31.图5为实施例5中显示il-6实时荧光定量pcr方法在咽拭子生物样品中的检测结果。具体实施方式32.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。33.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。34.实施例1：引物及实验方法的设计35.本发明根据已发表的il-6基因序列，设计特异性引物对和探针。选定的引物对il-6和探针il-6-p，所述il-6由名称分别为il-6-f和il-6-r的单链dna组成；所述il-6-f为序列表的序列1所示的单链dna分子；所述il-6-r为序列表的序列2所示的单链dna分子；所述il-6-p的核苷酸序列为序列表的序列3，所述il-6-p的两端分别带有荧光报告基团fam和荧光淬灭基团bhq-1。36.检测待测样品中是否含有il-6时，37.(1)用本发明提供的特异性引物对il-6和探针il-6-p，进行实时荧光定量pcr扩增，其中，反应体系按如下配制：38.15μl rt-pcr reaction mix和1μl enzyme mix(卡尤迪生物科技(北京)有限公司，通用型免核酸提取qrt-pcr试剂盒)；1μl上游引物：序列表中序列1所示的碱基序列；1μl下游引物：序列表中序列2所示的碱基序列；1μl探针：序列表中序列3所示的碱基序列；根据不同生物样本类型加入不同用量的样品模板(见表1)；并用dnase&rnase-free h2o补齐25μl反应体积。39.表1样本模板的建议用量[0040][0041](2)反应条件：具体反应条件如表2[0042]表2反应条件[0043][0044](3)结果判定：若ct值≤35，并出现明显扩增曲线，则判定为阳性；若无ct值或ct值＞35，且未出现明显扩增曲线，则判定为阴性。[0045]实施例2：待测样本为全血样本时，本发明提供的特异性引物对和探针与文献中提供的il-6特异性引物对和探针的比较[0046]1.全血样本模板的制备：将2μl抗凝血样本+18μl样本稀释液，取2.5μl作为模板进行下一步实验。[0047]2.按照步骤1中的方法制备10份新型冠状病毒肺炎确诊患者全血样本模板，采用本发明提供的引物il-6和探针il-6-p按照实施例1中所述的方法进行免核酸提取实时荧光定量pcr检测。其中，反应体系按如下配制：15μl rt-pcr reaction mix；1μl enzyme mix；1μl上游引物：序列表中序列1所示的碱基序列；1μl下游引物：序列表中序列2所示的碱基序列；1μl探针：序列表中序列3所示的碱基序列；2.5μl稀释制备好的全血样本模板；3.5μl dnase&rnase-free h2o补齐25μl反应体积。反应条件为表2所述。结果如图1所示。[0048]3.将步骤2中的il-6引物和探针替换为文献(expression of t helper 17and regulatory t cell cytokines and molecules in glomerulonephritis class iv systemic lupus erythematosus.iran j kidney dis.2016；10(3):113-8.)中提供的il-6引物和探针分别进行il-6的免核酸提取实时荧光定量pcr检测，其他步骤均不变。其中，文献中的il-6引物为：上游引物为cttcggtccagttgccttctc；下游引物为attcgttctgaagaggtgagtgg；探针为5′‑fam ctgctcctggtgttgcctgctgcctamra-3′。结果如图2所示。[0049]从图1和图2可以看出，本发明提供的il-6实时荧光定量pcr方法检测10份全血样本，结果均为阳性，阳性检出率为100％，发表文献(expression of t helper 17and regulatory t cell cytokines and molecules in glomerulonephritis class iv systemic lupus erythematosus.iran j kidney dis.2016；10(3):113-8.)中il-6免核酸提取实时荧光定量pcr方法检测结果显示5份阳性，阳性检出率为50％。[0050]实施例3：方法敏感性测试[0051]1、检测材料的制备[0052]采用实施例2提供的il-6检测方法检出的il-6阳性rna样本，将阳性扩增产物(如序列表中序列4)克隆至puc57载体(武汉淼灵生物科技有限公司)的多克隆位点，构建重组质粒，并保持载体其他部分序列不变，将序列正确的重组质粒命名为puc57-il-6。[0053]2、il-6实时荧光定量pcr方法灵敏度检测[0054]将步骤1中制备的重组质粒命名为puc57-il-6，用分光光度计测定质粒核酸浓度后对其进行倍比稀释，设置5个梯度(1×106copies/ul-1×102copies/ul)，即稀释后的5组待检测重组质粒命名为puc57-il-6溶液的浓度分别为1×106copies/ul、1×105copies/ul、1×104copies/ul、1×103copies/ul和1×102copies/ul，并以本发明提供的特异性引物(如序列表中序列1和序列2)和和探针(如序列表中序列3)对il-6进行pcr扩增。检测pcr扩增最低检测浓度，以验证方法的灵敏度。结果如图3所示。[0055]如图3所示，显示pcr扩增最低检测浓度为1×102copies/ul，说明该方法具有高灵敏性(如图3所示，图3中的1-5分别对应的浓度分别为1×106copies/ul、1×105copies/ul、1×104copies/ul、1×103copies/ul和1×102copies/ul的溶液的检测结果曲线)。[0056]实施例4：il-6实时荧光定量pcr方法在新型冠状病毒肺炎确诊患者全血生物样品中的应用[0057]分别新型冠状病毒肺炎确诊患者全血30份，按照实施例2中的方法制备全血样本，得到30份全血样本。分别将30份按照实施例1中的方法利用本发明设计的il-6的免核酸提取实时荧光定量pcr检测方法进行il-6的检测。反应体系与反应条件均与实施例2中的步骤2相同，结果如图4所示。[0058]从图4中可以看出，30份全血样本均为il-6阳性。[0059]实施例5：il-6免核酸提取实时荧光定量pcr方法在新型冠状病毒肺炎确诊患者咽拭子生物样品中的应用[0060]分别使用新型冠状病毒肺炎确诊患者咽拭子20份，利用本发明提供的il-6的免核酸提取实时荧光定量pcr检测方法进行il-6的检测。反应体系与反应条件均与实施例2中的步骤2相同，结果如图5所示。[0061]从图5中可以看出，20份咽拭子样本中il-6均阳性。[0062]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。









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