一种乳头型颅咽管瘤动物模型的构建方法及应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种乳头型颅咽管瘤动物模型的构建方法及应用。背景技术：2.颅咽管瘤(craniopharyngioma，cp)是一种较为常见的颅内肿瘤，是位于鞍区或鞍旁区的生长缓慢的中枢神经系统良性肿瘤，但因手术难度极大，术后复发率高，甚至比有些恶性肿瘤的治疗效果还差，被称为“良性肿瘤，恶性病变”，其治疗已经成为神经外科领域公认的世界难题之一。3.颅咽管瘤的发病位置位于下丘脑-垂体轴，在很大程度上破坏了代谢中枢和内分泌系统，从而导致患者生长激素、促性腺激素、促甲状腺激素和促肾上腺激素等分泌异常，部分患者伴随有尿崩症、肥胖、头痛和视力障碍等症状。目前普遍比较认可的治疗手段是手术切除治疗，但手术难度很大，很难对肿瘤进行完全切除，甚至可能损伤第三脑室、下丘脑、视神经、垂体柄等关键结构，从而引起术后并发症的发生，复发率和死亡率高，术后需进行激素替代治疗。放射治疗虽然在颅咽管瘤的辅助治疗中起到一定的作用，能降低复发率，但其存在很强的副作用，不应作为常规治疗手段。颅咽管瘤尚无有效的药物治疗方案，近年来兴起的靶向治疗作为一种新型的治疗方法，在肿瘤治疗上非常有潜力，能为颅咽管瘤的治疗开辟新思路。而在靶向药物的研发过程中需要经过大量的动物实验，才能确保药物的安全性及有效性，因此作为药物研发主要制约因素的颅咽管瘤动物模型的建立对于颅咽管瘤的基础研究至关重要。4.目前临床上将颅咽管瘤分成两种类型。一种是釉质上皮型颅咽管瘤(adamantinomatous craniopharyngioma，acp)，acp在儿童中发病率较高，据报道该亚型的发病主要是由体细胞编码β-catenin的基因ctnnb1突变导致的；另一种亚型被命名为乳头型颅咽管瘤(papillary craniopharyngioma，pcp)，pcp多在成年人群中发病，据报道90％左右的pcp亚型肿瘤存在brafv600e突变，使得braf激酶激活进而促使mapk信号通路异常持续激活，从而引起肿瘤发生。5.根据现有的研究，已经存在两种acp相关的基因工程动物模型，分别是hesx1-cre::ctnnb1flox(ex3)/+和sox2-creert2::ctnnb1flox(ex3)/+小鼠品系,该acp模型能较好的模拟人类acp上ctnnb1的突变，对我们理解acp提供了重要的研究工具。然而，由于pcp发病机制尚未完全明确，关于pcp的研究非常少，仍不清楚其细胞起源，更缺乏合适的动物模型，导致pcp的药物研发受到极大限制。总体而言，基于pcp动物模型的研究仍处于空白状态。6.鉴于此，构建能够有效模拟pcp的实验动物模型将有利于揭示pcp的发生发展机制，强化临床诊断标准，并对后续分子靶向药物的筛选和开发都具有非常重要的意义。技术实现要素：7.本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示了pcp的细胞起源，即位于下丘脑-垂体轴上正中隆起(median eminence，me)中的伸展细胞(tanycytes)，它们具有引发肿瘤的恶性潜能，我们最终确认视网膜和前神经折叠同源盒转录因子rax(retina and anterior neural fold homeobox)阳性的伸展细胞(rax+tanycytes)是pcp的起源细胞，并以此为基础来构建pcp的实验动物模型，完成了本发明。8.本发明所要解决的技术问题是如何构建pcp的实验动物模型。9.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种构建乳头型颅咽管瘤动物模型的方法，所述方法包括在非人哺乳动物的伸展细胞中特异性地诱导乳头型颅咽管瘤发生，得到乳头型颅咽管瘤动物模型。10.所述伸展细胞为位于下丘脑-垂体轴上的正中隆起(median eminence，me)的一种特殊的体干细胞。所述伸展细胞为rax阳性的伸展细胞(rax+伸展细胞)。所述rax阳性的伸展细胞为含有rax(retina and anterior neural fold homeobox)的细胞或为表达rax基因的细胞。11.所述rax是视网膜和前神经折叠同源盒(retina and anterior neural fold homeobox)转录因子，特异性表达于所述伸展细胞中，是所述伸展细胞的标志物。12.上述方法中，所述在非人哺乳动物的伸展细胞中特异性地诱导乳头型颅咽管瘤发生包括特异性地在非人哺乳动物的伸展细胞中引入brafv600e突变。13.所述brafv600e突变是位于braf基因exon-15的密码子600突变，突变的后果是造成编码的缬氨酸被谷氨酸取代。14.上述方法中，所述方法利用位点特异性重组酶系统实现特异性地在非人哺乳动物的伸展细胞中引入brafv600e突变；所述位点特异性重组酶系统以rax基因启动子为启动子特异性调控表达所述位点特异性重组酶系统中的重组酶。15.上述方法中，所述在非人哺乳动物的伸展细胞中特异性地诱导乳头型颅咽管瘤发生还包括特异性地敲除所述非人哺乳动物的伸展细胞中的抑癌基因，得到乳头型颅咽管瘤动物模型。16.上述方法中，所述抑癌基因为pten基因，和/或，所述非人哺乳动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪，狗，羊，猴，兔、猫、牛、马中的任意一种。17.所述pten基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，pten)，又称为mmac1(mutated in multiple advanced cancer 1)和tep1(tgf-regulated and epithelial cell-enriched phosphatase)，定位于染色体10q23.3，由9个外显子组成，编码由403个氨基酸组成的蛋白质，具有磷酸酯酶的活性。18.上述方法中，所述方法利用所述位点特异性重组酶系统实现特异性地敲除所述非人哺乳动物的伸展细胞中的抑癌基因；所述位点特异性重组酶系统以rax基因启动子为启动子特异性调控表达所述位点特异性重组酶系统中的重组酶。19.所述rax基因启动子的一条链的核苷酸序列可为seq id no.1所示的序列。20.所述位点特异性重组酶系统选自下述任一项：21.b1)所述位点特异性重组酶系统为cre-loxp系统；22.b2)所述位点特异性重组酶系统为flp-frt系统；23.b3)所述位点特异性重组酶系统为dre-rox系统。24.所述位点特异性重组酶系统为本领域熟知，可在重组酶参与下介导特异性位点间的dna发生切除、整合或易位，可包括cre-loxp系统、flp-frt系统、dre-rox系统或其组合，其中重组发生在具有序列同源性的两个位点之间。25.上述方法中，所述方法利用诱导型的cre-loxp重组酶系统实现特异性地在非人哺乳动物的伸展细胞中引入brafv600e，和/或，所述方法利用诱导型的cre-loxp重组酶系统实现特异性地敲除所述非人哺乳动物的伸展细胞中的抑癌基因；所述诱导型的cre-loxp重组酶系统表达由cre重组酶和雌激素受体的配体结合区突变体(ert)融合而成的融合蛋白，所述融合蛋白的表达由rax基因启动子驱动。26.所述诱导型重组酶系统为cre-ert2、cre-ert或er-cre-er诱导型重组酶系统。27.所述cre-ert诱导型重组酶系统是在蛋白水平上调控基因的功能。该系统中，雌激素受体(estrogen receptor，er)的配体结合域的突变形式(ert)与cre重组酶融合，形成cre-ert。cre-ert不再与它的天然配体17β雌二醇结合，而与合成配体他莫昔芬结合。不加他莫昔芬时，cre-ert融合蛋白分布于细胞质中并结合热激蛋白如hsp90，抑制受体临近结构域的功能，使这种复合体定位于细胞质中，而不能进入核。加入他莫昔芬时，hsp90从er中转移出来，er受体转变为活性状态，暴露出er的核定位信号，在核定位信号的引导下，cre重组酶能进入核中并行使其功能。目前，新出的cre-ert2和er-cre-er是两种相较于cre-ert效率更高的融合蛋白。28.所述cre-ert2在无他莫昔芬诱导的情况下，在细胞质内处于无活性状态；当他莫昔芬诱导后，他莫昔芬的代谢产物4-oht(雌激素类似物)与ert结合，可使cre-ert2进核发挥cre重组酶活性。29.在所述重组酶系统中引入经过改造的雌激素受体的配体结合区(er)，建立在雌激素类似物他莫昔芬诱导下表达的诱导型重组酶系统，可以在特定时期诱导实现基因敲除或表达，可时间特异性的表达所述重组酶。30.上述方法中，所述方法可包括以下步骤：31.c1)将rax-creert2小鼠与brafv600e(或其纯合子brafca)小鼠进行杂交，获得名称为rax-creert2::brafv600e杂交小鼠的杂交小鼠，32.c2)将所述杂交小鼠用他莫昔芬或他莫昔芬衍生物诱导，得到名称为rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤模型的乳头型颅咽管瘤小鼠模型。33.上述方法中，所述方法还可为m1或m2：34.所述m1包括以下步骤：35.m1-1)将rax-creert2小鼠与brafv600e(或其纯合子brafca)小鼠进行杂交，获得名称为rax-creert2::brafv600e杂交小鼠的杂交小鼠，36.m1-2)将所述rax-creert2::brafv600e杂交小鼠与ptenflox/flox小鼠进行杂交，获得名称为三重杂交小鼠rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox的杂交小鼠，37.m1-3)所述三重杂交小鼠rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox用他莫昔芬或他莫昔芬衍生物诱导，得到名称为rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠肿瘤模型的乳头型颅咽管瘤小鼠模型；38.所述m2包括以下步骤：39.m2-1)将rax-creert2小鼠和ptenflox/flox小鼠进行杂交，获得名称为rax-creert2::ptenflox/flox的杂交小鼠，40.m2-2)将所述rax-creert2::ptenflox/flox杂交小鼠与brafv600e(或其纯合子brafca)小鼠进行杂交，获得名称为三重杂交小鼠rax-creert2::ptenflox/flox::brafv600e的杂交小鼠，41.m2-3)所述三重杂交小鼠rax-creert2::ptenflox/flox::brafv600e用他莫昔芬或他莫昔芬衍生物诱导，得到名称为rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠肿瘤模型的乳头型颅咽管瘤小鼠模型。42.所述方法m1或m2构建的乳头型颅咽管瘤小鼠模型的肿瘤能够侵袭到第三脑室。43.所述rax-creert2小鼠为the jackson laboratory公司产品，产品序号为025521。rax-creert2小鼠在rax启动子引导下表达他莫昔芬诱导的cre重组酶，与含有loxp序列的小鼠杂交时，他莫西芬诱导的cre介导的重组将导致后代中两个loxp位点间的片段的缺失。所述rax-creert2为杂合子小鼠，该品系纯合子小鼠致死。44.所述brafv600e小鼠来自the jackson laboratory公司的brafca小鼠，产品序号为017837，无cre重组酶时表达正常braf，cre重组酶存在时介导重组产生brafv600e等位基因，该等位基因表达构成活性的brafv600e突变蛋白。所述brafca是一个敲入的人类braf等位基因，在cre重组酶暴露前表达正常braf。所述brafca小鼠为cre重组酶诱导后表达构成活性的brafv600e突变蛋白的纯合子小鼠，所述brafv600e小鼠为cre重组酶诱导后表达活性的brafv600e突变蛋白的杂合子小鼠，可以通过将纯合子brafca小鼠与c57bl/6j杂交得到，也可以通过与表达正常braf的其他小鼠品系杂交得到。45.所述ptenflox/flox小鼠为the jackson laboratory公司的ptenflox小鼠，产品序号为006440，是在目标基因的第五个外显子两侧存在loxp位点，在cre重组酶存在时能敲除两个位点之间的dna片段。所述ptenflox/flox小鼠为纯合子小鼠。46.所述他莫昔芬衍生物是具有与他莫昔芬相同功能的化合物。47.本发明还提供了下述任一种应用：48.p1、rax-creert2小鼠和brafv600e小鼠在构建乳头型颅咽管瘤动物模型中的应用。49.p2、rax-creert2小鼠、brafv600e小鼠和ptenflox/flox小鼠在构建乳头型颅咽管瘤动物模型中的应用。50.p3、由上述方法构建的乳头型颅咽管瘤动物模型在制备筛选抗乳头型颅咽管瘤药物的产品中的应用。51.本发明主要利用cre/loxp重组酶系统。cre重组酶是一种位点特异性重组酶，能介导两个loxp位点之间的特异性重组，使loxp位点间的基因序列被删除或重组。loxp序列具有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了loxp的方向。如果两个loxp位点位于一条dna链上，且方向相同，cre重组酶能有效切除两个loxp位点间的序列，从而实现基因敲除。52.本发明的有益效果在于：53.首次揭示了pcp的起源细胞，并以此为基础来构建pcp的实验动物模型，所构建的rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤模型及rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠肿瘤模型在病理特征、影像学特征和代谢及内分泌特征上与临床病人非常相似，能有效可靠地作为乳头型颅咽管瘤的动物模型，为后续的研究奠定坚实的基础。附图说明54.图1为brafv600e的突变刺激rax+伸展细胞的激活示意图。图1中a为在伸展细胞中诱导brafv600e突变的实验策略。图1中b为对野生型和突变型小鼠me中细胞增殖的检测。图1中c展示了me中ez区和sez区都出现了大量的增殖。图1中d为rax-creert2::brafv600e小鼠me的免疫荧光染色代表图。图1中e为me中不同细胞的增殖统计。图1中f为野生型和突变型小鼠me的sox2和olig2免疫荧光染色。55.图2为rax+伸展细胞可能是颅咽管瘤的细胞起源示意图。图2中a为对照小鼠与rax-creert2::brafv600e小鼠me的h&e染色。图2中b展示了肿瘤诱导小鼠的me的长度和高度都明显增加。图2中c展示了肿瘤起源于rax阳性的伸展细胞。图2中d-e为rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤的分子特征分析，使用sox2、olig2、cc1和s100β及edu进行免疫荧光染色。图2中f为诱导肿瘤后，观察me肿瘤区和非肿瘤区不同细胞标记基因的细胞增殖。图2中g为产生的肿瘤向周围浸润。56.图3为rax-creert2::brafv600e小鼠中肿瘤组织的转录组测序(bulk rna-seq)。图3中a-d为正常组织和肿瘤组织中的差异基因表达。图3中e-f为基因网络分析解析了肿瘤发生中上调以及下调的基因。57.图4为小鼠肿瘤的影像学特征及病理学特征示意图。图4中a-c为野生型c57bl/6对照小鼠，rax-creert2::brafv600e肿瘤小鼠及rax-creert2::brafv600e::ptenf/f肿瘤小鼠的冠状面mri图像。图4中d-e为rax-creert2::brafv600e肿瘤及rax-creert2::brafv600e::ptenf/f肿瘤的h&e染色图像。(其中ptenf/f表示ptenflox/flox。)58.图中，对照组表示c57bl/6小鼠，是野生型对照小鼠；rax-creert2::brafv600e表示rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤模型，rax-creert2::brafv600e::ptenf/f表示rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠肿瘤模型。59.图5为肿瘤小鼠的内分泌表型及代谢表型检测结果图。图5中a-d为对照小鼠，rax-creert2::brafv600e肿瘤小鼠及rax-creert2::brafv600e::ptenf/f肿瘤小鼠的24h尿量、饮水量的检测。图5中e为对照小鼠与肿瘤小鼠抗利尿激素(avp)水平的检测。图5中f-i为对照小鼠与肿瘤小鼠体脂及瘦体重的检测。图5中j为对照小鼠与肿瘤小鼠能量消耗的检测。图5中k-n为对照小鼠与肿瘤小鼠的血糖耐受(gtt)和胰岛素耐受检测(itt)。60.图中，对照组表示同窝出生的brafv600e或brafv600e::ptenflox/flox小鼠(不存在cre重组酶诱导，不能表达活性brafv600e蛋白)，是对照小鼠；rax-creert2::brafv600e表示rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤模型，rax-creert2::brafv600e::ptenf/f表示rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠肿瘤模型，以上两种都为肿瘤小鼠。具体实施方式61.下述实施例中的brafv600e小鼠来自the jackson laboratory公司的brafca小鼠，产品序号为017837，无cre重组酶时表达正常braf，cre重组酶存在时介导重组产生brafv600e等位基因，该等位基因表达构成活性的brafv600e突变蛋白。所述brafca是一个敲入的人类braf等位基因，在cre重组酶暴露前表达正常braf。所述brafca小鼠为cre重组酶诱导后表达构成活性的brafv600e突变蛋白的纯合子小鼠，所述brafv600e小鼠为cre重组酶诱导后表达活性的brafv600e突变蛋白的杂合子小鼠，可以通过将纯合子brafca小鼠与c57bl/6j杂交得到，也可以通过与表达正常braf的其他小鼠品系杂交得到。62.下述实施例中的rax-creert2小鼠为the jackson laboratory公司产品，产品序号为025521。rax-creert2小鼠在rax启动子引导下表达他莫昔芬诱导的cre重组酶，与含有loxp序列的小鼠杂交时，他莫西芬诱导的cre介导的重组将导致后代中两个loxp位点间的片段的缺失。所述rax-creert2为杂合子小鼠，该品系纯合子小鼠致死。63.下述实施例中的ptenflox/flox为the jackson laboratory公司的ptenflox小鼠，产品序号为006440，是在目标基因的第五个外显子两侧存在loxp位点，在cre重组酶存在时能敲除两个位点之间的dna片段。所述ptenflox/flox小鼠为纯合子小鼠。64.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。65.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。66.下面对本发明实施例的乳头型颅咽管瘤动物模型的构建方法以及应用进行具体说明。67.1、基因工程实验动物的选择68.为了能进行实现时间特异性的肿瘤诱导，诱导型的cre-loxp重组酶系统被使用在模型构建中。cre-loxp重组是一种特定位点的重组酶技术，可在dna的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位，用该系统可以针对特定的细胞类型或采用特定的外部刺激，对细胞中dna进行修改。cre-ert2小鼠是一类含有雌激素受体(estrogen receptor，er)的配体结合区突变体(ert)与cre重组酶的融合蛋白表达的小鼠。cre-ert2在他莫昔芬的诱导后，他莫昔芬的代谢产物4-oht(雌激素类似物)与ert结合，可使cre-ert2进核发挥cre重组酶活性,特异性识别loxp位点，使两个loxp位点间的dna进行精确的位点特异性重组。69.在前期研究的基础上，我们知道rax是下丘脑正中隆起中伸展细胞的标志物，该细胞可能具有引发肿瘤的潜力。所以我们选取了以rax为启动子驱动cre重组酶表达的rax-creert2小鼠，该小鼠能实现伸展细胞起源的特异性的诱导。此外，在临床研究中的pcp亚型肿瘤里，存在几近100％的高概率的brafv600e突变，所以brafv600e突变的基因工程小鼠在整个模型的构建中起到决定性的作用。同时，在临床研究中，颅咽管瘤虽然是一种良性肿瘤，但有时也会出现部分肿瘤体积较大，甚至占领第三脑室的情况，我们推测其可能存在二级突变。为了能更贴切地贴合颅咽管瘤的发病特点，且构建出一个更便于观察药物治疗研究结果的的小鼠肿瘤模型，我们拟对pten基因进行进一步的突变。pten作为一种肿瘤抑制因子，其突变在脑瘤中广泛存在，当其失去功能时能够加速肿瘤的发展进程。我们选择的第三种基因工程小鼠为ptenflox/flox,其flox位点能被cre重组酶识别，使得特异性细胞内的pten基因被敲除。70.综上，rax-creert2,brafv600e(及其纯合子brafca)和ptenflox/flox 3种基因工程小鼠将被用来构建颅咽管瘤实验动物小鼠模型。71.2、基因工程实验动物构建颅咽管瘤小鼠模型72.利用3种工具小鼠进行杂交，获得rax-creert2::brafv600e及rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox的基因工程小鼠，特异性地操控小鼠第三脑室正中隆起(median eminence,me)的伸展细胞(tanycytes)，并引入brafv600e和pten的突变，可以通过他莫昔芬(tamoxifen)进行时间特异性的诱导，通过他莫昔芬(tamoxifen)注射诱导肿瘤形成，从而构建pcp小鼠模型。我们将从各方面评估构建出的肿瘤小鼠模型模拟人颅咽管瘤的能力，包括病理特征、分子特征、代谢特征以及内分泌特征等。73.3、颅咽管瘤小鼠模型的病理特征及分子特征分析74.rax-creert2::brafv600e及rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox的基因工程小鼠在他莫昔芬诱导后2个月，牺牲小鼠获取其脑组织，随后进行固定及蔗糖梯度脱水，组织包埋剂包埋后进行连续冰冻切片。对肿瘤组织的切片分析主要有两方面内容：一方面使用h&e染色来观察肿瘤及其病理特征，另一方面解析肿瘤的分子特征情况，在牺牲小鼠前注射edu可标记其增殖的细胞，并利用抗体进行免疫组化染色。干细胞标志物sox2，少突胶质细胞标志物olig2，星形胶质细胞标志物s100β和gfap等被用于分析该肿瘤的分子特征。75.4、颅咽管瘤小鼠模型的表型分析76.为了深入分析颅咽管瘤小鼠模型的表型，根据人颅咽管瘤发病的病理特征，重点评估小鼠的内分泌代谢表型。首先，收集24h尿量及饮水量的数据，监测肿瘤发病后是否存在多饮多尿的症状，是否有“尿崩症”的情况；第二，人类颅咽管瘤患者往往表现出垂体功能异常，提取小鼠的血清用elisa检测抗利尿激素水平是否异常。第三，由于肿瘤的发生导致下丘脑的功能异常，出现代谢紊乱综合症，通过小动物代谢检测系统(phenomaster system，tse)和小动物身体成分分析仪(echomri)来检测肿瘤发生小鼠的脂肪含量、瘦体重和能量消耗，以及通过血糖等指标来评价肿瘤模型。通过以上表型的分析，验证肿瘤小鼠模型模拟人颅咽管瘤的能力，构建颅咽管瘤实验动物模型。77.以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。78.实施例1、名称为rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤模型的乳头型颅咽管瘤动物模型的构建79.1、rax-creert2::brafv600e杂交小鼠的制备80.利用rax-creert2小鼠与brafv600e(或其纯合子brafca)小鼠进行杂交，引入肿瘤常发生的brafv600e突变，将得到的杂交小鼠为命名为rax-creert2::brafv600e杂交小鼠。81.将4只60日龄的rax-creert2::brafv600e杂交小鼠(突变组)和4只同窝对照brafv600e小鼠(对照组)进行实验，每只rax-creert2::brafv600e杂交小鼠以及同窝对照brafv600e(不存在cre重组酶诱导，不能表达活性brafv600e蛋白)小鼠按照66mg他莫昔芬/kg体重的剂量，每只小鼠根据体重每天腹腔注射一次他莫西芬溶液(溶质为他莫西芬，溶剂为玉米油)，连续注射3天(记为d1、d2和d3)，第7-9天(记为d7、d8和d9)每只小鼠每天腹腔注射一次edu(溶质为edu，一种细胞增殖标记物，溶液为生理盐水)，注射量为50mg/kg体重，第10天处死小鼠。82.连续3次腹腔注射66mg/kg他莫昔芬诱导7d后，对小鼠的脑进行冰冻切片，通过edu染色可发现rax-creert2::brafv600e小鼠在正中隆起(me)区域有大量的增殖。同时进行了一些常见细胞的分子标记物的免疫荧光染色，包括干细胞标记物sox2、少突胶质细胞标记物olig2、星形胶质细胞标记物s100β以及神经元标记物neun。免疫荧光染色后对me区域细胞进行统计，发现me的细胞增殖异常显著，且大部分增殖的细胞为sox2阳性的干细胞(图1)。83.2、用他莫昔芬诱导rax-creert2::brafv600e杂交小鼠得到名称为rax-creert2::creert2::brafv600e杂交小鼠含有rax-creert2和brafv600e两种基因，通过pcr(聚合酶链式反应)对杂交小鼠进行基因型鉴定，同时存在rax-creert2和brafv600e两种基因的小鼠是我们的目标小鼠。rax-creert2的引物有以下3条:ccctgaggctaaacttgcag,aggtgtctaggatgccgtct,aggcaaattttggtgtacgg，其中突变型的条带大小为290bp,野生型的条带大小为401bp，同时带有290bp和401bp条带的杂合子小鼠为目标rax-creert2小鼠。braf基因的引物有以下2条：tgagtatttttgtggcaactgc和ctctgctgggaaagcggc。突变型条带大小为307bp，野生型条带大小为185bp，其中仅有307bp条带的纯合子小鼠为brafca小鼠，同时带有185bp和307bp条带的杂合子小鼠为目标brafv600e小鼠。以该rax-creert2::brafv600e杂交小鼠的基因组dna为模板，用上述rax-creert2的引物进行pcr扩增，扩增产物为290bp和401bp的条带；用上述braf基因的引物进行pcr扩增，扩增产物为185bp和307bp的条带。92.将60日龄的rax-creert2::brafv600e杂交小鼠，每只rax-creert2::brafv600e杂交小鼠按照66mg他莫昔芬/kg体重的剂量，每只小鼠根据体重每天腹腔注射一次他莫西芬溶液(溶质为他莫西芬，溶剂为玉米油)，连续注射2个月，得到的小鼠为名称为rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤模型，是一种pcp小鼠模型。93.2、rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠肿瘤模型的构建94.将步骤1的rax-creert2::brafv600e杂交小鼠和ptenflox/flox小鼠进行杂交，获得三重杂交小鼠rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox，将得到的杂交小鼠为命名为rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox杂交小鼠。通过pcr(聚合酶链式反应)对杂交小鼠进行基因型鉴定，同时存在rax-creert2，brafv600e和ptenflox/flox三种基因的小鼠是我们的目标rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠。rax-creert2的引物有以下3条:ccctgaggctaaacttgcag,aggtgtctaggatgccgtct,aggcaaattttggtgtacgg，其中突变型的条带大小为290bp,野生型的条带大小为401bp，同时带有290bp和401bp条带的杂合子小鼠为目标rax-creert2小鼠。braf基因的引物有以下2条：tgagtatttttgtggcaactgc和ctctgctgggaaagcggc。突变型条带大小为307bp，野生型条带大小为185bp，其中仅有307bp条带的纯合子小鼠为brafca小鼠，同时带有185bp和307bp条带的杂合子小鼠为目标brafv600e小鼠。pten基因的引物有以下两条：caagcactctgcgaactgag和aagtttttgaaggcaagatgc，突变型条带大小为328bp，野生型条带大小为156bp，其中仅有328bp条带的纯合子小鼠为目标ptenflox/flox小鼠。以该rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox杂交小鼠的基因组dna为模板，用上述rax-creert2的引物进行pcr扩增，扩增产物为290bp和401bp的条带；用上述braf基因的引物进行pcr扩增，扩增产物为185bp和307bp的条带；用上述pten基因的引物进行pcr扩增，扩增产物为328bp的条带。95.60日龄的rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox杂交小鼠，每只rax-creert2::brafv600e杂交小鼠按照66mg他莫昔芬/kg体重的剂量，每只小鼠根据体重每天腹腔注射一次他莫西芬溶液(溶质为他莫西芬，溶剂为玉米油)，连续注射2个月，得到的小鼠名称为rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠肿瘤模型，是一种pcp小鼠模型。96.3、rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤模型和名称为rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠肿瘤模型模拟pcp的发病特征97.3.1小鼠肿瘤的影像学特征及病理学特征98.以同窝brafv600e小鼠或brafv600e::ptenflox/flox小鼠(不存在cre重组酶诱导，不能表达活性brafv600e蛋白)为对照，rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤模型和rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠肿瘤模型进行mri和he染色，结果表明rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox肿瘤小鼠相比于rax-creert2::brafv600e肿瘤具有更恶性的症状，并且其肿瘤能够侵袭到第三脑室，且小鼠模型的特征与病人相似(图4)。99.3.2肿瘤小鼠的内分泌表型及代谢表型100.以同窝brafv600e小鼠或brafv600e::ptenflox/flox小鼠(不存在cre重组酶诱导，不能表达活性brafv600e蛋白)为对照，rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤模型和rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flo小鼠肿瘤模型进行下述实验。101.为了了解小鼠肿瘤模型能模拟人颅咽管瘤的发病机制的能力，根据人颅咽管瘤发病的特征，监测小鼠肿瘤模型发病的内分泌特征、代谢特征以及激素水平等。102.3.2.1尿量、饮水量的检测103.利用小动物代谢笼初步收集并统计了正常小鼠和患肿瘤小鼠24h后的尿量、饮水量，结果发现肿瘤发病小鼠的饮水量与排尿量都有显著的差异，说明该肿瘤小鼠模型有出现临床上尿崩症的特征(图5中a-d)。104.3.2.2激素水平的检测105.收集肿瘤小鼠与正常小鼠激素水平的数据。首先获取小鼠的全血，4℃放置过夜，1000×g低速离心后20分钟后可收集到血清。使用elisa(酶联免疫吸附剂测定)法对小鼠的激素水平进行检测。检测发现，抗利尿激素(avp)出现了明显的激素缺乏的现象，与临床病人的表现一致(图5中e)。106.3.2.3脂肪含量及瘦体重的检测107.初步收集并统计了正常小鼠和患肿瘤小鼠的脂肪含量差异，利用小动物身体成分分析仪(echomri)对小鼠的脂肪重量和瘦体重进行了测量，结果显示，肿瘤小鼠的脂肪重量是高于正常小鼠的，瘦体重低于正常小鼠，与临床上某些病人“肥胖”的症状类似(图5中f-i)。108.3.2.4能量消耗量的检测109.使用小动物代谢监测系统(tse systems,bad homburg,germany)对小鼠的能量消耗量进行检测。小鼠在小动物代谢监测系统中适应3天后进行检测，经过检测，我们发现肿瘤小鼠相比于对照小鼠来说，其能量消耗量有明显的降低，这为临床病人的肥胖原因提供了思路。(图5中j)。110.3.2.5血糖耐受(gtt)及胰岛素耐受的检测(itt)111.我们对肿瘤小鼠模型进行了葡萄糖耐受实验(glucose intolerance test，gtt)和胰岛素耐受实验(insulin intolerance test，gtt)。结果显示肿瘤小鼠与正常小鼠并无差异，没有检测到临床上部分病人出现糖尿病症状，可能由于检测的肿瘤小鼠数目有限，且经过统计学的分析，掩盖了部分病人存在的差异，无法检测到仅在部分人群中出现的糖尿病症状(图5中k-n)。112.综上所述，我们所构建的rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤模型及rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠肿瘤模型在病理特征、影像学特征和代谢及内分泌特征上与临床病人非常相似，能作为乳头型颅咽管瘤的动物模型，为后续的研究奠定坚实的基础。说明名称为rax-creert2::brafv600e小鼠肿瘤模型和名称为rax-creert2::brafv600e::ptenflox/flox小鼠肿瘤模型为乳头型颅咽管瘤动物模型。113.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!