一种适用于多位点新型冠状病毒核酸检测的假病毒阳性标准品

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种适用于多位点新型 冠状病毒核酸检测的假病毒阳性标准品。背景技术：2.新型冠状病毒即sars-cov-2，能引起严重急性呼吸感染，其早 期症状同普通病毒感冒类似，随着病情发展，病人会出现呼吸困难、 胸闷、甚至呼吸窘迫症状，通过医学影像学检查可见肺部有多发磨玻 璃影，严重者可出现肺实变。3.sars-cov-2作为一种新型冠状病毒，是一类具有囊膜、基因组 为线性单股正链的rna病毒，该病毒采集自不同地区患者的病毒样 本相关序列也已发布至国家生物信息中心的2019新型冠状病毒信息 库(https://bigd.big.ac.cn/ncov)。4.ncbi收录序列为nc_045512.2，全长29903bp。将序列与sars 比对，发现有88％的相似性。因此，针对新型冠状病毒sars-cov-2 的核酸诊断开发尤为重要，为了满足临床诊断的需要，截止目前，国 家已经紧急批准了数十款核酸检测试剂盒上市，用于临床诊断，这些 试剂盒大部分都是采用rt-pcr的方法，上市后的临床检测结果反馈 显示，多数试剂盒产品存在较高比例的假阴性问题。试剂盒的检测限 问题，是造成假阴性的最大根源，因此针对诊断产品的检测限，需要 认真做每款试剂盒的性能评价。以往针对检测限的性能评价，一般是 选择体外合成的rna或者临床阳性病毒来作为标准品，用于性能评 价。但是两者都具有很明显的确定，首先体外合成的rna，一般是 很纯，单一，不涉及提取，不符合临床病毒的微环境，因此必然造成 检测灵敏度被高估，这也是存在高概率假阴性的主要原因；再次临床 阳性病毒，即使是灭活的病毒，也是存在很大的生物安全隐患，因此 要求实验室级别为p3-p4，大部分开发诊断试剂盒单位都不满足该要 求，另外临床阳性病毒也是来源很有限，不能被稳定供应，反复用于 试剂盒的性能评价。5.因此，有病毒的完整包膜结构，有新型冠状病毒sars-cov-2对 应的核酸序列，非常适合用于核酸诊断新型冠状病毒sars-cov-2。6.现有技术中cn202010172424.1专利文献涉及一种用于核酸诊断 新型冠状病毒2019-ncov的假病毒标准品及其应用，其假病毒标准 品包裹的基因包括新型冠状病毒sars-cov-2基因rdrp、gene e和 gene n中的一种或多种，其质粒是将合成后基因插入 pcblvx-puro载体中构建而成。现有技术中cn202010579907.3专 利文献涉及一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质及其制备方 法，其假病毒标准品包裹的基因包括新型冠状病毒sars-cov-2靶标 基因orf1ab、n基因和e基因，其质粒是将合成后基因插入慢病毒 质粒plenti-puro载体而成。7.上述现有技术中的两种技术方案的新型冠状病毒标准品均覆盖了 新型冠状病毒sars-cov-2靶标基因orf1ab、n基因和e基因，但 是对于近期在英国出现的病毒变异株的s蛋白基因变异并未涉及；所 以有必要针对新增加的新型冠状病毒sars-cov-2靶标基因s基因也 设计进入阳性标准品中，保证目前主流新冠核酸检测结果及新型变异 株检测结果的准确性。另外，目前市面上的新型冠状病毒标准品产品 还很少，竞争性产品不多，造成产品价格较高，不利于试剂盒生产厂 家将更具性价比的标准品添加到试剂盒中，从而不利于新冠核酸检测 结果准确性的保证。技术实现要素：8.为了解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供的技术方 案可实现较低生产成本的基础上大量提供稳定性高、特异性好、可重 复性好的新型冠状病毒sars-cov-2阳性标准品，并且该标准品不仅 覆盖了sars-cov-2主流靶标基因orf1ab、n基因和e基因，还覆 盖了英国变异病毒株的s蛋白基因。9.本发明提供一种适用于多位点新型冠状病毒核酸检测的假病毒 阳性标准品，所述阳性标准品以慢病毒为载体，所述慢病毒载体上覆 盖有用于新型冠状病毒sars-cov-2核酸检测的靶标基因，所述靶标 基因为orf1ab基因、n基因、e基因和s基因。10.优选地，所述慢病毒载体为pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp+puro载 体，通过全基因组合成的方法，将新型冠状病毒的orf1ab基因、n 基因、e基因和s基因片段合成到该载体上。11.优选地，其制备过程包括：靶标基因合成、合成后的靶标基因分 别载入慢病毒载体、及假病毒包装等步骤。12.优选地，所述靶标基因合成的方法为：针对新型冠状病毒 sars-cov-2基因组中开放读码框orf1ab、核壳蛋白n基因、包膜 蛋白e基因、刺突糖蛋白s基因序列进行修改，使其在5'端和3'端 包含随机的终止密码子；其中，orf1ab基因覆盖检测区全长，并以 打散为多段首尾叠加衔接的目的片段的形式分别进行合成。13.优选地，所述合成后的靶标基因分别载入慢病毒载体的方法为： 将靶标基因分别反向克隆到慢病毒载体 pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp+puro中的puromycin抗性基因上游的多 克隆位点，同时替换慢病毒质粒载体上的cmv启动子。14.优选地，所述假病毒包装的方法为：使用脂质体2000将慢病毒 载体转染hek293t细胞，将pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp+puro-gp1ꢀ‑10慢病毒颗粒在培养皿中和表达病毒结构蛋白的辅助质粒混合 pvsvg蛋白及pspax2蛋白，室温孵育后转染optimem培养基中的 hek293t细胞，实现靶标基因片段的转录、病毒外壳蛋白的表达和 病毒组装，组装好的病毒分泌胞外。15.相较于现有技术，本发明提供的用于新型冠状病毒核酸检测的阳 性标准品具有以下有益效果：16.一、本发明构建的新型冠状病毒sars-cov-2阳性标准品能够较 低成本的基础上大量生产，具有稳定性高、特异性好、可重复性好的 优点，并且该标准品不仅覆盖了sars-cov-2主流靶标基因orf1ab、 n基因和e基因，还覆盖了英国变异病毒株的s蛋白基因。17.二、新型冠状病毒sars-cov-2病毒阳性标准品制备的难点还在 于orf1ab基因覆盖检测区有两万多个碱基，现有技术解决方案只选 取其中的少数几处热点片段，且不同的技术平台可能需要配对互补的 区域存在不同，存在标准品无法检测出非覆盖片段的变异、和满足不 同技术平台技术要求的问题，；如果全序列直接选取，则存在假病毒 具有致病性的风险。18.本发明创造地将orf1ab基因全序列打散为10段首位叠加衔接 的目的片段，巧妙地实现了假病毒对sars-cov-2病毒全长检测区模 拟序列的覆盖，完美的模拟出了接近真实病毒的核酸序列及完整包膜 结构，且无致病性，并满足生物安全级别。19.三、实验数据表明，rt-pcr标准曲线具有较高的扩增效率和良 好的线性关系，以及熔解曲线分析提示，该标准品具有较好的 sars-cov-2病毒特异性；该标准品具有较大的检测范围，每个稀释 梯度pcr可检测到50个拷贝的重组质粒，具有较高的灵敏度；独立 实验的变异系数提示质粒标准品具有较高的稳定性和重复性。另外， 实验证明，以本发明构建的pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp+puro质粒为 标准品建立的实时荧光定量pcr方法可以对新冠核酸检测样本中的 新型冠状病毒sars-cov-2载量进行绝对值定量，能够动态连续反映 样本中病毒拷贝数量，保证新冠核酸检测结果的准确性。20.四、本发明构建的新型冠状病毒sars-cov-2阳性标准品，必将 符合国内外巨大的市场需求，比现有技术中的标准品更具优势，且生 产成本更低，并可有效地评估临床核酸诊断试剂盒的性能，指导临床 核酸检测的结果。附图说明21.图1为本发明构建的新型冠状病毒重组质粒pcdh-cmv-mcs‑ꢀef1-gfp+puro载体图谱。22.图2为本发明的新型冠状病毒基因组中开放读码框orf1ab基因 全序列打散为10段首位叠加衔接的目的片段的示意图。23.图3为本发明构建的新型冠状病毒阳性标准品的sanger测序验 证图谱。24.图4为本发明构建的新型冠状病毒阳性标准品的慢病毒包装验 证图。25.图5经10-3～10-10梯度稀释后进行荧光定量pcr扩增建立的标 准曲线。26.图6为按照标准曲线测定的荧光定量pcr不同循环数扩增曲线。27.图7为不同引物浓度的扩增产物熔解曲线。具体实施方式28.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合 附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所 描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。29.实施例1、用于新型冠状病毒核酸检测的阳性标准品的制备方法 及假病毒包装等步骤30.一、新型冠状病毒靶标基因合成及慢病毒载体构建31.新型冠状病毒sars-cov-2核苷酸序列来自ncbi genbank登录 号nc_045512.2。针对新型冠状病毒sars-cov-2基因组中开放读码 框orf1ab基因、核壳蛋白n基因、包膜蛋白e基因、刺突糖蛋白s 基因序列(本案中所涉及sars-cov-2序列信息请参见国家生物信息 中心网站网址：https://bigd.big.ac.cn/ncov/；其中新型冠状病毒英国变 异vui‑ꢀ202012/01序列信息请参见国家生物信息中心网站网址中的 https://bigd.big.ac.cn/ncov/variation/annotation/variant/23063。)进行修 改，使其在5'端和3'端包含随机的终止密码子；其中，orf1ab基因 覆盖检测区全长，并以打散为多段首尾叠加衔接的目的片段的形式分 别进行合成。采用genbuildertm高效无缝克隆试剂盒，将靶标基因分 别反向克隆到慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp+puro(结构图 参见图1，该慢病毒载体的详细信息请参考网站网址： http://www.addgene.org/vector-database/2082/)中的puromycin抗性基 因上游的多克隆位点，同时替换慢病毒质粒载体上的cmv启动子。 本案中orf1ab基因覆盖检测区全长，并以打散为10段首尾叠加衔 接的目的片段的形式分别进行合成(参见图2)，具体如下：32.选择载体：pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp+puro(cd513b-1)33.gp1：266-2473；34.gp2：2324-4602；35.gp3：4453-6731；36.gp4：6582-8860；37.gp5：8711-10989；38.gp6：10840-13118；39.gp7：12969-15247；40.gp8：15098-17376；41.gp9：17227-19505；42.gp10：19356-21555。43.每个质粒的最终序列通过sanger测序确认载入基因序列的正确 性。将上述慢病毒质粒分别转化大肠杆菌，在lb培养基37℃、14～ 16小时过夜培养，用碱性裂解提取法分离质粒，经离子交换柱层析、 te洗脱、质粒纯化后回收慢病毒质粒并去除内毒素。对回收的质粒 进行内毒素检测，小于5eu/mg后即可作为转染级别质粒进入下步使 用。44.二、新型冠状病毒/假病毒的包装45.使用脂质体2000将慢病毒载体转染hek293t细胞，将 pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp+puro-gp1-10慢病毒颗粒在培养皿中和 表达病毒结构蛋白的辅助质粒混合pvsvg蛋白及pspax2蛋白，室 温孵育后转染optimem培养基中的hek293t细胞，实现靶标基因 片段的转录、病毒外壳蛋白的表达和病毒组装，组装好的病毒分泌胞 外。使用mycoalerttmplus支原体检测试剂盒检测定支原体，阴性 即为合格。46.具体为：hek293t细胞到6孔板，密度大约40％后，进行转染， 转染前1h，移除培养基，换入新鲜预热的optimem培养基。使用脂 质体2000进行转染，具体方法参照脂质体2000说明书。1ug pcdh‑ꢀcmv-mcs-ef1-gfp+puro-gp1-10质粒，分别与0.5ug pvsvg，和 1.5ug pspax2质粒。转染后6h，更换普通培养基培养。转染后60h， 收集培养基，3000rpm 4℃离心10min，移除细胞碎片。上清使用 0.45um滤器过滤，24,000rmp，4℃离心2h，使用普通培养基重悬并 分装冻存于-80℃。参见图4，显示hek293t细胞包装慢病毒时，gfp 绿色荧光(图4中右侧)显示转染成功率，证明本发明的技术方案可 以成功构建出载体包装慢病毒。47.实施例2、用于新型冠状病毒核酸检测的阳性标准品的性能评价48.1)根据中国cdc推荐的针对新型冠状病毒sars-cov-2靶标 orf1ab基因和n基因引物、探针序列信息；49.根据国家生物信息中心https://bigd.big.ac.cn/ncov/，以及新冠病 毒英国变异vui-202012/01序列https://bigd.big.ac.cn/ncov/variation/ annotation/variant/23063，靶标e基因和s基因序列信息；50.进行新型冠状病毒sars-cov-2引物及探针合成，具体如下：51.orf1ab-f：5’‑ccctgtgggttttacacttaa-3’；52.orf1ab-r：5’‑acgattgtgcatcagctga-3’；53.orf1ab-p：5’‑ccgtctgcggtatgtggaaaggttatgg-3’；54.n-f：5’‑ggggaacttctcctgctagaat-3’；55.n-r：5’‑cagacattttgctctcaagctg-3’；56.n-p：5’‑ttgctgctgcttgacagatt-3’。57.e-f：5’‑acaggtacgttaatagttaatagcgt-3’；58.e-r：5’‑atattgcagcagtacgcacaca-3’；59.e-p：5’‑acactagccatccttactgcgcttcg-3’。60.s-f：5’‑ttgtgcccttttggtgaagt-3’；61.s-r：5’‑taggacagaataatcagcaacaca-3’；62.s-p：5’‑ccaccagatttgcatctgtttatgcttg-3’。63.2)使用试剂盒提取假病毒中的rna，在bio-rad qx200上开展 拷贝数定量，其中配置pcr反应液及设置pcr反应体系等步骤均遵 从本领域现有技术中的相关规定。64.3)检测结果表明，本发明所构建的模拟sars-cov-2的病毒核 酸、包膜结构，利用cdc和现有技术设计的引物、探针的检测体系， 对假病毒的靶标基因拷贝数开展绝对定量，均能检测出符合标准拷贝 数的目的基因片段orf1ab基因、n基因、e基因和s基因(参见图 3)。65.另外参见图5-7，其中图5为本发明构建的新型冠状病毒重组质 粒经10-3～10-10梯度稀释后进行荧光定量pcr扩增建立的标准曲 线；图6为按照标准曲线测定的荧光定量pcr不同循环数的扩增曲 线；图7为不同引物浓度的扩增产物熔解曲线。66.上述实验数据表明，rt-pcr标准曲线具有较高的扩增效率和良 好的线性关系，以及熔解曲线分析提示，该标准品具有较好的 sars-cov-2病毒特异性；该标准品具有较大的检测范围，每个稀释 梯度pcr可检测到50个拷贝的重组质粒，具有较高的灵敏度；独立 实验的变异系数提示质粒标准品具有较高的稳定性和重复性。另外， 实验证明，以本发明构建的pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp+puro质粒为 标准品建立的实时荧光定量pcr方法可以对新冠核酸检测样本中的 新型冠状病毒sars-cov-2载量进行绝对值定量，能够动态连续反映 样本中病毒拷贝数量，保证新冠核酸检测结果的准确性。67.4)最后，为了评价该适用于多位点新型冠状病毒核酸检测的假 病毒阳性标准品的临床性能，我们还在广东地区19家实验室展开了 临床室间质评(省级医院包括中山大学附属第一医院、中山大学附属 第三医院、广东省第二中医院黄埔医院、广东省中医院大学城、广东 省第二人民医院；市级医院包括广州市第八人民医院、佛山市第一人 民医院、佛山市第二人民医院、佛山市第四人民医院、广州红十字会 医院、广州市胸科医院、佛山市中医院；区县级医院包括广州中医药 大学顺德医院、顺德区妇幼保健院、广东省人民医院南海医院、南方 医科大学南海医院、南方医科大学顺德医院、顺德区疾控中心、佛山 市南海区黄岐医院)，如下表所示。68.新型冠状病毒阳性标准品室间质评多中心结果反馈表69.[0070][0071]结果分析显示，该阳性标准品在19家实验室均能成功被扩增， 不同实验室覆盖的核酸检测产品有迈克生物、上海之江、达安基因、 达安基因(快速试剂)、武汉明德生物科技有限公司、上海伯杰、圣 湘生物其中产品试剂盒，说明该试剂具有良好的检测线，能满足不同 厂家的不同位点检测要求；其中相同试剂盒的室间质评反馈的结果相 近，说明该产品性能稳定，具有临床应用的价值。[0072]综上所述，本发明构建的新型冠状病毒sars-cov-2阳性标准品 能够较低成本的基础上大量生产，具有稳定性高、特异性好、可重复 性好的优点，并且该标准品不仅覆盖了sars-cov-2主流靶标基因 orf1ab、n基因和e基因，还覆盖了英国变异病毒株的s蛋白基因。[0073]此外，sars-cov-2病毒阳性标准品制备的难点还在于orf1ab 基因覆盖检测区有两万多个碱基，现有技术解决方案只选取其中的少 数几处热点片段，且不同的技术平台可能需要配对互补的区域存在不 同，存在标准品无法检测出非覆盖片段的变异、和满足不同技术平台 技术要求的问题，；如果全序列直接选取，则存在假病毒具有致病性 的风险。[0074]本发明创造地将orf1ab基因全序列打散为10段首位叠加衔接 的目的片段，巧妙地实现了假病毒对sars-cov-2病毒全长检测区模 拟序列的覆盖，完美的模拟出了接近真实病毒的核酸序列及完整包膜 结构，且无致病性，并满足生物安全级别。[0075]另外，本发明构建的新型冠状病毒sars-cov-2阳性标准品，必 将符合国内外巨大的市场需求，比现有技术中的标准品更具优势，且 生产成本更低，并可有效地评估临床核酸诊断试剂盒的性能，指导临 床核酸检测的结果。[0076]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范 围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接 运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围 内。









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