一种动物脐带外泌体及其提取方法和应用与流程

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及动物脐带提取技术领域，具体的说是涉及一种动物脐带外泌体及其提取方法和应用。背景技术：2.近年来动物组织如胎盘、脐带的研究不断增多，许多动物胎盘和脐带如牛、羊、鹿、驴等的生理活性被不断发现。动物脐带提取物是来源于动物脐带的一类复合活性成分，含有丰富的氨基酸、蛋白质、卵磷脂、多糖体、维生素、矿物元素等，具有增强记忆、抗应激、调节内分泌、增强免疫力、延缓衰老等功效，根据目前相关研究报道，脐带提取物具有促进末梢血液循环、促进细胞及组织呼吸、去除自由基、保湿、免疫赋活及美颜等多种生物学作用。目前，已有多种利用脐带提取有效活性物质的专利。这些专利获取胎盘提取物的方法主要以下3种：(1)直接提取法：脐带组织经匀浆后加提取液提取，或脐带匀浆后反复冻融法提取，提取液离心、冻干即可。(2)超临界co2萃取法：脐带组织冻干、粉碎、超临界萃取后，萃取物匀浆、离心，冻干离心液。(3)酶辅助提取法：脐带经1-2种蛋白酶适度酶解后，离心、冻干离心液。这些脐带提取物的制备方法及产品存在以下缺点：(1)获得的脐带提取物以大分子蛋白为主，人体吸收效率低；(2)缺乏提取液精制工艺，产品成分复杂，品质低；(3)提取方法简单粗放，提取效率低，原料利用率低。因此，如何有效地获得动物脐带中的生物活性成分并充分发挥其功效，具有重要的科学及产业化意义。3.外泌体(exosome)是由细胞内囊泡结构释放到细胞外的一种膜性囊泡，直径约30-150nm，细胞在正常的生理状况下都会分泌外泌体，由于质膜和多泡体之间融合的结果，外泌体样囊泡通过胞吐作用被分泌到胞外空间。外泌体样囊泡被脂质双层分为内部和外部，由于其含有膜脂质、膜蛋白、遗传物质和细胞质成分，间接地反映出细胞的性质和状态。同时，外泌体样囊泡通过与其他细胞和组织的结合，并将膜成分、mrna、mirna、蛋白质(生长激素、细胞因子等)等转移至受体细胞，而作为介导细胞-细胞之间通讯的胞外运输蛋白。4.动物外泌体广泛存在于活体动物体内，动物外泌体选择性包裹脂质、蛋白质、mrna及mirna等多种生物活性物质，可以透皮吸收，被靶细胞摄取，可以明确减轻组织损伤程度、促进损伤组织形态学及功能学的修复，它可能还具有潜在的调节机体免疫、调控细胞生长分化等生物学功能。因此，建立动物脐带外泌体，尤其是牛脐带外泌体的制备工艺，可以为安全、稳定且有效的基于动物外泌体的化妆品新原料研发及产业化奠定基础。技术实现要素：5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种动物脐带外泌体及其提取方法，使得该提取工艺获得的外泌体具有较高的蛋白浓度，并具有显著的促进人皮肤成纤维细胞增殖的功效，可应用于化妆品领域。6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：7.一种动物脐带外泌体的提取方法，包括：8.步骤1、将动物脐带组织用液氮速冻，然后研磨出均匀粉状组织；9.步骤2、所述粉状组织加入缓冲液，在-80℃和室温温度下反复冻融3次；10.步骤3、将冻融后的产物超声处理；11.步骤4、超声处理后进行离心，上清液继续超声处理，然后进行过滤，获得所述外泌体。12.目前的制备工艺主要以制备脐带提取物为主，制备工艺简单粗放，提取效率低，原料利用率低，工艺稳定性差，缺乏提取液精制工艺，产品成分复杂，品质低。针对此问题，本发明通过一系列的物理手段，从动物脐带组织中提取出具有显著促进人皮肤成纤维细胞增殖和高蛋白浓度的外泌体。13.在本发明具体实施方式中，通过牛脐带组织对本发明提取方法进行相关试验；作为优选，所述冻融的时间为冷冻时间/解冻时间：2h/2h。作为优选，所述缓冲液为pbs缓冲液。14.作为优选，所述超声处理为：15.功率500w，时间30min，运行/停止时间：8s/8s。16.作为优选，所述离心采用多次转速递增的离心力离心。在本发明具体实施方式中，所述离心为：17.3000rpm离心10min，收集上清液4000rpm第二次离心15min，收集上清液10000rpm第三次离心1h。18.作为优选，所述过滤采用滤网孔径递减的多级过滤。在本发明具体实施方式中，所述过滤为：19.依次按照滤网孔径5μm、1μm、0.45μm及0.22μm进行过滤。20.与对照工艺相比，本发明的研磨环节可以能快速获得足够小的粉状结构样品，且可以获得更高蛋白浓度的外泌体，浓度在2mg/ml左右。并且通过对所制备的脐带提取物的粒径分析、电镜观察及免疫印迹分析，证实了本发明制备工艺获得的产物主要成分是外泌体，粒径集中在100nm左右。同时，通过人皮肤成纤维细胞的增殖实验表明，本发明制备的脐带外泌体具有显著的促进人皮肤成纤维细胞增殖的功效。基于此，本发明提供了由本发明所述提取方法制备获得的外泌体，以及该外泌体在制备促进人皮肤成纤维细胞增殖的产品或在制备化妆品中的应用。21.由以上技术方案可知，本发明提取方法完全采用物理提取的方法并保持整个提取过程的低温环境，避免了目前其他制备工艺引入的酶类、有机溶剂或高温等影响终产品质量和活性的不利因素；同时，本发明提取工艺结合脐带的结构特点通过冻融、超声、过滤等物理学方法逐步去除其他成分，最终获得了富含外泌体的无菌产物，并通过一系列鉴定实验及功能验证实验，充分证实了本发明已建立了稳定脐带外泌体的制备工艺。附图说明22.图1所示为牛脐带外泌体提取冻融次数对蛋白浓度的影响；***，p《0.001，****，p《0.0001；23.图2所示为牛脐带外泌体鉴定结果；a为粒径分析结果，b为电镜观察结果，c为蛋白印迹分析；24.图3所示为牛脐带外泌体细胞功效实验；nc表示阴性对照组(高糖dmem基础培养基组)，pc表示阳性对照组(高糖dmem基础培养基+10％胎牛血清)，25-100表示添加不同浓度(单位：μg/ml)的牛脐带外泌体组；****，p《0.0001(与nc相比)。具体实施方式25.本发明实施例公开了一种动物脐带外泌体及其提取方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述外泌体及其提取方法和应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的外泌体及其提取方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。26.以下就本发明所提供的一种动物脐带外泌体及其提取方法做进一步说明。27.实施例1：不同的组织研磨操作对比28.实验材料采购自广东某知名牛奶品牌奶牛养殖场健康奶牛自然分娩的牛脐带，经病毒及细菌检测合格后，用自来水反复冲洗后进行切块分装，于-80℃冷冻保存；29.根据外泌体的产量需求，称取一定质量的牛脐带，室温解冻；组织完全解冻后，用流水清洗至接近无色，之后纯水置换清洗，同时将研钵预冷；30.然后将牛脐带均分为两份，按照以下两种研磨手段处理：31.(1)将脐带组织剪碎后，放入研钵加入充足的液氮并开始进行研磨，期间不间断加入液氮保持组织冻结状态；32.(2)将脐带组织铺平放置于充满液氮的容器中速冻(5min)，然后使用研钵进一步将组织研磨，制备出均匀粉状组织；33.结果表明：第(1)中方式脐带组织难以研磨成粉，常常结块于研钵上，第(2)种方式更有利于研磨脐带组织，能快速获得足够小的粉状结构样品，本发明采用第(2)种处理方式。34.实施例2：不同的冻融条件对比35.按照实施例1中第(2)种方式获得粉状样品，均分为3份，添加相同的pbs缓冲液，按照以下3种冻融手段处理：36.(1)粉状组织不做冻融处理；37.(2)将粉状组织放置于-80℃→室温冻融1次(12h)；38.(3)将粉状组织放置于-80℃→室温反复冻融3次(冷冻时间/解冻时间：2h/2h)；39.结果表明：第(3)种冻融方式最终获得牛脐带外泌体的蛋白浓度(bca法)比第(1)及第(2)中方式高(见图1)，本发明采用第(3)种方式。40.实施例3：牛脐带提取物后处理及外泌体纯化41.将冻融后的产物超声处理(功率：500w，时间：30min，运行/停止时间：8s/8s)，进一步破碎细胞及释放脐带外泌体，收集超声产物。42.离心：将手术获得的超声产物进行两次不同转速的离心力离心(3000rpm，10min；4000rpm，15min；10000rpm，1h)，每次离心后，收集上一次离心的上清进行离心，从而充分去除滤液中的不溶性物质；43.超声处理：将上述最后一步离心获得的上清进行超声处理(功率：500w，时间：30min,运行/停止时间：8s/8s)；44.过滤：将超声处理后的产物进行多级过滤(滤网孔径为依次为5μm、1μm、0.45μm及0.22μm)后，制备获得牛脐带外泌体。45.实施例4：牛脐带外泌体鉴定46.1)蛋白浓度测试：47.利用bca法对制备的牛脐带外泌体进行蛋白浓度检测，结果显示，牛脐带外泌体的蛋白浓度为1.99±0.10mg/ml。48.2)外泌体鉴定49.通过对所获得的牛脐带提取物的粒径分析、电镜观察及免疫印迹分析，证实了本发明制备工艺获得的产物主要成分是外泌体。具体检测结果见图2。50.实施例5：牛脐带外泌体功效测试51.实验步骤如下：取生长状态良好的对数生长期人皮肤成纤维细胞，每孔按2500个细胞接种至96孔板中，每组100μl并设置3个复孔，置于细胞培养箱中，37℃，5％co2及饱和湿度条件下培养，培养24小时后吸弃培养基，按照实验组别，分别加入阴性对照培养基、阳性对照培养基及相应浓度梯度(25、50、100μg/ml)牛脐带外泌体的培养基。培养48h后，弃含药培养基，每孔加入新鲜配制的含10μl的毒性检测液cck8。置于培养箱中继续培养4h后，用酶标仪测波长为450nm的od值，取实验结果的平均值作为最终实验结果，统计分析。52.通过人皮肤成纤维细胞的增殖实验表明，本发明制备的牛脐带外泌体具有显著的促进人皮肤成纤维细胞增殖的功效(见图3)。53.以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。









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