一种基于仿生CsPbBr3NCs的电化学和荧光双信号传感器检测成孔毒素的方法

无机化学及其化合物制造及其合成,应用技术一种基于仿生cspbbr3ncs的电化学和荧光双信号传感器检测成孔毒素的方法技术领域1.本发明涉及成孔毒素检测领域，尤其涉及一种基于脂质体包封的溴化铯铅钙钛矿纳米晶体用于成孔毒素的电化学和荧光双信号检测方法。背景技术：2.细菌感染是全球发病率和死亡率的重要诱因，严重威胁了人类生命健康和公共安全。细菌感染不仅会引发慢性疾病、导致死亡，也会引起医疗器械的相关感染，极大地增加了医疗风险。细菌产生的毒素与其致病性密切相关，其中，成孔毒素作为最大的一类蛋白毒素(约占25％)是细菌的重要致病毒力因子，可由多种致病菌产生，如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和结核分枝杆菌等。在细菌感染过程中，成孔毒素嵌到靶细胞膜上并形成跨膜通道，从而破坏靶细胞膜结构的完整性，导致细胞内含物的泄露，最终引起靶细胞的死亡，引发机体进一步的感染。3.目前，常规的检测方法如酶联免疫吸附法(elisa)、高压液相色谱法(hplc)可以实现对毒素的精准定量分析。但存在设备昂贵、检测步骤繁琐、需专职人员操作等缺点，无法满足资源匮乏地区批量样本检测的需求。例如，中国专利公开号cn 111855883 b，公开日2021年1月15日，发明创造的名称为“一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法”，该申请案公开了一种液相色谱串联质谱法，用于样本中蜂毒肽特征肽的定量分析。但该分析方法依赖于昂贵的设备、实验步骤繁琐，需对待测样品进行前处理、耗时长等。因此，亟需开发一种简单经济、快速便捷的广谱性成孔毒素检测方法。近年来，基于电化学和荧光的检测方法被广泛应用于生物传感领域。电化学检测技术具有灵敏度高、特异性强、操作简单、仪器易于小型化的潜力，是一种重要的分析手段。荧光检测手段则能实现对样本的快速分析，便捷经济，在大样本分析中具有较强的优势。4.卤化铯铅钙钛矿cspbx3(x＝cl，br，i)纳米晶体(ncs)作为一种新兴的无机材料，拥有优越的光电性能，例如极高的荧光量子产率、窄的发光半峰宽，除此之外，还具有合成简单、成本低的优势，近年来在光电领域取得了巨大的发展。然而，cspbx3ncs在水环境中极不稳定，非常容易分解而导致荧光猝灭。因此，本研究利用脂质体对cspbbr3ncs进行包封(cspbbr3ncs@pl)，形成的磷脂膜一方面可以保护cspbbr3ncs脆弱的内部晶体结构，另一方面可以与广谱成孔毒素相互作用。当靶标成孔毒素存在时，成孔毒素触发的磷脂膜穿孔导致水分子渗透，破坏cspbbr3ncs结构，荧光信号减弱。同时，cspbbr3ncs中pb2+发生泄漏，利用阳极溶出伏安法(asv)可以获得增强的电化学信号。两种信号互为补充，提供了更为精准的检测信息。技术实现要素：5.本发明提供的方法克服了现有技术的不足，提出了一种基于脂质体包封的cspbbr3ncs用于成孔毒素的电化学、荧光双信号定量检测方法，该方法利用cspbbr3ncs固有的荧光和电化学性能，实现了对成孔毒素的高效检测。与单信号输出相比，本发明构建的双信号传感器灵敏度高、分析结果可信，且检测过程快速简单，为成孔毒素的检测提供了新的思路。6.为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：7.本发明公开了一种基于cspbbr3ncs的电化学和荧光双信号传感器检测成孔毒素的方法，包括如下步骤：8.a)cspbbr3ncs的制备：利用过饱和重结晶方法，合成cspbbr3ncs：将pbbr2，csbr，油酸和油胺加入dmf中，加热搅拌后作为前驱液。随后将前驱液快速注入甲苯中，溶液立即由无色变为黄色，搅拌，离心，得到cspbbr3ncs；9.b)cspbbr3ncs@pl的制备：利用薄膜水化法将cspbbr3ncs溶液与dopc(二油酰磷脂酰胆碱)混合在氯仿中，加入圆底烧瓶。在氮气氛中除去氯仿，圆底烧瓶底部有薄膜形成。随后加入水，超声，离心，将沉淀物重悬，得到cspbbr3ncs@pl；10.c)电化学传感器的构建与测量：室温下，采用三电极系统，金电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。将cspbbr3ncs@pl溶液与0.05～150μm范围的成孔毒素室温孵育15～25min，用阳极溶出伏安法(asv)测定待测液中的pb2+，待测液为0.1m hac-naac缓冲液(0.1m kcl，ph 4.5)，成孔毒素浓度范围为0.05～150μm；11.d)荧光检测方法：将cspbbr3ncs@pl溶液与0.05～150μm范围的成孔毒素室温孵育15～25min，用荧光分光光度计测定荧光强度。12.步骤“a)”中，油胺的含量为5-15％，油酸的含量为10-20％。13.步骤“a)”中，前驱液加热温度为85～95℃。14.步骤“a)”中，前驱液搅拌时间为1.5～2.5h。15.步骤“b)”中，dopc的浓度为0～1.2mm。16.步骤“c)”中，cspbbr3ncs@pl溶液的浓度为0.55～0.65mm。17.步骤“c)”中，室温孵育时间为15～25min。18.步骤“d)”中，cspbbr3ncs@pl溶液的浓度为0.55～0.65mm。19.步骤“d)”中，室温孵育时间为15～25min。20.与现有技术相比，本发明的有益效果为：21.1.本发明制备的溴化铯铅钙钛矿纳米晶体荧光量子产率高；22.2.脂质体包封的溴化铯铅钙钛矿纳米晶体合成简单，成本低；23.3.脂质体包封的溴化铯铅钙钛矿纳米晶体荧光能在较长时间内保持稳定，保障检测质量，利于存储；24.4.利用晶体分解后产生的铅离子作为电化学信号，电极无需预先修饰，可多次利用，简化操作步骤；25.5.电化学和荧光双信号输出，互为补充，能够提供更为精准的检测。所需的设备易得，分析过程简单快速，可以实现对广谱成孔毒素的定量分析，具有广阔的应用前景。附图说明26.图1为本发明基于仿生cspbbr3ncs的电化学和荧光双信号传感器检测成孔毒素的流程示意图；27.图2为cspbx3ncs的透射电镜图；28.图3为cspbbr3ncs@pl的透射电镜图；29.图4为cspbbr3ncs和cspbbr3ncs@pl的x射线晶体衍射图谱；30.图5为不同浓度dopc包封的cspbx3ncs一段时间内荧光强度变化；31.图6为100μm成孔毒素处理后cspbbr3ncs@pl的透射电镜图；32.图7为cspbbr3ncs@pl与不同浓度成孔毒素(0.05～150μm)孵育后asv响应信号及pb2+的电化学信号与lg(c)线性关系曲线图；33.图8为cspbbr3ncs@pl与不同浓度成孔毒素(0.05～150μm)孵育后荧光响应信号及荧光强度与lg(c)线性关系曲线图。具体实施方式34.为了更清楚地阐释本发明的目的、技术方案及优势，下面结合附图与实施例，对本发明做进一步说明：35.实施例136.溴化铯铅钙钛矿纳米晶体(cspbbr3ncs)的制备：37.利用过饱和重结晶法，将pbbr2，csbr，油酸和油胺分别加入dmf中。混合物加热至90℃。搅拌2h，得到澄清的前驱液。关于油酸的含量，考虑到pbbr2和csbr溶解度，油酸的含量为10-20％，优选为15-20％，；考虑到cspbbr3ncs的稳定性，油胺的含量为5-15％，优选为5-10％。在室温下，将1ml前驱体溶液快速加至50ml甲苯中，1500rpm搅拌15s，随后将搅拌速度调节至150rpm搅拌2h。接着离心9000rpm，5min后收集粗产物，重悬浮于正己烷溶液中，重复“离心-重悬浮”步骤三次。38.参见附图1，为本实施例中cspbbr3ncs的透射电镜图，呈现立方体的晶体结构，平均尺寸为26nm。39.参见附图3，为本实施例中cspbbr3的x射线晶体衍射图谱，特征峰与标准图谱相一致。40.实施例241.脂质体包封的溴化铯铅钙钛矿纳米晶体(cspbbr3ncs@pl)的制备：42.通过薄膜水化法制备cspbbr3ncs@pl，将400μl cspbbr3ncs溶液分别与0～1.2mm dopc混合在氯仿中，加入圆底烧瓶。考虑到cspbbr3ncs@pl的稳定性，dopc的浓度优选为1.2mm。然后在氮气氛中逐渐去除氯仿，烧瓶底部有薄膜形成。加入400μl水溶液，超声处理30s形成cspbbr3ncs@pl溶液，接着将溶液9000rpm离心15min，最后将沉淀物重新分散在400μl水溶液中备用。43.参见附图2，为本实施例中cspbbr3ncs@pl的透射电镜图，脂质体紧密包裹在立方体cspbbr3ncs的外侧，平均尺寸在62nm。44.参见附图3，为本实施例中cspbbr3ncs@pl的x射线晶体衍射图谱，特征峰与标准图谱相一致。45.参见附图4，为本实例中不同浓度dopc包封的cspbx3ncs一段时间内荧光强度变化，经脂质体包封后的cspbbr3荧光能保持相对稳定。46.实施例347.电化学传感器的构建与测量：48.采用三电极系统，其中，金电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。金电极首先在水虎鱼(h2so4∶h2o2＝3∶1)中浸泡30min，随后依次用1μm，0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末抛光电极表面。分别在乙醇和去离子水中超声10min以去除残留的粉末，然后在50％硝酸中浸泡30min。在0.5m h2so4对电极进行电化学活化，将活化后的电极用去离子水冲洗，并用氮气吹干备用。49.将10μl成孔毒素加入400μl cspbbr3ncs@pl溶液中，成孔毒素的终浓度为0，0.5，3，10，50，100，150μm，室温孵育20min。随后将待测液9500rpm离心5min，将上清液分散在4.5ml 0.1m hac-naac缓冲液(0.1m kcl，ph 4.5)中。将电极插入缓冲液中进行电化学测量。以pb2+的电化学信号与成孔毒素浓度进行线性拟合，绘制标曲。电化学测量方法为阳极溶出伏安法(asv)，在chi660c电化学工作站上进行。预富集电位为-1v，120s，然后在-0.5～+0.2v进行差分脉冲扫描。实验参数：脉冲幅度25mv，脉冲频率15hz，静置时间2s。实验前向电解液中通入氮气除氧15min。50.参见附图5，为本实例中100μm成孔毒素处理后cspbbr3ncs@pl的透射电镜图，cspbbr3ncs结构解离。51.参见附图6，为本实施例中cspbbr3ncs@pl与不同浓度成孔毒素(0.05～150μm)孵育后asv响应信号及pb2+的电化学信号与lg(c)线性关系曲线图。52.实施例453.荧光检测方法：54.将10μl成孔毒素加入400μl cspbbr3ncs@pl溶液中，成孔毒素的终浓度为0，5，10，30，60，100，150μm，室温孵育20min后用荧光分光光度计测定溶液荧光强度。以荧光强度与成孔毒素浓度进行线性拟合，绘制标曲。55.以上对本发明的技术方案与应用进行了详细介绍。具体实施例的说明仅用于更清楚地阐释本发明的实施方法而非对本发明的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明技术方案的实质范围下，可以进行修饰或改进，这些修饰和改进也应涵盖在本发明的权利要求范围中。56.参见附图7，为本实施例中cspbbr3ncs@pl与不同浓度成孔毒素(0.05～150μm)孵育后荧光响应信号及荧光强度与lg(c)线性关系曲线图。









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