一种复合型固定化酶及其制备方法与流程

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种复合型固定化酶及其制备方法。背景技术：2.酶法油脂改性是调变油脂结构和组成，提高其营养价值和适用性的重要手段之一，使用的主要催化剂是脂肪酶。相比较化学法，酶法改性具有条件温和、步骤简单，产品质量高等优点，但成本高限制了其在油脂加工领域的大规模应用。将脂肪酶固定化能够提高稳定性，且便于从反应体系分离和重复使用，是降低生产成本的一种有效办法。3.在实际的酶法油脂改性实验中，固定化酶伴随反应进行的逐步脱附和失水是导致酶活下降的主要原因。为了避免固定化酶的脱附，在固定化酶制备过程中通常都会选择戊二醛为交联剂进行处理。而在食品工业用酶制剂制备中，戊二醛是禁止使用的。为了避免固定化酶的逐步脱水，常向液体酶或者固定化酶中添加具有持水能力的多羟基化合物做保护剂，例如专利wo 2009/010561 a1提及的固定化酶则主要包含载体，多羟基化合物和脂肪酶三部分。此外，周期性对固定化酶进行再水合，也有助于酶活的保持或恢复。4.本领域仍然需要开发新的固定化酶制备方法，使油脂工业用酶制剂具有好的催化活性和循环稳定性。技术实现要素：5.本发明第一方面提供一种复合型固定化酶的制备方法，具体包括以下步骤：6.1)将脂肪酶液和树脂载体接触混合，并振荡吸附，得到混合物a；所述脂肪酶液包含浓度为5-50％的多羟基化合物，优选为蔗糖、葡萄糖或者乳糖；所述树脂载体选自骨架为苯乙烯型或者丙烯酸型的多孔高分子材料，其表面可以分布包含烷基长链，末端带季胺、叔胺、仲胺或伯胺的碱性基团；优选末端带季胺的碱性基团；7.2)在步骤1)的混合物a中加入糖苷酶，得到混合物b；优选地，待混合物a中的脂肪酶达到吸附平衡后再加入糖苷酶；8.3)将步骤2)的混合物b固液分离并将固体物质进行干燥处理，即得所述复合型固定化酶；优选地，混合物b于4-30℃温度范围下搅拌30min以上再进行固液分离。9.或者，包括以下步骤：10.1)将脂肪酶液和树脂载体接触混合，并振荡吸附，得到混合物a；所述脂肪酶液包含浓度为5-50％的多羟基化合物，优选为蔗糖、葡萄糖或者乳糖；所述树脂载体选自骨架为苯乙烯型或者丙烯酸型的多孔高分子材料，其表面可以分布包含烷基长链，末端带季胺、叔胺、仲胺或伯胺的碱性基团；优选末端带季胺的碱性基团；11.2)待脂肪酶液和树脂载体振荡吸附一段时间后，加入糖苷酶，形成混合物b；优选地，待混合物a中的脂肪酶达到吸附平衡后再加入糖苷酶；12.3)待混合物b充分接触后，固液分离并将固体物质进行干燥处理，即得所述复合型固定化酶。13.特别说明的是，脂肪酶液和树脂载体的吸附需要一定的时间，上述方法步骤2)中所述的达到吸附平衡是本领域内的公知常识，具体指溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化即达到吸附平衡。如果脂肪酶液和树脂载体振荡吸附时间较短，离吸附平衡较远，大量脂肪酶留在酶液中不能被固定到载体上，导致最终蛋白含量难以控制，也造成资源浪费。14.在一个或多个实施方案中，步骤3)中所述的充分接触是指混合体系于4-30℃温度范围下搅拌30min以上。15.在一个或多个实施方案中，所述树脂可以选自nkx-8树脂(购自天津南开和成科技有限公司)，或者选自lx1000ha、epha、lx1000epn、lx1000nh、lx1000ea、lxsr-2(购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司)，或者选自lewatit s 4228426843284468452852215228532851285528626863687468(购自朗盛化学(中国)有限公司)，或者选自ecr880488061504150816041640(购自漂莱特中国有限公司)。本发明所述的树脂除了以上用商品名所限定的具体产品以外，还包括任何具有其它商品名的市售树脂产品或通过自行制备或加工得到的树脂，只要它们具有与所述具体产品相同或相似的结构和吸附或交换性能。16.在一个或多个实施方案中，在步骤1)前，还包括对树脂载体进行前处理的步骤，优选的，所述前处理方法包括：分别采用酸、碱溶液浸泡，最后一步必须是碱溶液。例如，可以是酸、碱、酸、碱…酸、碱；也可以碱、酸、碱、酸、碱…酸、碱，但最后一步必须碱，因为本发明的树脂为碱性树脂。优选采用酸碱交替浸泡两次以上，然后水洗至中性，除去游离水。更优选地，可以参考专利cn102839166b中对树脂载体的前处理方法。17.在一个或多个实施方案中，步骤1)中树脂载体和脂肪酶液中酶蛋白的质量比为1:0.01-0.05。18.在一个或多个实施方案中，步骤2)中所述脂肪酶为用于油脂分解的酶，选自动物、植物或微生物的脂肪酶；优选地，所述脂肪酶选自疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(mucor miehei)、米根霉(rhizopus oryzae)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、米黑根毛霉(rhizomucor miehei)、黑曲霉(aspergillus niger)或以上微生物的基因改造菌种。19.在一个或多个实施方案中，步骤1)中所述振荡吸附在4-30℃的温度条件下进行，振荡速度为100-200rpm，优选120-150rpm。20.在一个或多个实施方案中，步骤2)中所述糖苷酶为果糖基转移酶、蔗糖酶、菊糖酶、a-葡萄糖苷酶、乳糖酶或者半乳糖苷酶，且糖苷酶中的酶蛋白质量为步骤1)所述脂肪酶液中酶蛋白质量的1-10％，优选2.5-5％。21.在一个或多个实施方案中，步骤3)中所述的固液分离方法为真空抽滤或布袋离心过滤。22.在一个或多个实施方案中，步骤3)中所述的干燥处理方法为室温托盘晾干、真空箱干燥、流化床干燥或冷冻干燥。23.本发明第二方面提供一种复合型固定化酶或其包装产品，所述复合型固定化酶通过以上所述的方法制备得到，其蛋白含量在3-10％，水分含量在3-15％。24.本发明第三方面提供以上所述复合型固定化酶在油脂工业中作为催化剂的应用和/或用于制备母乳替代物，例如opo中的应用。25.本发明第四方面提供一种母乳脂肪替代物，例如opo的制备方法，所述方法包括将以上方法制备得到的的复合型固定化酶添加到甘油三硬脂酸酯与油酸的混合底物中，优选的，所述方法包括以下步骤：将甘油三硬脂酸酯与油酸按质量比1:2-1:4的比例混合溶解配成底物，添加以上方法制备得到的复合型固定化酶，60-70℃气浴，150-200rpm反应1-6h；所述复合型固定化酶的添加量为所述底物质量的6-12％。26.在本发明中，加入糖苷酶的目的是：(1)调变蛋白周围多羟基保护剂的存在结构及跟蛋白的相互作用形式，因为糖苷酶可以催化脂肪酶的保护剂蔗糖等发生反应，生成功能性低聚糖，改变蛋白周围保护剂的羟基数量及跟脂肪酶的作用形式，增加纳米孔道中的空间位阻和持水能力，进而有效降低油脂反应中蛋白的脱落和脱水失活；(2)先将脂肪酶吸附后，再将糖苷酶后吸附在树脂载体上，使大部分糖苷酶吸附到树脂孔道的外围及孔口处，也可以借助蛋白增加空间位阻，降低蛋白脱落。27.与现有技术相比，本发明的优点在于：28.(1)使用本发明制备的复合型固定化酶，可进行油脂工业的各种酯化及酯交换相关应用，固定化酶表现出优异的催化活性和循环稳定性。29.(2)使用本发明方法制备的固定化酶，能够有效保持蛋白催化结构及减少油脂反应中的蛋白脱落，在酶法人乳替代物结构脂合成反应中，不需额外添加水，即可循环使用50次以上。30.(3)针对存储时间长导致酶活下降的液体酶源，使用本发明的制备方法，固定化酶的酶活和循环稳定性出现显著提升。附图说明31.图1为nkx-8载体系列固定化酶(a、b、c、f、i、j、q、lipozyme rm im)在opo生产中c52的含量随反应批次的变化。32.图2为lxsr-2和ecr1640载体系列固定化酶(d、e、g、h)在opo生产中c52的含量随反应批次的变化。33.图3为nkx-8和lxsr-2树脂固定化储存一年的rml酶液(k、l、m、n、o、p)，并利用糖苷酶处理技术对固定化酶酶活和寿命的改善情况。具体实施方式34.应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。35.本发明提供一种复合型固定化酶的制备方法，具体包括以下步骤：36.1)将脂肪酶液和树脂载体接触混合，并振荡吸附；所述脂肪酶液包含浓度为5-50％的多羟基化合物，优选为蔗糖、葡萄糖或者乳糖；所述树脂载体选自骨架为苯乙烯型或者丙烯酸型的多孔高分子材料，其表面可以分布包含烷基长链，末端带季胺、叔胺、仲胺或伯胺的碱性基团；优选末端带季胺的碱性基团；37.2)待脂肪酶液和树脂载体振荡吸附一段时间后，加入糖苷酶，形成混合体系；优选地，待脂肪酶达到吸附平衡后加入糖苷酶；38.3)混合体系充分接触后，固液分离并将固体物质进行干燥处理，即得所述复合型固定化酶。39.在一个或多个实施方案中，所述树脂可以选自nkx-8树脂(购自天津南开和成科技有限公司)，或者选自lx1000ha、epha、lx1000epn、lx1000nh、lx1000ea、lxsr-2(购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司)，或者选自lewatit s 4228426843284468452852215228532851285528626863687468(购自朗盛化学(中国)有限公司)，或者选自ecr880488061504150816041640(购自漂莱特中国有限公司)。40.在一个或多个实施方案中，在步骤1)前，还包括对树脂载体进行前处理的步骤，优选的，所述前处理方法包括：分别采用酸、碱溶液浸泡，最后一步必须是碱溶液。例如，可以是酸、碱、酸、碱…酸、碱；也可以碱、酸、碱、酸、碱…酸、碱，但最后一步必须碱，因为本发明的树脂为碱性树脂。优选采用酸碱交替浸泡两次以上，然后水洗至中性，除去游离水。41.在一个或多个实施方案中，步骤1)中树脂载体和脂肪酶液中酶蛋白的质量比为1:0.01-0.05。42.在一个或多个实施方案中，步骤2)中所述脂肪酶为用于油脂分解的酶，选自动物、植物或微生物的脂肪酶；优选地，所述脂肪酶选自疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(mucor miehei)、米根霉(rhizopus oryzae)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、米黑根毛霉(rhizomucor miehei)、黑曲霉(aspergillus niger)或以上微生物的基因改造菌种。43.在一个或多个实施方案中，步骤1)中所述振荡吸附在4-30℃的温度条件下进行，振荡速度为100-200rpm，优选120-150rpm。44.在一个或多个实施方案中，步骤2)中所述糖苷酶为果糖基转移酶、蔗糖酶、菊糖酶、a-葡萄糖苷酶、乳糖酶或者半乳糖苷酶，且糖苷酶中的酶蛋白质量为步骤1)所述脂肪酶液中酶蛋白质量的1-10％，优选2.5-5％。45.在一个或多个实施方案中，步骤3)中所述的充分接触是指混合体系于4-30℃温度范围下搅拌30min以上。46.在一个或多个实施方案中，步骤3)中所述的固液分离方法为真空抽滤或布袋离心过滤。47.在一个或多个实施方案中，步骤3)中所述的干燥处理方法为室温托盘晾干、真空箱干燥、流化床干燥或冷冻干燥。48.本发明第二方面提供一种复合型固定化酶或其包装产品，所述固复合型定化酶通过以上所述的方法制备得到，其蛋白含量在3-10％，水分含量在3-15％。49.本发明第三方面提供以上所述复合型固定化酶在油脂工业中作为催化剂的应用和/或用于制备母乳脂肪替代物，例如opo的应用。50.本发明第四方面提供一种母乳脂肪替代物，例如opo的制备方法，所述方法包括将以上方法制备得到的的复合型固定化酶添加到甘油三硬脂酸酯与油酸的混合底物中，优选的，所述方法包括以下步骤：将甘油三硬脂酸酯与油酸按质量比1:2-1:4的比例混合溶解配成底物，添加以上方法制备得到的复合型固定化酶，60-70℃气浴，150-200rpm反应1-6h；所述复合型固定化酶的添加量为所述底物质量的6-12％。51.实施例52.实施例(1)53.nkx-8树脂(购自天津南开和成科技有限公司)，使用前先采用1m的hcl溶液和1m的naoh先后交替处理两遍(最后用naoh处理)，每次处理两小时，最后用清水洗至中性，抽滤去掉游离水备用。称取50g处理好的nkx-8，加入100ml自产rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml，含30％蔗糖溶液，新鲜、酶活8000u/mg)，室温150rpm振荡24h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.5mg/ml以下。且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。再向固液混合物中再加入25ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司，1mg/ml)，继续振荡8h后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶a。54.实施例(2)55.称取50g处理好的nkx-8(同实施例1)，加入250ml自产rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，新鲜、酶活8000u/mg)，室温150rpm振荡24h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.5mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。再向固液混合物中再加入25ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司，1mg/ml)，继续振荡1h后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶b。56.实施例(3)57.称取50g处理好的nkx-8(同实施例1)，加入50ml自产rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，新鲜、酶活8000u/mg)，室温150rpm振荡12h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.5mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。再向固液混合物中再加入25ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司，1mg/ml)，继续振荡24h后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶c。58.实施例(4)59.lxsr-2树脂(购自西安蓝晓科技新材料有限公司)，处理方法同实施例(1)。60.称取50g处理好的lxsr-2，加入100ml自产rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，新鲜、酶活8000u/mg)，室温150rpm振荡24h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.5mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。向固液混合物中再加入100ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司,1mg/ml)，继续振荡24h后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h,得固定化酶d。61.实施例(5)62.ecr1604树脂(购自漂莱特树脂有限公司)，处理方法同实施例(1)。63.称取50g处理好的ecr1604树脂，加入100ml自产rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，新鲜，酶活8000u/mg)，室温150rpm振荡16h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.5mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。向固液混合物中再加入10ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司,1mg/ml)，继续振荡8h后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h,得固定化酶e。64.对比例(1)65.称取50g处理好的nkx-8(同实施例1)，加入100ml来自米曲的rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，新鲜，酶活8000u/mg)，室温150rpm振荡16h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.2mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶f。66.对比例(2)67.称取50g处理好的lxsr-2树脂(同实施例4)，加入100ml来自米曲的rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，新鲜，酶活8000u/mg，)，室温150rpm振荡16h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.2mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶g。68.对比例(3)69.称取50g处理好的ecr1604树脂(同实施例5)，加入100ml来自米曲的rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，新鲜，酶活8000u/mg)，室温150rpm振荡16h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.2mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶h。70.对比例(4)71.称取50g处理好的nkx-8(同实施例1)，加入100ml自产rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml，无多羟基保护剂，新鲜、酶活8000u/mg)，室温150rpm振荡8h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.5mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。向固液混合物中再加入25ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司，1mg/ml)，继续振荡8h后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶i。72.对比例(5)73.称取50g处理好的nkx-8(同实施例1)，加入100ml自产rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，新鲜、酶活8000u/mg)，室温150rpm振荡8h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.5mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。向固液混合物中再加入25ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司，1mg/ml)，振荡10min后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶j。74.实施例(4)75.称取50g处理好的nkx-8(同实施例1)，加入100ml来自米曲的rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，存储一年，酶活5000u/mg)，室温150rpm振荡6h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.2mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。向固液混合物中再加入25ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司,1mg/ml)，继续振荡10h后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶k。76.对比例(6)77.称取50g处理好的nkx-8(同实施例1)，加入100ml来自米曲的rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，存储一年，酶活6000u/mg)，室温150rpm振荡12h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.2mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶l。78.对比例(7)79.称取50g处理好的nkx-8(同实施例1)，同时加入100ml来自米曲的rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，存储一年，酶活5000u/mg)和25ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司,1mg/ml)。室温150rpm振荡24h后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶m。80.实施例(5)81.称取50g处理好的lxsr-2(同实施例4)，加入100ml来自米曲的rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，存储一年，酶活5000u/mg)，室温150rpm振荡8h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.2mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。向固液混合物中再加入25ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司,1mg/ml)，继续振荡7h后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶n。82.对比例(8)83.称取50g处理好的lxsr-2(同实施例4)，加入100ml来自米曲的rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，存储一年，酶活5000u/mg)，室温150rpm振荡18h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.2mg/ml以下，且随着吸附时间的延长，溶液中剩余蛋白含量不发生明显变化，说明达到吸附平衡。真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶o。84.对比例(9)85.称取50g处理好的lxsr-2(同实施例4)，同时加入100ml来自米曲的rml液体(菌株bc4-rml(cgmcc no:19263)经米曲酶发酵，10mg/ml,含30％蔗糖溶液，存储一年，酶活5000u/mg)，室温150rpm振荡4h后(此时未达到吸附平衡)，向固液混合物中再加入25ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司,1mg/ml)，继续振荡10h后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶p。86.对比例(10)87.称取50g处理好的nkx-8(同实施例1)，加入200ml palatase 20000l液体(novozymes，20000u/g，5mg/ml)，室温150rpm振荡8h后，bradford法测定溶液中蛋白含量在0.5mg/ml以下。向固液混合物中再加入25ml果糖基转移酶液(购自潍坊康地恩生物科技有限公司,1mg/ml)，继续振荡8h后，真空抽滤去除液体，将树脂固体室温干燥24h，得固定化酶q。88.表1给出了上述实施例和对比例的固定化酶制备所用两种酶含量及固定化酶蛋白水分含量89.[0090][0091]应用1固定化酶酯交换活力的测定[0092]采用精炼大豆油(市售元宝牌大豆油)和极度氢化大豆油(购自嘉里特种油脂有限公司)为底物(w/w 73:27)，酶(以载体和酶的总质量计)和底物质量比为1:20，在70℃反应30min，反应完毕后取出产物测其40℃固体脂肪(sfc)含量。每次取出产物把酶留在反应器内，再加入底物进行反应，进行5轮反应。[0093]将以上实施例和对比例制备得到的固定化酶分别按照该方法进行5轮反应。[0094]40℃sfc含量检测方法：将装有样品的固脂管分别放入100℃烘箱中15min,60℃水浴5min，0℃水浴60min，40℃水浴30min，然后用核酸共振仪(德国布鲁克光谱仪器有限公司型号mq20)测其固脂含量(solid fat content,sfc)。酯交换活力(iun)的公式为式(1)。表2为不同固定化酶在5轮反应中的酯交换活力变化情况。[0095]酯交换活力(iun)＝(sfc0-sfc1)/30*1260ꢀꢀ(式1)[0096]式中，sfc0是指没有经过酶反应的底物油脂在40℃下的sfc值，sfc1指40℃下酶反应产物样品的sfc值。sfc(solid fat content)是指固脂含量。[0097]表2:酯交换活力[0098][0099]应用2固定化酶用于母乳脂肪替代物opo的制备[0100]将甘油三硬脂酸酯与油酸按质量比1:2的比例混合溶解配成底物，固定化酶添加量为9％(w/w)，60℃气浴，150rpm反应5h,制备母乳脂肪替代物1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(opo)。反应结束后除掉脂肪酸，并通过gc和hplc分析产物中cn52甘油三酯的含量，甘油二酯的含量。[0101]将以上实施例和对比例制备得到的固定化酶分别按照该方法进行opo的制备。表3给出了不同固定化酶进行opo生产的使用寿命。图1-3为不同固定化酶在opo生产时产物中c52含量的变化情况。[0102]固定化酶催化性能的判断：(1)以opo产物中cn52的含量作为酶活的比较标准，cn52含量高说明酶活大。(2)根据国标gb30604-2015中提到的cn52甘油三酯含量大于40％为opo产物合格的标准，并计算达标的反应批次，作为固定化酶的使用寿命数据。[0103]表3固定化酶进行opo生产的使用寿命[0104][0105]









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