一种识别中成药治疗新冠肺炎作用靶点的方法与流程 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及中医药与生物技术领域，具体涉及一种识别中成药治疗新冠肺炎作用靶点的方法。背景技术：2.冠状病毒广泛分布于多种脊椎动物中。冠状病毒分为α、β、γ和δ四属，其中对人类致病的冠状病毒主要集中在β属冠状病毒。与sars病毒的基因序列高度同源的sars-cov-2是一种具包膜的正链rna病毒，属于β冠状病毒的一个新种。最新的奥密克戎变异毒株有超高的传播率和极强的传染性，因此对新冠肺炎疾病的研究迫在眉睫，意义重大。3.网络药理学是基于高通量数据分析和数据库查找等方法，构建复杂的生物分子网络，系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响，从而整体地分析中药复方或者单味中药的药效物质基础及其分子机制，现已成为揭示中药及其复方制剂分子机制的常用技术，其系统性、整体性的特点与中医辩证的整体观念不谋而合，在方剂配伍、中药物质基础筛选、药理作用机制研究和中成药上市后再评价等方面应用广泛，促进了中医药研究向更深层次发展。4.大量研究显示，过度炎症反应引起的细胞因子风暴是新冠肺炎重型患者发生ards、脓毒血症的共同病理基础。sars-cov-2的致病机制与免疫系统密切相关。有研究表明，人正常肺上皮细胞(beas-2b)可用于探究肺部炎症反应、肺损伤等疾病。聚肌胞苷酸polyi:c是人工合成的双链rna，可有效模拟病毒刺激宿主体产生免疫反应。本发明方法通过整合生物信息学和网络药理学探究中成药治疗新冠肺炎可能的潜在机制，同时基于人肺上皮细胞炎症模型探究中成药在抑制或缓解新冠肺炎细胞因子风暴过程中的作用机制，可促进应对新冠肺炎的中医药有效治疗方案的发现。技术实现要素：5.为此，本发明提供一种识别中成药治疗新冠肺炎作用靶点的方法，以提供一种识别中成药治疗新冠肺炎作用靶点的新方案，进而帮助探究抑制或缓解新冠肺炎细胞因子风暴的中医药有效防治方案。6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种识别中成药治疗新冠肺炎作用靶点的方法，所述方法包括：7.步骤一：在数据库中获取基因芯片数据集，将数据集中健康人分别和重型新冠肺炎患者、轻型新冠肺炎患者样本进行基因差异表达分析，获取新冠肺炎重型患者和健康人差异表达基因、新冠肺炎轻型患者和健康人差异表达基因；8.步骤二：根据得到的差异表达基因，进行差异基因蛋白互作网络构建、基因富集分析，核心基因的筛选和模块分析，确定与新冠肺炎发生、发展相关的关键基因；9.步骤三：基于预设数据库，通过关键词检索，收集与新冠肺炎疾病有关的预测靶点并与确定的所述关键基因靶点合并、去重，获得较为全面的新冠肺炎疾病靶点；10.步骤四：通过在文献数据库检索中药制剂成分检测文献，结合中药网络药理学数据库，筛选中药制剂中的活性成分，输入到预设数据库中预测得到活性成分的潜在作用靶点，合并去重后得到化合物成分靶点并绘制化合物-靶点网络图；11.步骤五：获取中药制剂成分靶点与新冠肺炎疾病靶点的交集靶点，并构建蛋白互作ppi网络，根据预设筛选指标，分析ppi网络中的中药制剂治疗新冠肺炎的关键靶点；12.步骤六：对ppi网络中的基因靶点进行聚类分析，对重要聚类模块进行 go和kegg富集分析，得到多条关键信号通路，根据得到的关键信号通路、关键靶点，构建药物-靶点-通路网络；13.步骤七：基于药物-靶点-通路网络筛选得到多个潜在核心靶点，并与中药制剂的主要活性成分进行分子对接验证两者之间的相互作用。14.进一步地，所述步骤一中，具体包括：15.以“covid-19”作为检索词，从geo数据库中获取并筛选基因芯片数据集，数据集需满足以下筛选条件：采用人类的器官、组织、血液等为样本；包含疾病组和正常对照组，同时不存在任何药物干预；数据集的样本量至少应为 10个。16.进一步地，所述步骤一中，具体包括：17.差异表达基因筛选是采用r3.6.1软件中limma包对所纳入的原始矩阵数据进行归一化、对数值转化和差异基因(differentially expressed genes，degs) 筛选，通过平台的注释文件，将探针id转化为基因名，剔除长链非编码rna，保留编码蛋白质的基因进行研究。以|log2fc|》1(foldchange，fc，差异倍数) 和校正后的p《0.05为阈值，筛选degs(log2fc为正数代表基因上调，负数代表基因下调)。使用桑格平台(sangerbox，http://sangerbox.com/index)绘制差异基因火山图。18.进一步地，所述步骤一中，基因差异表达分析是采用r语言中的 clusterprofiler包和ggplot2包分别对重型患者和轻型患者差异表达倍数大于2 的基因进行go富集分析和kegg通路富集分析以及可视化，采用校正后 p《0.05作为筛选条件。19.进一步地，所述步骤二中，具体包括：20.差异基因蛋白互作网络构建是将筛选得到的重型和轻型差异基因导入 string数据库，以获取差异基因与关联蛋白之间的作用关系，在string中将物种设置为人类“homo sapiens”，最低互作得分设置为高置信度，即打分值大于0.7，最大互作蛋白数不超过20，以此条件下获得蛋白质相互作用ppi网络数据。21.进一步地，所述步骤二中，具体包括：22.基因富集分析是利用cytoscape 3.7.1软件中的mcode插件获得有显著作用的功能模块，设置参数为degree cutoff＝2、node score cutoff＝0.2、 k-score＝2、max.depth＝100，将所得重要模块中的基因进行kegg通路富集分析；利用插件cytohubba中的度值参数degree、瓶颈参数bottleneck、紧密度closeness参数、介数betweenness，四种参数算法对ppi网络中的数据进行分析；利用hiplot图形可视化网站和r语言中的corrplot包对潜在核心基因进行表达水平分析和关联性分析。23.进一步地，所述步骤三中，具体包括：24.在genecards数据库、omim数据库、ttd数据库中以“covid-19”和“novel coronavirus pneumonia”为关键词检索，得到与新冠肺炎疾病相关的靶点，将其与geo数据库中得到的靶点合并、去重，获得较为全面的新冠肺炎疾病靶点。25.进一步地，所述步骤四中，筛选中药制剂中的活性成分是设置检索词为“中药制剂名”、“成分”，收集中国知网cnki和pubmed数据库中已报道的该中药制剂中的化学成分。结合tcmsp和batman-tcm等中药网络药理学数据库收集、整合该中药制剂中可能发挥治疗作用的潜在活性成分。26.进一步地，所述步骤四中，具体包括：27.绘制化合物-靶点网络图是在pubchem数据库中寻找活性成分的2d结构，输入swiss target prediction数据库，设置属性为人类“homo sapiens”进行靶点预测，未在pubchem数据库中找到结构的化合物，使用chemdraw软件绘制化合物的结构，同样导入swiss target prediction中收集靶点。28.进一步地，所述步骤五中，具体包括：29.分析ppi网络中的关键靶点是通过venny平台对化合物作用的靶点与新冠肺炎相关靶点取交集，得到中药制剂治疗新冠肺炎的潜在靶点；将交集靶点导入string数据库，蛋白种类限定为人源“homo sapiens”，选取置信度为highconfidence》0.7，获得蛋白质-蛋白质相互作用ppi网络数据；将数据导入到 cytoscape软件中，选择tools→network analyzer→network analysis→analyzenetwork分析流程，进行ppi网络拓扑属性分析；使用cytohubba插件筛选出网络中的10个关键hub基因。30.进一步地，所述步骤六中，具体包括：31.聚类分析是应用cytoscape软件中mcode插件对ppi网络进行模块聚类分析，参数为degree cutoff＝2，node score cutoff＝0.2以及k-core＝2；富集分析是采用david数据库对核心模块进行go和kegg富集分析，设置校正后 p《0.05作为筛选标准，结果并以柱状图和气泡图形式可视化。32.进一步地，所述方法还包括：33.将中药制剂的方剂组成以拼音形式输入tcmatcovv1.0平台，设置蛋白互作置信分数为0.5，对模拟的新冠肺炎疾病网络进行稳健性分析，以半夏天麻白术汤作为阴性对照药物，以清肺排毒汤作为阳性对照药物，与中药制剂进行分析比较。34.进一步地，所述步骤七中，在rcsb pdb数据库下载核心蛋白以及血管紧张素转化酶ⅱ(ace2)和3cl水解酶(3clpro)的pdb格式文件，同时从 pubchem数据库下载重要小分子化合物的结构文件，通过chemdraw软件转换成mol2格式，利用autodock tools1.5.6软件对蛋白和小分子化合物的结构进行预处理，使用autodock vina进行分子对接，运用pymol软件对分子对接结果进行可视化展现。35.本发明另一方面，提供了一种基于炎症模型的中药制剂治疗新冠肺炎作用机制验证方法，通过分子生物学实验，对预测的中药制剂治疗新冠肺炎的机制进一步探讨。36.进一步地，采用polyi:c诱导人肺上皮细胞造成炎症模型，验证中药制剂是否可以显著下调炎症模型中引发细胞因子风暴关键因子的表达，从而抑制过度的免疫反应。37.进一步地，基于人肺上皮细胞炎症模型验证中药制剂对细胞因子等靶点的影响是通过cck8实验观察中药制剂对beas-2b细胞增殖的影响，寻找中药制剂安全给药浓度，随后通过酶联免疫吸附elisa法，实时荧光定量pcr (rt-qpcr)法和蛋白质印迹法wb法，探究药物对核心基因表达的影响，验证网络药理学的研究结果。38.本发明具有如下优点：39.本发明提出的一种识别中成药治疗新冠肺炎作用靶点的方法，通过选择不同新冠肺炎患者群体作为研究对象，整合数据挖掘、靶点预测、网络构建、模块分析、富集分析、分子对接等方法来探索新冠肺炎肺上皮细胞基因表达状态和中药制剂的活性成分及其预测靶点，以及与新冠肺炎发生发展过程的共同靶点，可进而分析中药制剂抑制或缓解新冠肺炎细胞因子风暴的潜在机制，为不同新冠肺炎患者提供更加精准的个体化中医药防治方案，从而促进中医药在抑制或缓解新冠肺炎细胞因子风暴等方面的有效而广泛的应用。附图说明40.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。41.图1示出了本发明中一种识别中成药治疗新冠肺炎作用靶点的方法的流程示意图；42.图2示出了本发明中新冠肺炎重型差异基因ppi网络和模块分析图；43.图3示出了本发明中新冠肺炎轻型差异基因ppi网络和模块分析图；44.图4示出了本发明中新冠肺炎潜在关键差异基因表达热图；45.图5示出了本发明中新冠肺炎九个潜在关键基因相关性分析位图；46.图6示出了本发明中一种可选的实施例中喜炎平注射液-新冠肺炎交集靶点的ppi网络图；47.图7示出了本发明中ppi网络聚类分析的模块一靶点网络图；48.图8示出了本发明中新冠肺炎的药物-靶点-通路网络图；49.图9示出了本发明中新冠肺炎的化合物-靶点分子对接图；50.图10示出了本发明中一种可选的实施例中不同浓度喜炎平注射液对 beas-2b细胞增殖的影响；51.图11示出了本发明中不同浓度喜炎平注射液对各组细胞上清液中炎症因子的影响；52.图12示出了本发明中不同浓度喜炎平注射液对各组细胞中细胞因子 mrna表达的影响；53.图13示出了本发明中不同浓度喜炎平注射液作用下各组细胞中stat3和 p-stat3蛋白表达水平。具体实施方式54.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。55.为了提供一种识别中成药治疗新冠肺炎作用靶点的方法，本技术整合应用生物信息学、网络药理学、分子对接、分子生物学实验等方法来探索新冠肺炎患者肺上皮细胞的基因表达状态和中药制剂的活性成分及其预测靶点，以及与新冠肺炎发生发展过程的共同靶点，进而分析中药制剂通过抑制新冠肺炎细胞因子风暴治疗新冠肺炎的潜在机制。56.实施例157.基于上述研究结果，本技术提出了一种确定与新冠肺炎发生、发展相关的潜在关键基因的方法，该方法包括：58.以新冠肺炎相关的gse164805基因芯片为数据源进行生物信息挖掘。检测基因表达的平台是gpl26963 agilent-085982 arraystar human lncrna v5 microarray平台。该基因芯片共有15例样本，包含5例重型患者(gsm5019827-gsm5019831)、5例轻型患者(gsm5019822-gsm5019826) 和5例健康人(gsm5019817-gsm5019821)的基因表达谱信息。在gse164805 芯片数据集中共筛选出新冠肺炎重型患者和健康人差异基因3840个，其中表达上调的有1671个，下调的2169个；轻型患者和健康人的差异基因共2375 个,其中上调的有1123个，下调的有1252个。差异表达显著性较高(|log2fc|》4) 的基因共124个，基因信息见表1。59.表160.61.62.63.[0064][0065]go富集分析结果共得到956个条目，生物过程bp条目为810个，细胞组成 cc条目有132条，分子功能mf条目为14条。选取各条目排名前15的go富集分析结果，绘制气泡图，气泡大小代表富集在该条目上的基因个数，气泡越大，表示富集在该条目上的基因个数越多；气泡颜色代表p值，气泡越红，表示该条目的p值越小。go富集分析主要集中在细胞内信号转导(intracellular signaltransduction)、病毒过程(viral process)、病毒转录(viral transcription)等生物过程；细胞器膜(organelle membrane)、全膜(whole membrane)、胞质核糖体(cytosolic ribosome)等细胞组成；rna结合(rna binding)、免疫受体活性(immune receptor activity)等分子功能。[0066]kegg通路富集结果筛选共得到26条信号通路，涉及与新冠肺炎感染相关的通路主要包括：nf-κb信号通路(nf-κb signaling pathway)、冠状病毒病ꢀ‑新冠肺炎(coronavirus disease-covid-19)通路、th1和th2细胞分化(th1 andth2 cell differentiation)通路、th17细胞分化(th17 cell differentiation)通路。选取p值较小的20个通路进行可视化。x轴表示各通路的富集因子，y轴表示通路。圆点的大小与该通路富集的基因数量成正比，圆点的颜色反应通路的p 值。[0067]go富集分析共得到728个条目，其中bp有547条，主要包括对细胞因子的反应(response to cytokine)、细胞对细胞因子刺激的反应(cellular response tocytokine stimulus)等生物学过程相关；mf有43条，包括酶结合(enzymebinding)、rna结合(rna binding)、dna结合转录因子结合(dna-bindingtranscription factor binding)等分子功能；cc有138条，主要与细胞质囊泡 (cytoplasmic vesicle)、线粒体内膜(mitochondrial protein complex)、核糖体亚基(ribosomal subunit)等相关,结果以气泡图展示。[0068]kegg富集分析共得到45条信号通路，选取前20条通路进行可视化，其中 nf-κb信号通路(nf-κbsignaling pathway)、tnf信号通路(tnf signalingpathway)、冠状病毒病-新冠肺炎(coronavirus disease-covid-19)、趋化因子信号通路(chemokine signaling pathway)、mapk信号通路(mapk signalingpathway)、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用(viral proteininteraction with cytokine and cytokine receptor)通路等可能与新冠肺炎疾病密切相关。20条重型和轻型新冠肺炎患者均失调的通路信息，如表2所示。20条通路中与新冠肺炎疾病密切相关的通路是：coronavirus disease-covid-19 pathway和nf-κb signaling pathway。两条通路共富集tnf、cxcl1、cxcl2、 rps16、rps20、map3k7、rps29、ccl4、ptgs2等40个基因。[0069]表2[0070][0071][0072]将重型差异基因输入到cytoscape软件，构建蛋白互作网络。该网络共包含739个节点，2905条边，边表示两个节点之间存在相互作用。通过cytoscape 软件中的cytohubba插件，采用degree、bottleneck、closeness、betweenness 参数筛选分别得到四种条件下排名前十的基因。其中ubc、polr2a是四种参数的交集基因；tnf、hsp90aa1、ubc、polr2a是三种参数的交集基因； rps20、rps29、rps18、polr2c、ubc、polr2a、hsp90aa1、tnf、actb、 dynll2是两种参数的交集基因。将这些基因合并去重得到10个基因即：ubc、 polr2a、polr2c、rps20、rps29、rps18、hsp90aa1、tnf、dynll2、 actb提示这些基因可能是与新冠肺炎发展有关的重要基因。[0073]由于具有相似功能的蛋白质可能聚类到相同模块，共同协调完成某一生物过程,所以在ppi网络中进行功能模块聚类分析，可以进一步探索蛋白之间的关系和参与调控的通路。通过cytoscape中的插件mcode对ppi网络中的蛋白进行模块分析，选择位于前三位得分均大于10的模块进一步研究。模块1 (score＝21.72)包含44个节点和467条边；模块2环穿心莲内酯-19-硫酸酯钠。化合物基本信息，如表3所示。swisstargetprediction数据库共预测到化合物靶点98个。共收集文献中喜炎平注射液的靶点共26个。两种方式收集的化合物靶点，合并去重，共得到化合物靶点123个。[0080]表3[0081][0082][0083]从geo得到gse164805芯片，以|log2fc|》1，校正后的p《0.05为阈值，收集新冠肺炎患者和健康人差异基因4265个。genecards数据库中得到2789个靶点；ttd数据库中得到63个；omim中检索到两个。整合四个数据库的靶点，共得到6446个新冠肺炎疾病靶点，其中共有880个靶点在genecards数据库中得分值≥1。[0084]得到61个喜炎平注射液治疗新冠肺炎的交集靶点。应用cytoscape软件构建ppi网络，如图6所示。在此网络图中包含70个节点，410条边。使用tools工具栏中的网络分析技术，以度值大于均值为筛选依据，网络中节点的平均度值为12，共有27个靶点的度值高于所有靶点的平均度值，包括:stat3、il-2、il-6、 il-1β、tnf、il-10、mapk8、mapk14、cxcl8、il-4、il-13、il-5等基因，提示喜炎平注射液治疗新冠肺炎很可能是通过多靶点协同发挥作用，靶点信息见表4。采用bottleneck算法得到十个hub基因，包括：tnf、il6、kras、 mapk8、ep300、jak2、pik3ca、mapk9、stat3、lck，这些基因可能与新冠肺炎发展相关。将度值较大的基因和hub基因合并去重，得到28个喜炎平注射液治疗新冠肺炎的重要靶点。[0085]表4[0086][0087][0088]为了获取ppi网络中的重要的聚类模块，进一步进行模块分析，共获得三个模块，其中模块一富集多个hub基因，且得分大于10(score＝10.522)，将模块一基因进行富集分析。模块1网络共包括24节点，121边，如图7所示。[0089]为探究喜炎平注射液治疗新冠肺炎的靶点在基因功能和信号通路中的作用，将模块一靶点导入david6.8数据库，进行基go和kegg富集分析。 david平台列表与背景均设置为“homo sapiens”。保留错误发现率(falsediscovery rate，fdr)＜0.05的数据。共得到go条目120条，其中bp条目有98 条，cc条目有9条，mf条目有13条，主要包括细胞因子产生的正调控(positiveregulation of cytokine production)、免疫反应(immune response)、炎症反应(inflammatory response)、t细胞分化(tcell differentiation)等过程，选择与新冠肺炎最为相关的go条目绘制条形图。kegg富集分析得到149条信号通路，多为病毒感染、炎症、免疫、癌症、细胞凋亡、肺部疾病等通路。通过阅读文献，得到26条可能与新冠肺炎发生发展相关的关键信号通路，选取其中 fdr值较小20条进行气泡图展示。我们发现28个重要靶点中18个富集在模块一这个关键模块中，这些靶点可能是共同参与调节信号通路，发挥治疗作用的重要基因。[0090]为了更加清晰地展现药物、关键靶点与通路的关系，表明中药多成分、多靶点、多通路的复杂作用机制。将可能与新冠肺炎相关的26条通路、潜在核心靶点输入到cytoscape软件，构建药物-靶点-通路网络，如图8所示。该网络中共45个节点，215条边。以度值为筛选标准，靶点度值的平均值为9.60。大于平均度值的靶点有10个，分别是：il-6、tnf、il-1β、cxcl8、mapk1、 mapk14、mapk8、map2k2、kras、pik3r2。这10个靶点可作为发挥治疗新冠肺炎的潜在核心靶点。查找kegg数据库中的分类(class)可以将通路分为4类，分别是与细胞因子、炎症等信号转导有关的通路；与免疫相关的通路；与病毒感染和肺疾病相关的通路和其他代谢方面的通路。度值排名前十的通路有：il-17信号通路(il-17 signaling pathway)、toll样受体信号通路(t cellreceptor signaling pathway)、糖尿病并发症中age-rage信号通路(age-ragesignaling pathway in diabetic complications)、细胞因子-细胞因子受体相互作用 (cytokine-cytokine receptor interaction)、c型凝集素受体信号通路(c-typelectin receptor signaling pathway)、pi3k-akt信号通路(pi3k-akt signalingpathway)、jak-stat信号通路(jak-stat signaling pathway)、冠状病毒病‑ꢀ新冠肺炎(coronavirus disease-covid-19)、th17细胞分化(th17celldifferentiation)、人类巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)等。[0091]将药物-靶点-通路网络中筛选出的10个潜在核心靶点与喜炎平注射液中的主要活性成分17-氢-9-去氢-穿心莲内酯-19-硫酸酯钠进行分子对接。ace2、 3clpro已作为抗新冠肺炎的作用靶点被报道，故也选用这两个蛋白与关键成分进行对接。stat3是ppi网络中度值最大的靶点，且是hub基因之一，故也将 stat3基因列为潜在核心靶点与喜炎平注射液核心成分进行对接。本研究中分子对接结果显示，除在pdb数据库中未找到合适结构的map2k2靶点，17-氢-9‑ꢀ去氢-穿心莲内酯-19-硫酸酯钠与潜在核心靶点以及ace2、3clpro两个报道的蛋白，结合自由能均小于-5.0kcal/mol，结合亲和力良好。一般认为配体与受体结合的能量越低越稳定，发生的作用可能性最大。分子对接结果见表5。用 pymol软件对对接结果进行可视化，红色框中表示小分子均对接在大分子蛋白内部，将红色部位进行放大可观察到详细的对接氨基酸残基，如图9所示。[0092]表5[0093][0094]实施例3[0095]基于上述研究结果，本技术提出了一种基于炎症模型的中药制剂治疗新冠肺炎作用机制验证方法，该方法包括：[0096]实验结果表明，与对照组相比，喜炎平注射液在一定浓度下对beas-2b 细胞的增殖有显著的抑制作用。在浓度为0-500μg/ml时，对照组和实验室结果无显著性差异(p》0.05)，表明喜炎平注射液在该浓度范围对beas-2b细胞无明显毒性，因此选择此浓度范围作为给药的安全浓度范围，实验结果如图10 所示(注：a：给药24h，药物对细胞增殖的影响；b：给药48h，药物对细胞增殖的影响；c：给药72h，药物对细胞增殖的影响；与对照组相比**p《0.01， ****p《0.0001)。[0097]elisa实验结果表明，与对照组相比，模型组中的tnf-α、il-6、il-1β、 cxcl8蛋白表达水平显著升高，差异具有统计学意义(p《0.0001)；与模型组相比，给予低、中、高剂量的喜炎平注射液给药组中，四种炎症因子蛋白表达水平均显著下降，差异具有统计学意义(p《0.01)，且给予的喜炎平注射液浓度越大，细胞因子下降趋势越明显，如图11所示(注：a:对照组；b：模型组； c：低剂量组；d：中剂量组；e：高剂量组；与对照组相比，####p《0.0001；与模型组相比，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)。[0098]rt-qpcr实验结果显示，与对照组相比，模型组中tnf-α、il-6、il-1β、 cxcl8中的mrna表达明显上升，差异具有统计学意义(p《0.0001)；与模型组相比，喜炎平注射液低、中、高剂量给药组中，四种细胞因子tnf-α、il-6、 il-1β、cxcl8的mrna表达水平均显著下降，差异具有统计学意义(p《0.01)，且随着药物浓度的升高，下降趋势越明显，如图12所示(注：a:对照组；b：模型组；c：低剂量组；d：中剂量组；e：高剂量组；与对照组相比，####p《0.0001；与模型组相比，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)。[0099]westernblot结果显示，对照组、模型组、给药组的各组细胞中stat3蛋白表达水平均无显著性差异(p》0.05)；与对照组相比，模型组细胞中p-stat3 蛋白的表达水平显著升高，差异具有统计学意义(p《0.0001)，与模型组相比，喜炎平注射液低、中、高剂量组细胞中的p-stat3蛋白表达水平明显降低，差异具有统计学意义(p《0.05)，且喜炎平注射液浓度越大，p-stat3蛋白的表达水平降低越显著，实验结果如图13所示(注：a:对照组；b：模型组；c：低剂量组；d：中剂量组；e：高剂量组；与对照组相比，####p《0.0001；与模型组相比，*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001)。[0100]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。









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