一种双四步相移法提高空间光干涉技术精度的方法 专利技术说明

测量装置的制造及其应用技术1.本发明属于光学检测领域，具体涉及一种双四步相移法提高空间光干涉技术精度的方法。背景技术：2.由美国的g.popescu教授在2011年发明的空间光干涉技术(spatial light interference microscopy)，作为一种典型的定量位相成像技术具有相当的影响力。该技术基于泽尼克相衬显微镜，适用于生物细胞，组织，细菌等透明样本的观测。图1为空间光干涉技术光路，图2为其测量方法四步相移法使用的光栅。90年代前的工程人员及科学家对泽尼克相衬显微镜的研究主要围绕相衬衬比度的优化，位相板的尺寸，相移以及透过率都得到很好的优化。其设计前提针对弱位相(位相远小于1rad)物体成像。后来人将泽尼克相衬显微镜归类为定性测量手段。奥林巴斯相衬显微镜ix73是其中一个代表产品。g.popescu教授进一步创造性的使用四步相移法重建透明物体的位相三维轮廓，将泽尼克相衬技术改造为空间光干涉技术——一种定量位相成像技术。由于该技术相比采用激光照明的定量位相成像技术具有较高信噪比和成像的高效率，因此空间光干涉技术获得好评。但是研究发现该技术还是比较粗糙，明显存在一些问题。比如该技术提倡使用白光，但卤素灯的白光光谱偏离高斯谱较远。高斯谱的好处是其傅里叶变换仍然为高斯谱，非高斯的白光光谱将导致四步相移法计算结果偏离高斯模型而出现错误。因此，有学者在光路的照明中使用中心波长546nm的绿光滤光片以获得高斯谱照明。使用更宽带宽的白光的好处仅仅在于其相干长度变短，有利于利用相干门排除门外不在同一平面的光信号，利于将slim推广到slit即g.popescu发明的一种空间光干涉断层成像技术。3.关键还在于，有学者由部分相干理论出发发现g.popescu的空间光干涉技术的测量精度与理论计算上还存在一个较大问题。传统的空间光干涉技术的专利与论文多把四步相移法这一光学干涉技术本身提供的精度误认为是空间光干涉技术的精度。而这个精度是四步相移法作为光学干涉技术本身的精度。空间光干涉技术的系统误差实际上主要来源于不是平面波的直射光(或参考光)的角度。使用落射照明方法的基于泽尼克相衬显微镜不能像激光照明一样做针孔滤波，因此空间光干涉技术远远不能将参考光的角度压缩到0。4.g.popescu空间光干涉技术的论文或专利的计算模型较为简单，主要含以下式子：[0005][0006][0007]φslim＝angle((i0-i2)+j(i3-i1))[0008]φo(x)＝φpop(x)+φr(x),φslim(x)＝φh(x)-φr(x)[0009]同时，用复矢量可表示物光，散射光和直射光的三者关系如图3。由图3可知，参考光或直射光的角度被默认为0，这是问题的根源。[0010]以6微米物镜油浸的聚苯乙烯微球为例，其最大位相高度为274.5°。依据部分相干光理论可以模拟奥林巴斯相衬显微镜ix73使用20倍相衬物镜对油浸微球进行空间光干涉可得图4模拟结果。图中highpass曲线表示系统高通或带通滤波的散射光的角度即φh，散射光的光线穿过物镜后瞳位相板之外的部分。ref曲线即直射光的角度。直射光的光线穿过物镜后瞳位相板。图4可见微球的参考光角度有一个分布，其中心处约为-29°。图中各曲线的最高点分别为：[0011]φreal＝274.5°,φslim＝293.5°,φpop＝310°,φr＝29°[0012]依据popescu理论模型得到的角度φpop比φreal高出了36°(理论值应为29°，位相环模拟边缘采样误差导致模拟结果为36°)。在未对系统进行进一步优化情形下，四步相移法的位相测量精度依据公式σφ＝σn/4usud很容易达到0.5°，对应0.76nm的光程差精度。即popescu计算结果的误差远远大于四步相移法的精度0.5°。可见在奥林巴斯相衬显微镜的标准配置下，参考光的角度导致空间光干涉技术的实际测量结果的准确性或精度表现远远弱于四步相移法的精度，并成为空间光干涉技术的系统误差的主要来源。[0013]此外，定量位相成像技术大致由2000年开始发展，到现在依然没有很好的产品能为市场所普遍接受。比如tie技术也仍有20％的相对误差。使用激光的定量位相成像技术尽管通过旋转物体或照明可以测量样本的三维折射率，但由于激光散斑导致其成像信噪比很低，进而使其成像速度实际效率低下。相比之下部分相干照明的空间光干涉技术具有高信噪比成像和四步相移法的成像快速的特点，因此在popescu的空间光干涉技术的基础上进一步提高其准确度或精度有较大现实意义。技术实现要素：[0014]本发明的目的在于提供一种双四步相移法提高空间光干涉技术精度的方法，该方法有利于提高空间光干涉法的精度。[0015]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种双四步相移法提高空间光干涉技术精度的方法，利用部分相干光理论得到泽尼克相衬显微镜成像模型：[0016][0017]其中，ii(x)为第i次相衬成像的强度；x为空间坐标；id(x)为直射光或参考光的强度；is(x)是散射光的强度；f(μ)为物光的空间频率分布；hs(ξ)为光源的光阑，hl(μ)为位相环的光阑；hh(μ)为除去hl(μ)外的光阑；t为位相板的透过率；δφ为四步相移法的调制角度；re为取实部运算。[0018]进一步地，计算模型采用pc-slim模型，其为基于部分相干光理论研究空间光干涉技术得到的计算模型，主要包含以下式子：[0019][0020]a(x)＝(i1+i3)/2+δn＝(i0+i2)/2+δn[0021][0022]φslim(x)＝angle((i0-i2)+j(i3-i1))[0023]φo(x)＝φslim(x)+φr(x),φpop(x)＝φh(x)-φr(x)[0024][0025]其中，in(x)为四步相移法所得的相衬像的强度，a(x)＝is(x)+id(x)；δ(x)为泽尼克相衬显微镜的交叉传递函数(tcc)做近似处理得到的一个受调制的强度项；δn为cmos或ccd的噪声；f(x)为物体的复透过率；式中φslim为四步相移法的角度测量结果；hs(x)＝f-1(hs(μ))；hh(x)＝f-1(hh(μ))；hl(x)＝f-1(hl(μ))；φo为物体的复波前的位相角；φr为参考光的波前角度；φpop为slim技术重建的位相角度，φh为散射光的波前角度；uo＝|uo|；[0026]进一步地，做2次四步相移法，即成8次像；第一次的四步相移法采用现有的四步相移法测量物体位相；第二次的四步相移法在slm上叠加使用马赛克光栅或者闪耀光栅等分光光栅改变系统的交叉传递函数tcc以测量物体位相；两次测量中散射光的角度不变，但是第二次的四步相移法的参考光角度大大小于第一次，通过下式计算位相：[0027]δφr＝δφslim＝φslim1-φslim2[0028]φd4＝φpop1-δφr[0029]其中，φslim1为第一次四步相移法的测量结果，φslim2为第二次四步相移法的测量结果，δφr为两次测量的参考光角度变化，φd4为采用双四步相移法的slim技术的最后计算结果。[0030]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种双四步相移法提高空间光干涉技术精度的方法，该方法可将系统误差消减一半以上，大大提高了空间光干涉法的精度。附图说明[0031]图1是传统空间光干涉显微技术光路。[0032]图2是传统四步相移法的四张光栅。[0033]图3是直射光复矢量加上散射光复矢量得到物光复矢量。[0034]图4是6微米油浸微球的空间光干涉模拟结果。[0035]图5是本发明实施例中tcc函数的相关图。其中：(a)奥林巴斯相衬显微镜的物函数为一维时的叶片状tcc函数；(b)变量分离后近似的tcc函数；(c)a图最高点处的横纵方向剖面图。(d)a,b两个函数的差。(每个像素4.5微米)。[0036]图6是本发明实施例中用于直接抠去环的内外边缘部分使用的闪耀光栅。[0037]图7是本发明实施例中使环的内外边缘部分对干涉项的tcc积分结果贡献等于0使用的马赛克光栅。[0038]图8是本发明实施例中8.4微米微球的明场图像以及微球位相重建的3维图。其中：(a)8.4微米微球的明场图像；(b)微球位相重建的3维图。[0039]图9是本发明实施例中利用双四步相移法的空间光干涉重建油浸微球的结果。[0040]图10是本发明实施例中8.4微米微球传统空间光干涉模拟结果。[0041]图11是本发明实施例中使用图6或7的光栅时8.4微米微球的模拟结果。[0042]图12是本发明实施例的方法实现流程图。具体实施方式[0043]下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。[0044]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。[0045]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。[0046]如图12所示，本实施例提供了一种双四步相移法提高空间光干涉技术精度的方法，基于部分相干光理论推导出相应的泽尼克相衬显微镜成像的公式：[0047][0048]在奥林巴斯相衬显微镜的配置下，上式中的tcc函数可以很好地近似处理为变量分离结果，[0049][0050]由图5(c)的滤波曲线可见散射光为物光的带通滤波结果，直射光为物光的低通滤波结果。图5(d)可见近似处理后的tcc误差函数的低频部分基本呈现圆锥形分布。由于其轴对称性，对应式1的干涉项的tcc函数不带有角度函数，因此积分结果对应得到一个较小的受到四步相移法调制的强度。[0051]进一步地，本发明的四步相移法与空间光干涉的技术路线采用以下3到7式实现：[0052][0053]a(x)＝(i1+i3)/2+δn＝(i0+i2)/2+δn.................................(4)[0054]b(x)＝(i3-i1)/(4sinφslim).......................................(5)[0055]φslim＝angle((i0-i2)+j(i3-i1))..............................(6)[0056][0057]式3为基于部分相干光理论的四步相移法计算模型。式3中的为相衬显微镜的交叉传递函数tcc近似处理成式2产生的误差项(见图5(d))，该项也将受四步相移法的不同相位角调制。式3中的δn为随机噪声项，可以包含系统中的杂散光。通过式6计算位相角，并消去tcc的近似误差项和噪声项的平均值部分(系统杂散光)，一定程度上提高空间光干涉的精度，相比popescu的计算方式相对误差约减小3％。[0058]更佳的，上述四步相移法做2次，即成8次像。第一次的四步相移法为传统popescu的四步相移法测量物体位相。而第二次在slm即液晶空间光调制器上显示图6或图7的光栅。图6的闪耀光栅直接将环hl与光源的环hs共轭部分之外的边缘部分挖去不参与成像。图7的马赛克光栅的相邻两个像素的位相调制角度为0与180°，使边缘部分在tcc积分过程中复数和相消。[0059]进一步地，泽尼克相衬显微镜中这边缘部分光阑充当套准余量。实际上，这部分余量可以去掉，只需保证在相位板的共轭面即slm面上，光源环的像与物镜位相板的像以及slm的环对准即可。这样的hl尺寸最小，而hl尺寸进一步减小若其尺寸小于光源尺寸，将不仅改变参考光同时改变散射光，导致双四步相移法失效。[0060]进一步地，由于相衬显微镜的光源和位相板形状尺寸在设计相衬显微镜时都已经做了很好优化，且系统需要充分光源光强提供照明，因此光源尺寸不宜再降低。因此上述方法是对基于泽尼克相衬显微镜的popescu的空间光干涉技术所做的较佳改进。[0061]双四步相移法微球重建中的实例：[0062]定量位相成像中常常以聚苯乙烯微球(n＝1.59)和物镜油(n＝1.518)混合来模拟细胞，其内外折射率差与细胞的内外折射率差接近。图8(a)为明场下20倍相衬物镜拍摄到一对油浸微球的图像，由于聚苯乙烯微球和物镜油发生反应，微球略微膨胀，通过利用明场的微球图像测量计算得出实际微球直径为8.4微米，图8(b)为双四步相移法的重建的三维位相分布图。[0063]进一步地，图9中的曲线包含标准微球的位相轮廓线，按popescu的计算方法得到的微球位相popescu oly曲线，以及两次slim的角度即散射光的角度减去直射光的角度，分别为slim oly曲线与slim sk曲线。[0064]进一步地，图9中由两次测量获得slim的角度差获得参考光的角度δφr曲线，其顶部约为23°。结合式8得到双四步相移法的位相测量计算结果double 4曲线。即利用双四步相移法的空间光干涉技术消去了23°的参考光角度。此时，空间光干涉技术测量的误差就由φr1转换为更小的φr2。[0065][0066]进一步地，使用双四步相移法的空间光干涉技术重建的位相轮廓与球形位相吻合较好，因此可以判定该微球分散于物镜油中膨胀但未变形且微球内外实际折射率差为0.0583。[0067]进一步地，图10为基于部分相干理论的模拟结果。由图可知参考光的角度在微球中心约为-34.3°。图11模拟双四步相移法的第二步，使用闪耀光栅挖去hl中大于hs部分，或者使用马赛克消除这部分对tcc的贡献。此时，参考光的角度在微球中心约为-12.9°。上述二者差值为21.4°，与双四步相移法的空间光干涉技术测到的参考光角度差基本吻合。[0068]此外，由于模拟时对像素尺寸需满足采样定理，图9与10,11的横向尺度并不一样，但y轴方向一样。[0069]综上所述，对于8.4微米的微球，传统的popescu的空间光干涉技术测得相对误差为34.3°/322.4°＝10.6％。而使用双四步相移法的空间光干涉技术其相对误差为12.9°/322.4°＝4％，这样的精度表现明显优于其它定量位相成像技术的精度。[0070]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。









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