使用液相色谱检验顺铂原料中多种物质的方法与流程

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及一种采用液相色谱仪检验物质的技术。背景技术：色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。2.色谱分离基本原理：在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。3.色谱法就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。4.使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。5.由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。6.色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可分为气相色谱法（gc）和液相色谱法（lc）。固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体。7.顺铂(cisplatin，cddp)是中心以二价铂同两个氯原子和两个氨分子结合的重金属络合物。它是一种含铂的抗癌药物，首先于 1978 年在美国批准临床使用，并迅速成为治疗癌症的佼佼者。顺铂为细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性，可抑制癌细胞的 dna 复制过程，并损伤其细胞膜结构，有较强的广谱抗癌作用。临床上对卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能显示出疗效。8.现有ep8.0（欧洲药典8.0版）中顺铂的色谱条件如下：色谱柱：辛烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱（4μm，4.0*250mm）；流动相：0.108%辛烷磺酸钠溶液（取辛烷磺酸钠1.08g、四丁基硫酸氢铵1.70g和磷酸二氢钾2.72g，溶解于水中，并用水稀释至950ml，用1mol/l氢氧化钠调节溶液ph至5.9，再稀释至1000ml）。9.流速：1.0ml/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：20μl；供试品溶液：顺铂（1mg/ml）；对照品溶液：顺铂（0.002mg/ml）、反铂（0.02mg/ml）、三氯氨铂（0.01mg/ml），按外标法计算。10.系统适用性：反铂与三氯氨铂峰之间分离度不小于2.5，反铂峰与氯化钠峰可以很好分离。顺铂峰保留时间约为3.8分钟，相对保留时间氯化钠峰约为0.5，反铂约为0.6，三氯氨铂约为0.7。11.该方法具有一定局限，要求：反铂≤2.0%；三氯氨铂≤1.0%；其他单个杂质≤0.1%；其他杂质的和≤0.5%三种物质的结构式：顺铂：；反铂：；氯氨铂：。12.进口注册标准jx20090030中，反铂与三氯氨铂的测试采用了两套与上述不同液相系统，其供试品及对照品配制均不同，操作繁琐。技术实现要素：13.发明目的：克服了上述ep8.0中色谱技术繁琐、难以同时检测多种结构近似物质的不足，提供了一种新的顺铂分析方法，使得分析方法简单，易于操作，可在同一套液相系统中有效检测顺铂、三氯氨铂及反铂。技术方案：本发明的使用液相色谱检验顺铂原料中物质的方法，在ep8.0中规定的色谱条件中：（1）改进流动相成分及配比：流动相：取辛烷磺酸钠、四丁基硫酸氢铵、磷酸二氢钾和甲醇（在流动相中添加9-11%的甲醇）；甲醇为有机相保护色谱柱（原流动相中3种试剂会引起色谱柱柱压升高，峰型变差，加剧峰拖尾，加入甲醇能够延缓对色谱柱的这些不利影响）。14.不使用甲醇以外有机溶剂的理由：甲醇为保养色谱柱试剂，在实验完成之后可直接使用其冲洗色谱柱，避免切换其它试剂；本实验中的有机试剂需要色谱纯（否则会有杂峰干扰），其余有机溶剂的纯度不够。15.（2）通过添加弱酸（优选稀硫酸，与流动相中四丁基硫酸氢铵具有相同的离子团，成分不太复杂，同时酸性较强，又能快速调节ph值）修改流动相的ph值为3.6-3.8左右，在该ph值为3.7时，顺铂最稳定。16.（3）修改流速为0.8ml/min左右，0.8ml/min这个速度能够更好地分离反铂、三氯氨铂、顺铂和其他杂质，提高杂质之间及杂质与顺铂峰间的分离度。17.其它测试条件和测试步骤与ep8.0中所述的基本一致。18.有益效果：本发明能够将三氯氨铂、反铂与顺铂在同一装置的检测过程中一次性分离出来，操作简易。并且能够提高杂质之间及其它杂质与顺铂峰间的分离度，顺铂峰能够更清晰的显示出来。附图说明19.图1是采用本发明方法获得的20μl对照品溶液1的一种色谱图；20.图2是采用本发明方法获得的20μl对照品溶液2的一种色谱图；21.图3是采用本发明方法获得的20μl顺铂样品（1mg/ml）的一种色谱图；22.图4是采用ep8.0中的检测方法获得的20μl对照品溶液1的一种色谱图；23.图5是采用ep8.0中的检测方法获得的20μl对照品溶液2的一种色谱图；[0024] 图6是采用ep8.0中的检测方法获得的20μl顺铂样品（1mg/ml）的一种色谱图。具体实施方式[0025]实施例1：该实施例针对不同批次样品及柱效、流动相ph的调节偏差进行说明，各峰的保留时间会有前后漂移。[0026]采用权利要求5中的方法。[0027]全部溶液所采用的溶剂均为0.9%氯化钠溶液。[0028]取顺铂样品，精密称定，制成1mg/ml的溶液。[0029]取顺铂对照品，制成1mg/ml的溶液；取反铂对照品，制成0.1mg/ml的溶液；取三氯氨铂对照品，制成0.056mg/ml的溶液。[0030]分别取顺铂对照品、反铂对照品、三氯氨铂对照品溶液0.05ml、5.0ml、5.0ml，一起置于25ml量瓶中，用0.9%氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液1。其中的顺铂、反铂、三氯氨铂的浓度分别为0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.002mg/ml。[0031]量取对照品溶液1，5ml，置于20ml量瓶中，用0.9%氯化钠溶液稀释至刻度，作为对照品溶液2。[0032]测试过程如下：1）色谱柱预处理：在基线平稳之后，取对照品溶液1，20μl，注入液相色谱仪，重复进样5~10针。[0033]2）分别取溶剂、单独配制的反铂及三氯氨铂对照品溶液20μl，注入液相色谱仪用于定位。色谱图中在扣除溶剂峰之后如有与对照品溶液1中保留时间相同的杂质峰，按峰面积以外标法计算；如有杂质峰面积小于对照品溶液2中顺铂峰面积，则忽略不计。[0034]3）分别取对照品溶液1、对照品溶液2、顺铂样品20μl，注入液相色谱仪，获得各自的色谱图，见附图1、图2、图3。[0035]测试数据的限度要求：反铂不得过对照品溶液1中对应峰面积的0.5倍（1.0%）；三氯氨铂不得过对照品溶液1中对应峰面积（1.0%）；其他单个杂质不得过对照品溶液1中顺铂峰面积的（0.2%）；其他杂质的和不得过对照品溶液1中顺铂峰面积的1.5倍（0.3%）。[0036]通过色谱图对比出峰时间、峰型、未知单杂位置等区别，测试结果：图1中，出峰顺序为反铂、三氯氨铂、顺铂。[0037]图2中，根据其顺铂峰（第三个峰）大小，判断是否需要计算样品中未知单杂（如未知单杂峰峰面积大于其峰面积）。[0038]图1-3与图4-6相比，其溶剂峰与其他杂质的峰的重叠状况已得到改善，方便积分。[0039]单独比较图3及图6可看出，顺铂主峰与杂质的分离度得到明显改善（图6中杂质需要手动积分）。









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