一种靶向的长循环尿激酶纳米粒及其制备方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及一种纳米粒及其制备方法，具体地涉及一种靶向的长循环尿激酶纳米粒的制备方法。背景技术：2.血栓是血液在血管中发生凝固形成的血凝块，从而减缓甚至阻塞血液流动。在正常情况下，血管循环系统的血液损伤和外渗经常会发生，止血是维持血管完整性和血流调节的过程。正常的止血可能被病理因素所阻碍，导致血管形成和血管闭塞在动脉或静脉中不受控制，从而导致血栓形成。随着病理状态的进展，血凝块随着血小板的聚集而增大，并进一步形成部分或全部血管腔阻塞。血液流动的减缓或停止，会影响供血下游组织的营养提供以及二氧化碳和氧气的交换，从而导致组织缺血坏死。而目前，由血栓栓塞血管引起的心脑血管疾病已经成为全球死亡率最高的疾病。药物溶栓是临床上血栓治疗的常用方法。但是，溶栓类药物的体内半衰期短，需要大量频繁地用药，且缺乏组织特异性，不能选择性地作用于病变部位，导致治疗费用昂贵，疗效不理想，还极易出现出血或溶栓后血管再闭塞等严重并发症，从而限制了其临床应用。因此，迫切需要开发一种能够携带抗凝防栓药物并将其靶向输送至血栓、具有较长的体内循环时间且毒性小的有效制剂，而增强抗凝防栓药物的特异靶向性，延长药物在体内的作用时间是减少用药剂量、提高生物利用度、降低副作用的关键措施。3.因此，为了解决以上问题，有研究者采用聚乳酸(pla)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)作为载体材料包裹溶栓药物制备成缓释剂型，以期延长药物体内半衰期。但是目前的研究还存在一些缺点和亟需解决的问题：①使用传统聚乳酸或聚乳酸羟基乙酸共聚物(plga)作为载体，所制备的溶栓药物缓释制剂因自催化效应导致药物释放过快，缓释效果不佳且不易控制；②单纯长循环纳米颗粒的缓释效果、包封率、载药率均不够理想；③现阶段，“精准治疗”已上升为国家战略。对于心血管疾病而言，能够在血栓形成前，“精准靶向其突然变化的血液成分并将之清除”，是目前解决血栓问题的关键，也是实现心血管疾病“精准预防”的突破口。因此研制一种长效缓释、靶向性好、载药量高且体内半衰期长的载药长循环缓释纳米粒具有重要的临床意义。技术实现要素：4.本发明所要解决的技术问题是：提供一种直接靶向血栓中的纤维蛋白的长循环尿激酶纳米粒的制备方法，其具有靶向血栓并能够在体内缓慢释放溶栓药物的优点，从而延长药物半衰期、减少服药次数、提高疗效、降低毒副作用。5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种靶向的长循环尿激酶纳米粒，其原料包括尿激酶、载体材料、表面活性剂及靶向多肽；所述载体材料为聚乙二醇-聚乳酸共聚物(peg-pla)或聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸共聚物(peg-plga)，其中，聚乙二醇-聚乳酸共聚物或聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸共聚物中的-聚乳酸或聚乳酸乙醇酸嵌段的分子量为15000～40000，聚乙二醇嵌段的分子量为2000～4000；所述表面活性剂为司盘80、泊洛沙姆188、吐温80、聚乙烯醇(pva)中的任意一种或几种的混合物。6.优选地，所述靶向多肽采用对纤维蛋白有较高特异性识别的归巢肽creka(cys-arg-glu-lys-ala)。7.本发明还提供了上述靶向的长循环尿激酶纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：8.步骤1)：将载体材料、表面活性剂溶于二氯甲烷中，得到混合溶液；将尿激酶溶于去离子水中，得到内水相；将内水相加入到混合溶液中，超声乳化，形成初乳；9.步骤2)：将初乳倒入含有表面活性剂的水溶液中，超声乳化，形成第一步复乳；将第一步复乳再倒入含有表面活性剂的水溶液中，超声乳化，形成复乳；10.步骤3)：将复乳倒入含有表面活性剂的水溶液中，搅拌，然后离心，取沉淀，用水洗涤后再次离心，将所得沉淀物取出，重悬于2-吗啉代乙烷磺酸溶液中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，置于摇床孵育；再次进行离心洗涤，将所得沉淀物取出；11.步骤4)：将步骤3)所得沉淀物重悬于2-吗啉代乙烷磺酸溶液中，并加入多肽，置于摇床孵育，即得靶向的长循环尿激酶纳米粒；将该纳米粒离心洗涤，将所得沉淀物取出后，混悬于含有甘露醇的溶液中，冷冻干燥，得到相应的载药微囊。12.优选地，所述步骤1)中表面活性剂为司盘80与泊洛沙姆188的混合物，两者的质量比为(20～30)：(10～15)。13.优选地，所述步骤1)中载体材料、表面活性剂、二氯甲烷按g:g:g:l计的比例为(20～100):(20～200):1。14.优选地，所述步骤1)中尿激酶与去离子水的质量比为1:(5～10)。15.优选地，所述步骤2)中表面活性剂为吐温80，其水溶液与步骤1)中二氯甲烷的体积比为(2～10)：1，吐温80在水溶液中的质量浓度为2～3％。16.优选地，所述步骤3)中表面活性剂为聚乙烯醇(pva)，其水溶液与步骤1)中二氯甲烷的体积比为(20～100)：1，pva在水溶液中的质量浓度为0.1～1％。17.优选地，所述步骤3)中2-吗啉代乙烷磺酸溶液的浓度为0.1～0.5mol/l，其ph值为5.2；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(1～4):1。18.优选地，所述步骤1)、步骤2)、步骤3)均在0～4℃下进行。19.优选地，所述步骤4)中2-吗啉代乙烷磺酸溶液的浓度为0.1～0.5mol/l，其ph值为8；甘露醇溶液与步骤3)中复乳的体积比为(1-3)：10，甘露醇在溶液中的质量浓度为2～5％；冷冻干燥的温度为-40℃，时间为12～40小时。20.本发明采用复乳溶剂挥发法制备靶向的长循环尿激酶纳米粒，所使用的载体材料为生物可降解高分子材料，本身无毒，代谢产物为二氧化碳和水，其中间产物也是人体正常的代谢产物，无刺激性，具有良好的生物相容性。微囊制备工艺稳定、可行，微囊的形态圆整，表面光滑，流动性好，粒度分布均匀，平均粒径为200纳米，包封率为60％左右，且经冻干后粒径无明显变化。能够成功躲避单核吞噬细胞系统(mono-nuclear phagocyte system，mps)的截留。21.本发明在所述长循环纳米颗粒表面接枝对纤维蛋白有较高特异性识别的归巢肽creka(cys-arg-glu-lys-ala)，以完成纳米粒子的纤维蛋白靶向构建，在“纤维蛋白出现后到血栓形成前”这一时间段准确靶向纤维蛋白，并将药物递送到位。22.本发明的尿激酶靶向长循环纳米粒在体内滞留时间长。普通纳米粒进入循环系统后，易被网状内皮组织系统识别吸收，这样会使得载药纳米粒在病变部位的低累积，导致没有足够剂量来产生治疗效果。为此，本发明在纳米粒表面中修饰聚乙二醇(peg)，peg的修饰能够减少血液对纳米粒的调理作用，避免网状内皮系统的吞噬，从而延长循环时间，以获得更充足的时间到达靶向部位。23.本发明在所述靶向长循环纳米颗粒中包埋溶栓药物尿激酶，通过药物载体在靶向部位即纤维蛋白处的缓慢释放，完成对纤维蛋白的溶解。24.由此，本发明获得了一种包封尿激酶的长循环纳米粒。并在大鼠体内代谢动力学实验结果显示，本发明的尿激酶长循环纳米粒在体内停留时间较普通纳米粒明显延长。25.本发明的制备方法步骤简单、重复性好，产率高，易应用于工业化生产。附图说明26.图1为本发明的靶向的长循环尿激酶纳米粒的制备方法的粒径分析结果图；27.图2为本发明的靶向的长循环尿激酶纳米粒的制备方法的体外释放结果图。具体实施方式28.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。29.实施例130.本实施例提供了一种靶向的长循环尿激酶纳米粒的制备方法，包括以下步骤：31.取100mg peg-plga、200mg司盘80和泊洛沙姆188混合溶液溶于5ml二氯甲烷中，得混合溶液；将1mg尿激酶溶于0.5ml去离子水中，得到内水相；将内水相加入混合溶液中，超声乳化1min后，形成初乳；将初乳倒入25ml含0.5g吐温80水溶液中，超声乳化1min后，形成第一步复乳；将第一步复乳再倒入75ml含1.5g吐温80水溶液中，超声乳化1min后，形成复乳；32.将第二步复乳倒入100ml含0.1g pva水溶液中，搅拌3～4h，以充分挥发二氯甲烷，然后高速离心15min，取沉淀，用水洗涤后再次离心，将所得沉淀物取出后。重悬于2-吗啉代乙烷磺酸溶液中，再按摩尔比为2：1加入edc和nhs，冰浴置于摇床孵育2～4h。再次进行离心洗涤，将所得沉淀物取出；所述乳化液和沉淀物的制备步骤，均在0～4℃下进行。33.将沉淀物重悬于2-吗啉代乙烷磺酸溶液中，并加入5mg的creka多肽，冰浴置于摇床孵育12h，即制得纳米粒。将制得的纳米粒离心洗涤，将所得沉淀物取出后，混悬于含有甘露醇的溶液中，放入冰箱进行冷冻，进行冷冻干燥，得到载药微囊。34.实施例235.本实施例提供了一种靶向的长循环尿激酶纳米粒的制备方法，包括以下步骤：36.取100mg peg-plga、500mg司盘80和泊洛沙姆188混合溶液溶解于5ml二氯甲烷中，得混合溶液；将1mg尿激酶溶于0.5ml去离子水中，得到内水相；将内水相加入混合溶液中，超声乳化1min后，形成初乳；将初乳倒入25ml含0.5g吐温80水溶液中，超声乳化1min后，形成第一步复乳；将第一步复乳再倒入75ml含1.5g吐温80水溶液中，超声乳化1min后，形成复乳；37.将第二步复乳倒入100ml含0.1g pva水溶液中，搅拌3～4h，以充分挥发二氯甲烷，然后高速离心15min，取沉淀，用水洗涤后再次离心，将所得沉淀物取出后。重悬于2-吗啉代乙烷磺酸溶液中，再按摩尔比为2：1加入edc和nhs，冰浴置于摇床孵育2～4h。再次进行离心洗涤，将所得沉淀物取出；所述乳化液和沉淀物的制备步骤，均在0～4℃下进行。38.将沉淀物重悬于2-吗啉代乙烷磺酸溶液中，并加入10mg的creka多肽，冰浴置于摇床孵育12h，即制得纳米粒。将制得的纳米粒离心洗涤，将所得沉淀物取出后，混悬于含有甘露醇的溶液中，放入冰箱进行冷冻，进行冷冻干燥，得到载药微囊。39.实施例340.本实施例提供了一种靶向的长循环尿激酶纳米粒的制备方法，包括以下步骤：41.取100mg peg-pla、1000mg司盘80和泊洛沙姆188混合溶液溶解于5ml二氯甲烷中，得混合溶液；将1mg尿激酶溶于0.5ml去离子水中，得到内水相；将内水相加入混合溶液中，超声乳化1min后，形成初乳；将初乳倒入25ml含0.5g吐温80水溶液中，超声乳化1min后，形成第一步复乳；将第一步复乳再倒入75ml含1.5g吐温80水溶液中，超声乳化1min后，形成复乳；42.将第二步复乳倒入100ml含0.1g pva水溶液中，搅拌3～4h，以充分挥发二氯甲烷，然后高速离心15min，取沉淀，用水洗涤后再次离心，将所得沉淀物取出后。重悬于2-吗啉代乙烷磺酸溶液中，再按摩尔比为2：1加入edc和nhs，冰浴置于摇床孵育2～4h。再次进行离心洗涤，将所得沉淀物取出；所述乳化液和沉淀物的制备步骤，均在0～4℃下进行。43.将沉淀物重悬于2-吗啉代乙烷磺酸溶液中，并加入5mg的creka多肽，冰浴置于摇床孵育12h，即制得纳米粒。将制得的纳米粒离心洗涤，将所得沉淀物取出后，混悬于含有甘露醇的溶液中，放入冰箱进行冷冻，进行冷冻干燥，得到载药微囊。44.实施例445.本实施例提供了一种靶向的长循环尿激酶纳米粒的制备方法，包括以下步骤：46.取100mg peg-pla、100mg司盘80和泊洛沙姆188混合溶液溶解于5ml二氯甲烷中，得混合溶液；将1mg尿激酶溶于0.5ml去离子水中，得到内水相；将内水相加入混合溶液中，超声乳化1min后，形成初乳；将初乳倒入25ml含0.5g吐温80水溶液中，超声乳化1min后，形成第一步复乳；将第一步复乳再倒入75ml含1.5g吐温80水溶液中，超声乳化1min后，形成复乳；47.将第二步复乳倒入100ml含0.1g pva水溶液中，搅拌3～4h，以充分挥发二氯甲烷，然后高速离心15min，取沉淀，用水洗涤后再次离心，将所得沉淀物取出后。重悬于2-吗啉代乙烷磺酸溶液中，再按摩尔比为2：1加入edc和nhs，冰浴置于摇床孵育2～4h。再次进行离心洗涤，将所得沉淀物取出；所述乳化液和沉淀物的制备步骤，均在0～4℃下进行。48.将沉淀物重悬于2-吗啉代乙烷磺酸溶液中，并加入5mg的creka多肽，冰浴置于摇床孵育12h，即制得纳米粒。将制得的纳米粒离心洗涤，将所得沉淀物取出后，混悬于含有甘露醇的溶液中，放入冰箱进行冷冻，进行冷冻干燥，得到载药微囊。









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