一种PTP1B多肽抑制剂BimBH3-12-I8A及其应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术一种ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a及其应用技术领域1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a 及其应用。背景技术：2.蛋白酪氨酸磷酸酶1b(protein tyrosine phosphatase 1b，ptp1b)与2型糖尿病 及肥胖症的发病和发展有密切的关系，其是胰岛素信号转导通路中的关键的负调 节蛋白。ptp1b异常过量表达，会使胰岛素敏感性降低，形成胰岛素抵抗。而 ptp1b抑制剂能够通过阻断胰岛素刺激的胰岛素受体(ir)的酪氨酸磷酸化， 进而影响胰岛素受体底物(irs-1)的磷酸化，使类胰岛素和胰岛素敏感性增强， 有效地从源头改善胰岛素抵抗，从而降低血糖，同时不存在胰岛素类药物的低血 糖不良反应。因此，ptp1b也是近年来研究t2dm的热门靶点，并且已有多个 候选化合物已进入临床前及临床i、ii期实验。近年来的最新研究观点表明： ptp1b可以作为抗肿瘤和阿尔兹海默症药物开发的(潜在)靶标。一些研究发 现ptp1b过表达能够显著促进小鼠体内肿瘤的发生和生长，通过抑制剂抑制 ptp1b的表达能够产生抗肿瘤效果；机制研究发现ptp1b通过调控rnf213基 因从而控制细胞非线粒体氧消耗，进而促进缺氧条件下肿瘤细胞的生存和生长。 据此，ptp1b被看作是抗肿瘤药物的靶标。近些年ptp1b还被作为中枢神经系 统中与阿尔兹海默症相关生理过程中的调控作用，提出通过抑制ptp1b进而拮 抗ptp1b调控的与阿尔兹海默症相关的有害生理过程的策略，进行抗阿尔兹海 默症药物的研发。因此，ptp1b已成为抗糖尿病、癌症及阿尔兹海默症药物开 发的潜在热门靶点，而ptp1b抑制剂有望应用于以ptp1b为靶点的抗糖尿病、 癌症和阿尔兹海默症等药物的开发中。3.目前，ptp1b的抑制剂主要包括无机小分子类化合物、有机化合物和天然 产物中ptp1b抑制剂。但无机小分子类化合物的选择性非常低，对所有的ptps 都有较强的抑制性；而有机化合物大多通过有机合成和组合化学的方法进行筛 选，先筛选到具有抑制ptp1b活性的化合物，再对化合物的取代基团进行修饰， 最后得到一种较好的ptp1b抑制剂，此类抑制剂存在稳定性差、带电荷较高、 亲脂系数过高等制约成药性的问题；天然产物中ptp1b抑制剂是通过对自然界 中分离鉴定的天然产物进行高通量筛选，虽然其具有高选择性和活性，但作用位 点并不是很明确。因此，弥补现有ptp1b抑制分子的缺陷，开发结构新颖、选 择性强、低毒且高效的新型ptp1b抑制剂以满足国内临床上的迫切需求，就显 得十分必要。技术实现要素：4.本发明提供了一种ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a及其应用及其应用。 所述ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a具有显著的ptp1b的抑制活性，可用 于制备预防或治疗以ptp1b为靶点的相关疾病的药物开发。5.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：6.本发明提供了一种抑制ptp1b活性的新型bh3模拟肽类似物，所述新型 bh3模拟肽类似物的结构式如下：[0007][0008]其中，r1为长链羧酸，r2为cooh，r3为不同碳链长度的羧酸或多羧酸。[0009]本发明提供了一种ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a，所述ptp1b多肽抑 制剂bimbh3-12-i8a的结构式如下：[0010][0011]进一步的，所述ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a的制备方法包括以下步 骤：[0012](1)室温下，将fmoc-phe-wang树脂置于手动多肽固相合成器中，用二氯 甲烷、二甲基甲酰胺活化；[0013](2)加入哌啶/二甲基甲酰胺混合液脱除fmoc保护基；[0014](3)加入3-4倍树脂摩尔量的n-fmoc保护氨基酸或羧酸、hobt、hbtu 以及5-6倍树脂摩尔量的diea，室温振荡反应2～4h；[0015](4)重复步骤(2)和(3)，直至完成整个模拟肽序列的合成；[0016](5)将步骤(4)的产物中加入裂解液，室温搅拌，过滤，加入无水乙醚析 出固体后，经洗涤、真空干燥得模拟肽类似物粗产物；[0017](6)所述肽类似物粗产物使用反相制备液相色谱纯化，收集目标峰流动相 溶液脱去乙腈后，冷冻干燥得到絮状或粉末状固体，即得ptp1b多肽抑制剂 bimbh3-12-i8a纯品。[0018]进一步的，所述裂解液包括苯酚、水、苯甲硫醚和三氟乙酸。[0019]进一步的，所述步骤(5)中过滤后鼓吹n2去除多余的三氟乙酸。[0020]本发明还提供了以所述的ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a为活性成分的 药物或药物组合物，包括任一所述ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a和一种或 多种药学上可接受的载体或赋型剂。[0021]本发明还提供了所述的ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a在制备用于抑制 ptp1b活性的抑制剂中的应用。[0022]本发明还提供了所述的ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a在制备用于预防 或治疗以ptp1b为靶点的疾病的药物中的应用。[0023]进一步的，所述疾病包括糖尿病、癌症和阿尔兹海默症。[0024]进一步的，以ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a为活性成分的药物或药物 组合物的给药方式为口服或注射。[0025]与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明通过多肽固相合成方 法得到一种ptp1b多肽抑制剂bimbh3-12-i8a，该模拟肽化合物衍生自bimbh3 结构域的核心12肽，其中第8位的ile被ala所替换，采用多肽固相合成方法进 行制备，其结构中的氨基酸均为天然氨基酸。所述新型bh3模拟肽类似物具有 显著的抑制ptp1b的活性，在以ptp1b为靶点的相关疾病如糖尿病、癌症、阿 尔兹海默症等的药物开发中具有潜在的应用价值。因此，所述的ptp1b多肽抑 制剂分子bimbh3-12-i8a具有潜在的应用价值及很好的开发前景。附图说明[0026]图1位所述的ptp1b多肽抑制剂分子bimbh3-12-i8a(即scan-7)对靶蛋 白ptp1b的剂量-抑制效应曲线。具体实施方式[0027]以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下述实施例 中的方法，如无特别说明，均为常规方法。[0028]实施例1[0029]以scan-1为例的合成路线，具体制备过程如下：[0030](1)树脂活化：称取相应量的fmoc-phe-wang(scan-11为fmoc-a1a-wang) 树脂置于手动多肽固相合成器中，dcm洗4次，加入5ml dcm溶涨活化3h， dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两次(20min+5min)，5mldmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0031](2)连接phe(f)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的fmoc-phe-oh、 hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf中，室温搅拌反应 2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两次(20min+5min)， 5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0032](3)连接glu(e)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的 fmoc-glu(otbu)-oh、hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf 中，室温搅拌反应2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两 次(20min+5min)，5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0033](4)连接asp(d)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的 fmoc-asp(otbu)-oh、hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf 中，室温搅拌反应2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两 次(20min+5min)，5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0034](5)连接gly(g)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的fmoc-gly-oh、 hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf中，室温搅拌反应 2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两次(20min+5min)， 5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0035](6)连接ile(i)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的fmoc-ile-oh、 hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf中，室温搅拌反应 2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两次(20min+5min)， 5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0036](7)连接arg(r)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的fmoc‑ꢀarg(mtr)-oh、hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf中， 室温搅拌反应2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两次 (20min+5min)，5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。重 复此步骤1次。[0037](8)连接arg(r)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的fmoc‑ꢀarg(mtr)-oh、hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf中， 室温搅拌反应2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两次 (20min+5min)，5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。重 复此步骤1次。[0038](9)连接leu(l)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的fmoc-leu-oh、 hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf中，室温搅拌反应 2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两次(20min+5min)， 5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0039](10)连接glu(e)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的 fmoc-glu(otbu)-oh、hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf 中，室温搅拌反应2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两 次(20min+5min)，5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0040](11)连接glu(q)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的 fmoc-glu(otbu)-oh、hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf 中，室温搅拌反应2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两 次(20min+5min)，5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0041](12)连接ala(a)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的 fmoc-ala-oh、hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf中， 室温搅拌反应2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两次 (20min+5min)，5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0042](13)连接ala(a)：dmf洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的 fmoc-ala-oh、hbtu、hobt和6倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf中， 室温搅拌反应2h，dmf洗4次，加入20％哌啶dmf脱去fmoc保护基两次 (20min+5min)，5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0043](14)连接棕榈酸(pal)：dmf洗涤3次，分别加入6倍树脂摩尔量的棕 榈酸、hbtu、hobt和10倍树脂摩尔量的diea，溶于10ml dmf中，室温搅 拌反应4h，5ml dmf洗4次，5ml dcm洗4次，kaiser’s试剂检测。[0044](15)切割，解侧链保护基：产物加入250mg苯酚、0.5ml水、0.5ml苯甲 硫醚、9.0ml三氟乙酸，室温搅拌2.5h，过滤，n2吹去三氟乙酸，加入30ml冷 的无水乙醚，5000rpm离心5min，得到白色沉淀，用冷的无水乙醚重复洗涤3 次，真空干燥，得粗产物。[0045](16)粗产物使用反相制备液相色谱(rp-hplc)纯化、收集目标峰流动相 溶液脱去乙腈后，冷冻干燥得到絮状或粉末状固体，即bh3模拟肽类似物纯品， 通过质谱和高效液相色谱分析进行结构确证。[0046]以上述方法，得到的27个bh3模拟肽类似物的质谱数据和hplc纯度分析 数据见表1。[0047]表1 bh3模拟肽类似物的质谱数据和hplc纯度分析数据[0048][0049]实施例2：蛋白酪氨酸磷脂酶1b(ptp1b)抑制活性测定[0050]本发明中采用mes缓冲液为反应体系，利用人源蛋白酪氨酸磷酸酶1b (ptp1b)，以对硝基苯磷酸二钠(pnpp)为特异性底物，选择先导化合物sm-6 作为阳性对照、以dmso为阴性对照，建立了基于酶反应速率的96孔微板为载 体的筛选模型，通过酶学方法寻找ptp1b抑制剂。[0051]具体实施方法为：采用mes缓冲体系(25mm，ph6.5)，在96孔板内依 次加入10μlpnpp(77mm)、86μl mes缓冲液、4μl化合物(2mm)、100 μl ptp1b溶液(50nm)，反应总体积为200μl。每组3个平行，以dmso为 阴性对照，原钒酸钠(2mm)为阳性对照，25℃下，在摇床上摇动1min，酶标 仪上每隔60s读数一次，动态测定5min，测其od 405的变化(od/min)。每 个孔的初始阶段反应速率呈线性相关，动力学曲线线性部分的斜率决定ptp1b 的反应速度，以速度表示酶活。所得数据用表示，各组数据运用t检验分 析。化合物对ptp1b的抑制率计算公式：[0052]抑制率(％)＝(vdmso-v样本)/vdmso×100％[0053]其中，vdmso、v样本分别表示阴性对照组和受试化合物的初始平均反应速率[0054]本发明对模拟肽在10μmol/l浓度下进行ptp1b抑制率初筛，对初筛抑制率 高于70％的化合物进行ic50测定，抑制结果参见表2。[0055]表2受试模拟肽类似物对ptp1b活性的抑制结果[0056][0057][0058]*：初筛抑制率低于50％的化合物未进行ic50的测定。[0059]采用graphpad prism软件进行统计学处理，绘制出抑制剂量效应曲线，见图 1，并计算得到模拟肽类似物scan-2、scan-3、scan-4、scan-5、scan-6、scan-7、 scan-8、scan-11、c13-sm6、c14-sm6、c16diacid-sm6、c18-sm6、c18diacid-sm6、 c20-sm6、c20diacid-sm6、c22-sm6、c22diacid-sm6和lila-sm6的ptp1b 抑制中浓度ic50分别为91.6nmol/l、703.0nmol/l、580.9nmol/l、1208.0nmol/l、 56.5nmol/l、45.4nmol/l、63.7nmol/l、511.9nmol/l、835.4nmol/l、262.7nmol/l、 2875nmol/l、120.2nmol/l、384.6nmol/l、3887nmol/l、443.5nmol/l、337.9nmol/l、 199.6nmol/l、4345nmol/l。[0060]试验结果表明：本发明的模拟肽类似物对蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1b表现出 显著的抑制作用，能够作为优异的ptp1b抑制剂，并应用于以ptp1b为靶点的 抗糖尿病、抗肿瘤及抗阿尔兹海默症症药物的开发中，因此具有很好的开发前景。[0061]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前 述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可 以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同 替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的 技术方案的精神和范围。









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