一种基于抗氧化性能评价鲜切莲藕保鲜效果的方法 专利技术说明

食品,饮料机械,设备的制造及其制品加工制作,储藏技术1.本发明属于食品工程技术领域，具体涉及一种基于抗氧化性能评价鲜切莲藕保鲜效果的方法。背景技术：2.鲜切果蔬因其具有食用方便、安全、卫生及营养价值高等特点，近年来深受消费者喜爱。但鲜切操作、贮运、销售过程中均会发生一系列的生理生化和品质的变化，导致果蔬衰老进程加快、腐烂加剧等品质劣变现象；其中鲜切果蔬的抗氧化系统在采后贮藏品质保持中发挥着重要作用。鲜切果蔬抗氧化系统主要由酚类物质、黄酮类物质、维生素类等物质组成非酶抗氧化系统，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶等组成酶促抗氧化系统，共同发挥对鲜切果蔬贮藏品质的调节作用。技术实现要素：3.本发明的目的是提供一种基于抗氧化性能评价鲜切莲藕保鲜效果的方法，并且开发了一种延缓鲜切莲藕褐变的方法，进一步用上述的评价方法进行了验证。4.因此，本发明的第一个目的是提供一种基于抗氧化性能评价鲜切莲藕保鲜效果的方法，包括以下步骤：5.s1.选取无病害和无机械损伤、大小一致的莲藕，洗净，去皮，切成5mm厚度的薄片，表面消毒，选取无褐变、明亮完整的莲藕切片作为样品，随机分为两组进行后续处理；6.s2.处理组将莲藕切片在待测保鲜剂溶液中浸泡处理，对照组将莲藕切片在蒸馏水中浸泡处理，然后取出莲藕切片并将其表面上的水用滤纸吸干，分别装入包装袋密封，贮藏；7.s3.分别测定处理组、对照组莲藕切片的总酚、总醌、活性氧、丙二醛含量以及pal、ppo、pod、cat和sod活性；若处理组相对于对照组具有较高的总酚含量、较低的总醌含量、较低的活性氧、丙二醛含量、较高的pal、ppo、pod、cat和sod活性，则判定所述的待测保鲜剂溶液对鲜切莲藕具有较好的保鲜效果。8.优选，所述的表面消毒为在质量分数0.01％次氯酸钠水溶液中浸泡5min。9.优选，所述的贮藏，贮藏温度为10℃。10.优选，所述的测定，其测定时间为处理后的第2、4、6、8、10或12天。11.本发明还提供一种延缓鲜切莲藕褐变的方法，包括以下步骤：12.选取无病害和无机械损伤的莲藕，洗净，去皮，切片，表面消毒，将莲藕切片在0.5-2g/l乙烯溶液中浸泡1-5min，然后取出沥干，贮藏。13.优选，所述的表面消毒为在质量分数0.01％次氯酸钠水溶液中浸泡5min。表面消毒是对鲜切莲藕进行减菌处理，以减少贮藏后期微生物生长过多对莲藕片品质造成不良影响。14.优选，所述的贮藏，贮藏温度为5-10℃。15.优选，所述的乙烯溶液为10℃的乙烯溶液。16.优选，为将莲藕切片在1g/l乙烯溶液中浸泡1min。该处理条件下能显著延缓鲜切莲藕品质劣变且效果最佳。17.本发明还提供上述的方法在鲜切莲藕保鲜中的应用。18.本发明提供了一种基于抗氧化性能评价鲜切莲藕保鲜效果的方法，并利用该方法对本发明的延缓鲜切莲藕褐变的方法的效果进行了评价验证。本发明的延缓鲜切莲藕褐变的方法，通过将莲藕切片在1g/l乙烯溶液中浸泡1min即可提高鲜切莲藕的抗氧化能力，表现显著延缓鲜切莲藕品质劣变、维持鲜切莲藕的颜色、延缓鲜切莲藕的褐变的效果，是一种简单、高效的延缓鲜切莲藕褐变的方法，具有很好的应用价值。附图说明19.图1是乙烯溶液浸泡鲜切莲藕浓度和时间筛选；20.图2是乙烯溶液处理对鲜切莲藕色差和褐变度的影响；21.图3是乙烯溶液处理对鲜切莲藕总酚和总醌含量的影响；22.图4是乙烯溶液处理对鲜切莲藕生化酶活和基因表达的影响；23.图5是乙烯溶液处理对鲜切莲藕抗氧化酶活和基因表达的影响；24.图6是乙烯处理对鲜切莲藕活性氧和丙二醛含量的影响。具体实施方式25.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。26.实施例127.1.材料及方法28.1.1材料处理[0029]“鄂莲5号”莲藕在汉口北采收后，4℃贮藏24h。选取无病害和无机械损伤、直径8-10cm、长度15-18cm的莲藕。莲藕洗净，去皮，切成5mm的薄片，然后在质量分数0.01％次氯酸钠水溶液中浸泡5min。选取无褐变明亮完整的莲藕片作为样品，随机分为两组进行后续处理。[0030](1)乙烯利(et)浸泡浓度筛选：分别取0.8824g、1.7647g、3.5295g、4.059g乙烯利(上海源叶生物有效公司，产品型号s18030，质量分数85％，分析纯)溶于3l蒸馏水配制成不同浓度的乙烯溶液(有效浓度分别为0.25g/l、0.5g/l、1g/l和2g/l)。将莲藕切片在et溶液中在10℃下浸泡5min。[0031](2)乙烯利(et)浸泡时间筛选：根据浓度筛选结果，将鲜切藕片在有效浓度1g/l et溶液中浸泡0.5min、1min、3min、5min。[0032](3)对照组(ck)：将莲藕片用3l蒸馏水浸泡，条件与以上两个处理组一致。在上述的的浸泡处理后，取出莲藕片将其表面上的水用滤纸吸干。然后将莲藕片样品装入食品级聚乙烯托盘(18.8cm*12cm*1.5cm)中，每盒两片，装入包装袋密封，10℃贮藏。每个指标进行3次重复测定，每2天测定一次。样品在液氮中冷冻并保存在-80℃冰箱中。[0033]1.2莲藕外观品质[0034]莲藕的外观品质的评估通过相机(canon,eos550d)拍照来确定，随机挑选一盒样品拍照记录鲜切莲藕片的感官品质。[0035]1.3鲜切莲藕片色差和褐变度的测定[0036]用色差仪(jz-300，深圳市金准仪器设备有限公司)测定鲜切藕片贮藏过程中表面的l*、a*、b*值。随机选取3个测定点，并计算平均值。[0037]采用以下方法测定褐变度。称取3g莲藕样品组织于100ml离心管中，然后加入30ml蒸馏水，在10000r/min，4℃下匀浆1min，接着在10000r/min，4℃条件下离心5min。吸取3ml上清液于新的10ml离心管中，然后在25℃条件下水中孵育5min，最后在410nm处测定吸光度(蒸馏水调零)，结果用a410×10表示。[0038]1.4总酚和可溶性醌含量的测定[0039]总酚含量的测定采用folin-ciocalteu方法。称取3g莲藕组织样品，然后加入30ml的60％乙醇于50ml离心管中匀浆6min，接着在10000r/min、4℃条件下，离心5min。吸取0.125ml上清液于10ml离心管中，然后加入0.5ml蒸馏水和0.125ml福林酚试剂，涡旋混合后，在室温避光条件下静置3min，最后再向混合液中加入1.25ml 7％na2co3和1ml蒸馏水。在25℃水浴条件下避光静置反应90min后，在760nm处测定其吸光度值。用不同浓度梯度的没食子酸(gae)溶液制作标准曲线，从而来量化莲藕中总酚含量。结果表示为没食子酸当量/kg鲜重(gae mg/kg)。[0040]可溶性醌含量的测定采用以下方法进行。称取5g的莲藕组织于50ml离心管中，然后再加入20ml的甲醇，接着在10000r/min、4℃下匀浆1min，最后在10000r/min、4℃条件下离心10min，吸取3ml上清液(甲醇调零)在437nm处测定其吸光度值，则可溶性醌的含量表示为a437 nm/g。[0041]1.5 pal、ppo和pod活性的测定[0042]莲藕中pal活性的测定用苯丙氨酸解氨酶活力测定试剂盒(南京建成)进行提取和测定。称取0.3g的莲藕组织加入5ml试剂一，然后在冰浴条件下研磨成匀浆，全部转移到10ml离心管中，紧接着在4℃下以10000r/min离心10min，吸取全部上清液(粗提的pal酶液)。向新的10ml离心管中加入20μl上清液，依次加入780μl试剂二(空白组800μl)和200μl试剂，涡旋混匀后，在30℃下保温反应30min，最后向混合物溶液中加入40μl试剂四终止反应，静置10min后，290nm的测定样品(蒸馏水调零)的吸光度值。定义一个酶活力单位为每克样品在每毫升反应体系中吸光度值变化0.1所需的酶量，莲藕中pal的活性用u/g表示。[0043]莲藕的ppo活性采用以下方法测定。称取3g莲藕样品组织于研钵中，然后加入50ml磷酸盐缓冲液(pbs 0.05mol/l，ph 7.0)，在冰浴条件下研磨成匀浆，将匀浆液全部转移至100ml离心管中，然后在4℃下条件下以6000r/min离心15min，吸取全部的上清液(粗提的ppo酶液)，冰浴保存待用。底物液的配制：向新的10ml离心管中加入1ml 0.1mol/l邻苯二酚和1.5ml 0.05mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.0)，涡旋混匀后在35℃条件下水浴保温5min。ppo活性的测定：吸取1ml粗提ppo酶液(1ml磷酸缓冲液调零)加入底物液中，在420nm处测定混合溶液吸光度值随时间的变化。加入酶液后立即开始计时，每隔10s记录一次吸光度值，记录到180s。截取吸光值随时间的变化曲线的最大斜率最为酶活测定范围。定义一个酶活力单位为每克样品每分钟引起吸光度改变0.001所需的酶量，莲藕中ppo的活性用u/g表示。[0044]莲藕的pod活性采用以下方法测定。称取5g莲藕组织于研钵中，然后加入5ml 0.2mol/l提取缓冲液(含1mmol/l聚乙二醇6000、4％聚乙烯吡咯烷酮和1％tritonx-100)，在冰浴条件下研磨成匀浆，将匀浆液全部转移至10ml离心管中，然后在4℃下以12000r/min离心30min。吸取全部的上清液(粗提的pod酶液)，冰浴保存待用。底物液的配制:向新的10ml离心管中加入3ml 25mmol/l愈创木酚和0.2ml 5mol/l溶解的过氧化氢。pod活性的测定:吸取0.5ml粗提pod酶液(0.5ml提取缓冲液调零)加入底物液中，在470nm处测定混合溶液吸光度值随时间的变化。加入酶液后立即开始计时，每隔10s记录一次吸光度值，记录到180s。截取吸光值随时间的变化曲线的最大斜率最为酶活测定范围。定义一个酶活力单位为每克样品每分钟引起吸光度改变0.01所需的酶量，莲藕中pod的活性u/g表示。[0045]1.6 cat和sod活性的测定[0046]称取5g莲藕样品于研钵中，然后加入20ml磷酸盐缓冲溶液(0.05mol/l，ph7.0)，冰浴研磨成匀浆液，将匀浆液全部转移至100ml离心管中，然后在10000r/min、4℃条件下离心10min，吸取全部的上清液(cat酶液)，冰浴保存待用。cat活性的测定：吸取100μl cat酶液加入到2.9ml h2o2溶液(20mmol/l)后，在测量405nm处的吸光度随时间的变化。定义一个酶活力单位为每克组织样品每分钟吸光度减少0.01为一个过氧化氢活力单位，莲藕中cat的活性用u/g表示。[0047]sod酶液的提取和活性的测定用超氧化物歧化酶试剂盒(南京建成)进行。称取5g莲藕组织于研钵中，然后加入20ml 0.05mol/l ph 7.0的磷酸缓冲液，冰浴研磨成匀浆液，将匀浆液全部转移至100ml离心管中，然后在10000r/min、4℃条件下离心10min，吸取全部的上清液(sod酶液)，冰浴保存待用。向新的10ml离心管中依次加入1ml试剂一、0.05ml上清液(对照管取0.05ml蒸馏水)、0.1ml试剂二、0.1ml试剂三、0.1ml试剂四应用液，混匀后在37℃水浴避光反应40min，最后加入2ml显色剂后终止反应。室温下静置10min后，在550nm处测定其吸光度(蒸馏水调零)。sod活力定义为每克组织在1ml反应液中sod抑制率达到50％时所对应的sod量为一个sod活力单位(u)，莲藕中sod的活性用u/g表示。[0048]1.7活性氧和丙二醛含量的测定[0049]莲藕中h2o2含量的测定用过氧化氢含量试剂盒(南京建成)进行。称取2g莲藕组织于研钵中，加入18m生理盐水，冰浴研磨成匀浆液，将匀浆液全部转移至50ml离心管中，然后在10000r/min、4℃条件下离心10min，吸取全部的上清液，冰浴保存待用。向新的试管中加入1ml试剂一、0.1ml上清液(空白管取0.1ml蒸馏水，标准管则加入0.1ml 163mmol/l标准品应用液)和1ml试剂二，涡旋混匀后，在405nm处测定其吸光度(蒸馏水调零)，h2o2含量单位为mmol/l表示。[0050]超氧阴离子自由基产生速率的测定采用盐酸羟胺法进行。称取5g的莲藕组织于研钵中，然后加入5ml提取缓冲液(含1mmol/l edta，0.3％tritonx-100和2％pvp)，在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转移至10ml离心管中，然后在10000r/min、4℃条件下离心10min，吸取全部的上清液，冰浴保存。向新的10ml离心管中加入1ml上清液，1ml 50mmol/l ph7.8磷酸缓冲液、1ml 1mmol/l的盐酸羟胺溶液，混匀在于25℃下水浴避光反应1h，接着加入1ml 17mmol/l对氨基苯磺酸和7mmol/lα-萘胺。混匀后于25℃下避光反应20min，最后在12000r/min、4℃条件下离心5min。吸取上清液在530nm处测定样品的吸光度值，以不进行保温1h的作为对照。超氧氢离子的产生速率定义为每分钟每克组织样品(鲜重)产生的超氧阴离子的物质的量，结果表示为nmol/min·g。[0051]羟自由基产生速率的测定用羟自由基试剂盒(南京建成)进行。称取5g莲藕组织于研钵中，然后加入20ml无水乙醇，冰浴研磨成匀浆，将匀浆液全部转移至50ml离心管中，然后在10000r/min、4℃条件下离心10min，吸取全部的上清液，冰浴保存。取上清液并将其稀释150倍备用。向新的10ml离心管中加入0.2ml试剂二和0.2ml样品稀释液(空白管直接取0.4ml蒸馏水，标准管取0.2ml蒸馏水和0.2ml试剂一，对照管取0.2ml蒸馏水和0.2ml试剂二)，在37℃水浴条件下反应1min，最后加入2ml显色剂终止反应，室温静置20min后在550nm处测定其吸光度值(蒸馏水调零)。羟基自由基产生速率定义为每克组织样品每分钟在反应体系中使反应液中羟自由基增加的物质的量，结果表示为nmol/min·g。[0052]称取5g莲藕组织于研钵中，然后加入5ml三氯乙酸(10％w/v)，冰浴研磨成匀浆，将匀浆液全部转移至10ml离心管中，然后在10000r/min、4℃条件下离心10min，吸取全部的上清液，冰浴保存。向新的10ml离心管中加入2ml上清液和2ml硫代巴比妥酸溶液于100℃下煮沸20min。将煮沸后的混合溶液在室温下冷却，然后再以10000r/min，4℃离心20min。最后在600、532和450nm处测量上清液的吸光度。结果用μmol/l表示。[0053]1.8实时荧光定量pcr[0054]采用catb法提取莲藕组织的总rna，用凝胶电泳法评价rna的完整性。采用turbo dna-freetm kit试剂盒纯化rna后用nanon60/n50测量rna浓度及质量。rna逆转录成cdna用iscript cdna synthesis kit试剂盒的方法进行。采用primer premier5设计实验所需的引物，选择莲藕中对外界因素不敏感且表达量稳定的肌动蛋白基因actin作为内参。引物的合成由华大基因完成。引物序列见下表1。实时荧光定量pcr反应用ssofasttmsupermix试剂盒的方法进行。[0055]表1基因引物序列表[0056][0057][0058]1.9数据分析[0059]实验中指标的测定均进行3次生物学重复，结果表示为平均值±标准误差。通过方差分析(anova)进行组间平均值的比较，然后进行duncan检验。采用spss19.0软件进行分析，在p《0.05时具有显著性。采用origin 2021和adobe illustrator cc 2019进行绘图。[0060]2.结果与分析[0061]2.1乙烯(et)最佳浸泡浓度和时间[0062]为探究乙烯对鲜切莲藕贮藏品质的影响，进行了不同浓度乙烯和浸泡时间的实验，结果如图1所示，从感官品质和色差l*值(图1a-b)可以得出0.25g/l乙烯溶液浸泡与对照在整个贮藏期间相比无显著差异，0.5、1和2g/l乙烯溶液浸泡延缓鲜切莲藕感官品质的劣变和色差l*值的下降，其中，1g/l乙烯溶液延缓品质劣变效果最好。1g/l乙烯溶液浸泡时间对鲜切莲藕品质的影响如图1c-d，在贮藏前期浸泡0.5min与对照相比无显著差异，而浸泡1、3、5min在整个贮藏期间均能较好的维持莲藕片的外观品质，其中浸泡1min效果最佳。因此1g/l乙烯溶液浸泡1min能显著延缓鲜切莲藕品质劣变且效果最佳。[0063]2.2色差和褐变度[0064]基于浓度和时间筛选结果，进行了1g/l乙烯溶液浸泡鲜切莲藕1min的实验。色差和褐变度的变化如图2所示，色差l*值(图2a)呈下降趋势，在整个贮藏期间，et处理下降了7.87％，而ck下降了13.56％，乙烯处理显著延缓l*值的下降。色差a*值代表颜色红绿，负值表示绿色，正值表示红色。a*值(图2b)呈上升趋势，其中et处理与ck相比上升较为缓慢，et处理从-1.57上升至4.07，而ck从-2.33上升至5.40，这表明et处理能延缓鲜切莲藕变红。色差b*值代表颜色黄蓝，负值代表蓝色，正值代表黄色。b*值(图2c)总体呈上升趋势，在贮藏结束时，et处理的b*值是初始值的1.53倍，而ck是初始值的1.79倍，et处理显著延缓了鲜切莲藕b*值的上升，这表明et处理能抑制鲜切莲藕变黄。褐变度是评价鲜切果蔬品质劣变的重要指标，在图2d中，鲜切莲藕的褐变度随贮藏时间的延长逐渐升高，et处理在第2、4、6、10、12d的褐变度均显著低于ck。这些结果表明乙烯处理能显著维持鲜切莲藕的颜色，延缓鲜切莲藕的褐变。[0065]2.3总酚和可溶性醌含量[0066]鲜切果蔬发生褐变的原因之一是果蔬中含有大量的酚类物质，它是酶促褐变的底物，同时酚类物质具有一定的抗氧化能力。在图3a中，总酚含量呈下降趋势，et处理组鲜切莲藕中总酚含量与初始值相比下降了37.40％，ck组与初始值相比下降了53.12％，且et处理中总酚含量一直显著高于ck组。这可能是酚类物质提高了鲜切莲藕的抗氧化性从而延缓了褐变。醌类是酚类酶促褐变的产物，是一种黑色素。在图3b中，总醌含量呈上升趋势，et处理的鲜切莲藕中总醌含量是初始值的2.79倍，而ck组是初始值的3.27倍，且et处理的总醌含量一直显著低于ck组，这表明乙烯处理抑制鲜切莲藕中酚类向醌类的转化，提高了鲜切莲藕的抗氧化能力。[0067]2.4 pal、ppo和pod活性及其基因表达[0068]pal是苯丙氨酸代谢过程中合成酚类物质的重要的一个酶。在图4a中pal活性呈上升趋势，et处理组pal活性在整个贮藏期间一直显著高于ck组。同时，在转录表达中nnpal1的相对表达量呈上升趋势(图4b)，与ck组相比，et处理的表达显著上调；nnpal2的相对表达量也呈上升趋势(图4c)，在贮藏前期相对表达量很低，et处理在第6d出现表达高峰，而ck组在第8d出现表达高峰，这些结果表明乙烯处理显著提高了pal活性，促进了酚类的合成。[0069]ppo能催化酚类发生酚类酶促褐变，导致果蔬褐变。在图4d中，ppo活性呈上升趋势，et处理组ppo活性在整个贮藏期间一直显著高于ck组。同时，在转录表达中nnppo1的相对表达量呈上升趋势(图4e)，与ck组相比，et处理的nnppo1表达显著上调；nnppo2的相对表达量也呈上升趋势(图4f)，在贮藏前期相对表达量很低，et处理在第6d出现表达高峰，而ck组在第8d出现表达高峰，这些结果可能表明乙烯处理提高了鲜切莲藕的抗逆性。[0070]pod能催化在过氧化物存在的条件下植物中过氧化物的转化。在图4g中，pod活性呈上升趋势，et处理组pod活性在整个贮藏期间一直显著高于ck组。同时，在转录表达中nnpod1的相对表达量呈上升趋势(图4h)，与ck组相比，et处理的表达显著上调。这表明乙烯处理加快了鲜切莲藕中过氧化物代谢，提高了抗氧化性。[0071]2.5抗氧化酶活及其基因表达[0072]cat能分解过氧化氢产生水，从而减少对植物的毒害作用。在图5a中，cat活性呈上升趋势，et处理组cat活性在整个贮藏期间一直显著高于ck组。同时，在转录表达中nncat1基因的相对表达量呈上升趋势(图5b)，在第0d时，et处理的鲜切莲藕nncat1基因表达与ck组相比显著上调；这表明乙烯处理能提高鲜切莲藕中过氧化氢酶的活性。在整个贮藏期间et处理的nncat1基因表达与酶活一致。nncat2基因的表达(图5c)与nncat1基因相似，在贮藏前期均显著上调了cat活性。因此，在贮藏前期乙烯处理能显著上调nncat1/2基因的表达，提高了鲜切莲藕中cat活性，从而提高抗氧化能力延缓鲜切莲藕的褐变。[0073]sod是植物中一种抗氧化酶，它能歧化超氧阴离子产生过氧化氢和水。在图5d中，sod活性呈上升趋势，et处理组sod活性在整个贮藏期间一直显著高于ck组。同时，在转录表达中nnsod的相对表达量呈上升趋势(图5e)，在第0d时，et处理的鲜切莲藕nnsod基因表达与ck组相比显著上调；这表明乙烯处理能提高鲜切莲藕的抗氧化能力，在整个贮藏期间et处理的nnsod基因表达与酶活一致。这表明乙烯处理通过上调nnsod基因的表达，提高了鲜切莲藕中sod活性，从而提高抗氧化能力延缓鲜切莲藕的褐变。[0074]2.6活性氧和丙二醛(mda)含量[0075]植物组织受到损伤后会诱导活性氧的产生，其中包括超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等。在图6a中，超氧阴离子自由基产生速率随贮藏时间的延长逐渐上升，et处理的鲜切莲藕中超氧阴离子自由基产生速率一直低于ck组，在第4d和第6d显著低于ck组，这表明乙烯处理能抑制鲜切莲藕中超氧阴离子自由基的产生。在图6b中，羟自由基产率随贮藏时间的延长逐渐上升，et处理的鲜切莲藕中羟自由基产率一直低于ck组，但两者之间无显著差异。在图6c中，过氧化氢含量随贮藏时间的延长逐渐上升，在贮藏结束时，et处理组中过氧化氢含量是初始值的1.23倍，而ck组是初始值的1.62倍；从第4d开始et处理的鲜切莲藕中过氧化氢含量显著低于ck组。这些结果表明乙烯处理对鲜切莲藕中活性氧具有一定的抑制作用，尤其对过氧化氢具有显著的抑制作用。[0076]丙二醛是膜脂过氧化的产物，它指示了细胞膜的过氧化程度，同时还具有致毒和致癌性。在图6d中，丙二醛含量随贮藏时间的延长逐渐上升，从第6d开始et处理的鲜切莲藕中丙二醛含量显著低于ck组，这表明乙烯处理能抑制鲜切莲藕的膜脂过氧化，从而延缓鲜切莲藕品质的劣变。









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