一种RGD肽修饰的肿瘤靶向聚合物及其制备方法和应用

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术一种rgd肽修饰的肿瘤靶向聚合物及其制备方法和应用技术领域1.本发明属于纳米生物医药材料领域，涉及一种多肽修饰的肿瘤靶向递送系统及其应用，具体涉及一种含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的rgd环肽c(arg-gly-asp-d-phe-cys)与聚乙二醇-芴甲氧基羰酰基连接构成的肿瘤靶向递送系统及其应用。背景技术：2.膀胱癌是泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。临床上以手术治疗为主，辅以化疗放疗联合治疗。目前临床上膀胱癌的治疗药物仍以细胞毒类抗肿瘤药物为主，这些药物在起到治疗效果的同时也带来了严重的毒副作用。纳米给药系统已被证明可以通过改变各种抗癌药物的理化性质、药代动力学和分布特征来显著改善其体内性能。3.嵌段聚合物胶束是药剂学纳米体系研究的重要领域之一，胶束具有易于制备和小尺寸等优点。胶束可以通过epr(enhanced permeability and retention effect)，也称增强渗透滞留效应，来降低其在循环系统的消除速度，并增强其在实体瘤中的富集。目前大多数胶束系统由两个不同的域组成，一个是亲水域，另一个是疏水域，载药量仅取决于其疏水域与低水溶性药物的相互作用。这些系统虽然对高度疏水性/亲脂性药物有效，但由于药物-载体相容性有限，因此对中等疏水性的药物效果并不理想。最近的研究发现通过引入载体/药物相互作用的机制能够提高载药量和制剂稳定性。4.丝裂霉素c(mitomycin c，mmc)是由链霉菌提取的抗生素类化疗药物，化学结构具有苯醌、乙酰亚胺基及氨甲酰三个活性基团，作用与烷化剂相似，使dna解聚，与dna链形成交联，同时拮抗dna的复制。高浓度时对rna和蛋白质的合成亦有抑制作用。主要用于各种实体瘤的治疗，是临床上膀胱癌的首选药物。5.聚乙二醇－芴甲氧基羰酰基由peg亲水链段和fmoc基序组成，peg具有良好的水溶性、生物相容性、生物降解性，在科学研究中被广泛应用。9－芴基甲氧基羰基(fmoc)，一个常用于氨基酸保护的官能团，通过与药物相互作用的其他机制(例如π-π堆积和氢键相互作用)，能够显著提高药物负载能力和制剂稳定性。6.主动靶向分子主要是一类能够与受体特异性结合的分子。用特异性靶分子修饰的纳米载药系统通过受体介导的内吞作用将药物递送至膀胱肿瘤细胞，使其能够更有效地黏附于癌变的尿路上皮细胞表面，实现更精确地给药。7.rgd肽是指含有由arg-gly-asp三个氨基酸组成的序列多肽，有直线肽和环肽之分。它们是许多细胞外基质蛋白(如纤维连接蛋白、玻璃连接蛋白和层粘连蛋白等)等最小识别短肽序列。rgd肽作为肿瘤细胞表面过表达的ανβ3整合素的受体，具有显著的靶向性，在调节肿瘤生长、转移和血管生成方面发挥重要作用。研究表明rgd环肽比rgd直链肽有着更好的生物活性和更高的稳定性。技术实现要素：8.本发明采用的是结构式为cyclo(arg-gly-asp-d-phe-cys)的环肽，即c(rgdfc)。以c(rgdfc)修饰peg-fmoc，构建rgd-peg-fmoc载药系统，可包载低水溶性化药进入肿瘤部位，实现药物的靶向递送。9.本发明要解决的技术问题之一是将rgd肽作为实现靶向性的分子，将其与长循环载体材料聚乙二醇-芴甲氧基羰酰基复合，提供了一种新的、高效低毒的多功能递送载体及其制备方法与应用。10.要解决的技术问题之二是提供一种载体材料聚乙二醇-芴甲氧基羰酰基聚合物的制备方法与应用。11.为了解决上述技术问题，本发明可以通过以下技术方案来实现：12.本发明提供了一种由rgd肽修饰的聚乙二醇-芴甲氧基羰酰基聚合物，其分子式如下(ⅰ)：[0013][0014]式中，聚乙二醇的聚合度n为5～450，优选8～230，进一步优选18～115，更优选25～55，进一步更优选30～50，最优选40～45，进一步最优选45。rgd肽通过与肿瘤细胞表面过表达的ανβ3整合素特异性结合，实现膀胱癌肿瘤靶向的效果，其结构式为cyclo(arg-gly-asp-d-phe-cys)，分子式如下(ⅱ)。[0015][0016]本发明中，在聚乙二醇分子链一端通过引入氨基，与fmoc的羧基反应，先通过酯化反应生成peg-fmoc，反应式如附图1；聚乙二醇的另一端通过引入马来酰亚胺基与rgd肽上半胱氨酸的巯基反应，反应式如附图2。[0017]优选的制备方法如下：[0018](1)将fmoc-lys(boc)-oh、dmap、edci溶于无水四氢呋喃中，氮气保护下活化1h，再加入mal-peg-nh2氮气保护下反应48h。[0019](2)反应结束后，过滤并用冷的甲基叔丁基醚洗涤沉淀，真空干燥40℃至恒重得到mal-peg-fmoc粉末。[0020](3)取c(rgdfc)和mal-peg-fmoc溶于ph为8的hepes缓冲液，氮气保护下常温搅拌反应16h。[0021](4)选用截留分子量为200-5000的透析袋进行透析，优选截留分子量为2500的透析袋。去离子水中透析，透析时间为24h。[0022](5)液体冷冻干燥后得冻干粉备用，即得到rgd肽修饰的rgd肽-聚乙二醇-芴甲氧羰酰基(rgd-peg-fmoc)。[0023]其中，附图1及附图2的反应式中，mal-peg-nh2为马来酰亚胺-聚乙二醇-氨基，fmoc-lys(boc)-oh为nα-芴甲氧羰基-nε-叔丁氧羰基-l-赖氨酸，dmap为4-二甲氨基吡啶，edci为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，hepes为4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。[0024]步骤(1)中，mal-peg-nh2与fmoc-lys(boc)-oh的摩尔比为1：3-1：5，优选1：4，mal-peg-nh2/edci/dmap摩尔比为1：3-5：0.2，优选1：4：0.2，步骤(3)中mal-peg-fmoc与c(rgdfc)的摩尔比为1：1.2-1.8，优选1：1.5。[0025]本发明将连接芴甲氧基羰酰基的peg聚合物与具有肿瘤细胞表面受体高表达的rgd肽相结合，制备了具有主动靶向作用的长循环材料，可以直接或者再经过其他途径用于药物载体，基因载体等用途。[0026]本发明的另一个方面，提供了上述的rgd肽-聚乙二醇-芴甲氧基羰酰基聚合物在作为递送药物载体的应用。[0027]聚合物通过包载活性药物制成纳米制剂，用于疾病的治疗。在一个实施方案中，提供了聚合物胶束中包载的药物为丝裂霉素c，其方法步骤如下：[0028](1)称取peg-fmoc和rgd-peg-fmoc溶于5ml甲醇中，再加入丝裂霉素c，常温磁力搅拌30分钟；[0029](2)旋蒸除去溶剂，加入5ml去离子水水化30min。过0.22μm水性滤膜整合粒径即得rgd-peg-fmoc/mmc纳米胶束。[0030]其中，步骤(1)中，rgd-peg-fmoc和peg-fmoc的摩尔比为1：5，1：10，1：20，1：50；最优选为1：10；载体材料和mmc的摩尔比为0.5：1，1：1，2.5：1，最优选为2.5：1；步骤(2)中，水化时间可为15min，30min，45min，60min，最优选为30min。[0031]本发明提供的rgd肽-聚乙二醇-芴甲氧基羰酰基聚合物可作为体外递送载体的应用。其具体方法和步骤如下：[0032](1)溶血实验[0033]取c57bl/6小鼠眼眶新鲜血液，用竹签迅速搅拌除去血液中的纤维蛋白，加入0.9％生理盐水于离心机中2000rpm离心10min，如此反复直至上清液中不显红色。所得红细胞用0.9％生理盐水稀释成2％(v/v)的红细胞悬液。[0034]取纳米胶束的冻干粉末，以0.9％生理盐水分别稀释为浓度为0.10、0.25、0.5、0.75、1.0mg/ml的溶液，加入等体积红细胞混悬液，并设去离子水为阳性对照，生理盐水为阴性对照。摇匀后于37℃孵育1h，之后于2000rpm离心10min，吸取上清液在575nm处测定吸光度(a)，以计算溶血度。每组设置3个副孔。[0035]溶血度(％)＝(a样品-a阴性)/(a阳性-a阴性)×100％[0036](2)细胞增殖抑制[0037]将材料的冻干制剂用培养液稀释成预定浓度的溶液。每个浓度设6个复孔，并设对照组和调零组。将适量对数生长期的mb49细胞接种于96孔板中，继续培养24h后，介质以含有不同药物浓度的新鲜培养液替换，分别继续培养24h或48h。每孔加入含cck-8试剂20μl的培养液200μl。继续孵育2h，于450nm处测定吸收值，并以650nm为参考波长。计算细胞活力，公式如下：[0038]细胞活力(％)＝[(od实验-od调零)/(od对照-od调零)]×100％[0039](3)细胞迁移实验[0040]将处于对数期的mb49细胞以40×104个/孔的密度接种于6孔板，置于37℃，5％co2培养箱中静置培养24h。弃去旧培养液，用200μl无菌枪头垂直划痕，用pbs冲洗3次。加入含有1μg/ml mmc溶液或mmc rdg-pms的新鲜培养液，并设不含药的培养液为空白对照组，分别于0h、12h、24h置于倒置显微镜下拍照，观察各组划痕愈合情况。[0041]有益技术效果：[0042]1、本发明制备的聚合物有良好的生物相容性和血液长循环的功能，可显著降低所包载药物的毒副作用。[0043]2、本发明制备的聚合物采用具有肿瘤靶向性的rgd肽修饰peg-fmoc，能够实现肿瘤部位的靶向递送。[0044]3、本发明制备的聚合物可包载一些水溶性差的药物(如丝裂霉素c)，提高药物的溶解度和生物利用度，使其具有更好的抗肿瘤作用。附图说明[0045]图1：mal-peg-nh2和fmoc-lys(boc)-oh的反应式[0046]图2：peg-fmoc和c(rgdfc)的反应式[0047]图3：peg-fmoc的1h-nmr图谱[0048]图4：rgd-peg-fmoc的1h-nmr图谱[0049]图5：peg-fmoc的maldi-tof-ms图谱[0050]图6：rgd-peg-fmoc的maldi-tof-ms图谱[0051]图7：peg-fmoc/mmc纳米胶束的动态光散射(dls)粒径分布图[0052]图8：rgd-peg-fmoc/mmc纳米胶束的动态光散射(dls)粒径分布图[0053]图9：包载丝裂霉素c纳米胶束的透射电镜图[0054]图10：空白胶束对小鼠膀胱癌细胞mb49的增殖抑制结果图[0055]图11：包载丝裂霉素c纳米胶束对小鼠膀胱癌细胞mb49的增殖抑制结果图[0056]图12：激光共聚焦显微镜观察香豆素6纳米胶束入胞情况[0057]图13：包载丝裂霉素c纳米胶束对小鼠膀胱癌细胞mb49的迁移能力结果图具体实施方式[0058]实施例1：peg-fmoc的合成[0059]称取93.7mgfmoc-lys(boc)-oh，1.2mgdmap，38.3mgedci溶于5ml无水四氢呋喃中，氮气保护下活化1h，再加入100mgmal-peg-nh2氮气保护下反应48h。反应结束后，过滤并用冷的甲基叔丁基醚洗涤沉淀，真空干燥40℃至恒重得到peg-fmoc粉末。[0060]实施例2：rgd-peg-fmoc的合成[0061]称取50mg peg-fmoc、20mg c(rgdfc)于10mlph为8的hepes缓冲液中，氮气保护下室温搅拌反应16h，反应式如图2。反应结束后，装入截留分子量为2500的透析袋去离子水中透析24h。液体冷冻干燥得rgd-peg-fmoc粉末。[0062]取干燥peg-fmoc、rgd-peg-fmoc粉末溶于cdcl3，采用400mhz的核磁共振氢谱(1h-nmr)仪进行结构确认，结果如图3，4。peg-fmoc的1h-nmr如图3所示，peg的质子峰出现在3.5-3.8ppm，fmoc的质子峰出现在7.2-7.8ppm，证明了peg-fmoc的成功合成。rgd-peg-fmoc的1h-nmr如图4，图中马来酰亚胺的6.7ppm的质子峰消失，说明马来酰亚胺和巯基成功反应合成了rgd-peg-fmoc。[0063]基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(maldi-tof-ms)用于检测peg-fmoc、rgd-peg-fmoc的分子量，结果如图5，6。peg-fmoc的分子量为2634da，rgd-peg-fmoc分子量为2958da，与理论值相符，证明成功合成了peg-fmoc、rgd-peg-fmoc。[0064]实施例3：聚合物包载丝裂霉素c纳米胶束的制备[0065]称取10μmolpeg-fmoc(9μmolpeg-fmoc和1μmolrgd-peg-fmoc)溶于5ml甲醇中，再加入10μmol丝裂霉素c，常温磁力搅拌30分钟，旋蒸除去溶剂，加入5ml去离子水水化30min。过0.22μm微孔滤膜整合粒径即得peg-fmoc/mmc pms和rgd-peg-fmoc/mmc pms。马尔文纳米粒度仪测定胶束粒径。[0066]peg-fmoc/mmc pms粒径分布图如图7，粒径为125.2nm，pdi为0.159。[0067]rgd-peg-fmoc/mmc pms粒径分布图如图8。粒径为105.1nm，pdi为0.129。[0068]通过透射电镜观察peg-fmoc/mmc pms和peg-fmoc-rgd/mmc pms的形态，结果如图9所示。透射电镜结果表明peg-fmoc/mmc pms和peg-fmoc-rgd/mmc pms在电镜视野下均呈球形，颗粒较圆整，大小均匀，粒径与马尔文粒度仪测出的结果相一致。[0069]实施例4：包载丝裂霉素c纳米胶束的溶血实验[0070]取c57bl小黑鼠眼眶新鲜血液，用竹签迅速搅拌除去血液中的纤维蛋白，加入0.9％生理盐水于离心机中2000rpm离心10min，如此反复直至上清液中不显红色。所得红细胞用0.9％生理盐水稀释成2％(v/v)的红细胞悬液。[0071]取纳米胶束的冻干粉末，以0.9％生理盐水分别稀释为浓度为0.1、0.25、0.5、0.75、1.0mg/ml的溶液，加入等体积红细胞混悬液，并设去离子水为阳性对照，生理盐水为阴性对照。摇匀后于37℃孵育1h，之后于2000rpm离心10min，吸取上清液在575nm处测定吸光度(a)，以计算溶血度。每组设置3个副孔。[0072]溶血度(％)＝(a样品-a阴性)/(a阳性-a阴性)×100％[0073][0074]由表可知，mmc pms和mmc rgd-pms在丝裂霉素c浓度为0.10、0.25、0.5、0.75和1.0mg/ml时溶血度均小于5％，均不存在溶血现象，表明该胶束具有良好的安全性和生物相容性。[0075]实验例1：空白胶束细胞增殖抑制[0076]将mb49细胞以6000个/孔的密度接种于96孔板中，于37℃，5％co2条件下静置培养24h。吸去旧培养液，加入相当于mmc浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、5、10μg/ml的空白胶束，并设立对照组和调零组，继续培养24h或48h后，吸去介质，每孔加入含20μl的cck-8培养液200μl，继续孵育2h，用酶标仪测定450mm处的od值，并以650nm为参考波长。[0077]细胞活力(％)＝(od实验孔-od调零孔)/(od对照孔-od调零孔)×100％[0078]结果如图10所示，空白胶束在相对丝裂霉素c不同浓度时，细胞活力均高于80％，表明聚合物毒性较小，具有良好的安全性。[0079]实验例2：cck-8法考察丝裂霉素c纳米胶束对mb49细胞增殖抑制能力[0080]将mb49细胞以6000个/孔的密度接种于96孔板中，于37℃，5％co2条件下静置培养24h。吸去旧培养液，加入mmc浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、5、10、50μg/ml的纳米胶束，并设立对照组和调零组，继续培养24h或48h后，吸去介质，每孔加入含20μl的cck-8培养液200μl，继续孵育2h，用酶标仪测定450mm处的od值，并以650nm为参考波长。[0081]细胞活力(％)＝(od实验孔-od调零孔)/(od对照孔-od调零孔)×100％[0082]结果如图11，纳米胶束对于mb49细胞的增殖抑制具有时间依赖性和剂量依赖性，但在有无rgd肽修饰的丝裂霉素c纳米胶束组别间，并未发现对细胞增殖抑制的显著性差异。[0083]实验例3：激光共聚焦显微镜观察香豆素6纳米胶束入胞情况[0084]将mb49细胞以20×104个/ml的密度接种于底部铺有爬片的12孔板中，于37℃，5％co2条件下静置培养24h。吸去旧培养液，用冷pbs洗涤3次，加入浓度为1μg/ml的香豆素6(c6)溶液和香豆素6纳米胶束。静置培养2h后，用冷pbs洗涤3次，4％多聚甲醛固定10min，将细胞爬片取出，倒扣至滴有抗荧光衰减封片剂的载玻片上，置于激光共聚焦显微镜下观察纳米胶束入胞情况。[0085]结果如图12，将细胞与c6溶液，c6纳米胶束和c6靶向胶束共孵育2h后，c6溶液组未观察到明显的绿色荧光，表明几乎无摄取。纳米胶束组观察到明显的绿色荧光，说明胶束化的c6更容易被细胞摄取，但其摄取量并不存在显著性差异。[0086]实验例4：丝裂霉素c纳米胶束抑制mb49细胞迁移能力考察[0087]将处于对数期的mb49细胞以40×104个/孔的密度接种于6孔板，置于37℃，5％co2培养箱中静置培养24h。弃去旧培养液，用200μl无菌枪头垂直划痕，用pbs冲洗3次。加入含有1μg/ml mmc溶液或mmc rdg-pms的新鲜培养液，并设不含药的培养液为空白对照组，分别于0h、12h、24h置于倒置显微镜下拍照，观察各组划痕愈合情况。[0088]结果如图13，与mmc共孵育的组别，划痕处的细胞生长缓慢，且在划痕边缘出现死细胞，划痕依然清晰可见，而对照组的划痕逐渐愈合。在孵育24h后，划痕的宽度由宽到窄的顺序为mmc靶向纳米胶束》mmc溶液》对照组。这些结果表明，mmc可以有效地抑制mb49细胞的划痕愈合和生长迁移，并且胶束化的mmc可更多地被mb49细胞摄取，从而抑制细胞生长。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!