一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术一种环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法技术领域1.本发明属于抗生素抗性基因检测技术领域，具体涉及一种环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法。背景技术：2.环境微生物抗生素抗性的发展严重威胁人类健康，引起了人们极大的关注。i型整合子是携带抗生素抗性基因的重要遗传元件，也是引发多重抗生素抗性的重要原因，使用便捷的方法分析环境样品i型整合子携带的抗生素抗性基因特征十分必要。但目前缺乏方便快捷的i型整合子携带抗生素抗性基因的分析方法。3.对基因定量常使用定量pcr，但单纯采用对抗生素抗性基因的定量pcr，难以区分是整合子还是在其他dna片段上携带的抗性基因。而单纯采用对整合子的pcr，又仅能对该样品是否存在整合子进行定性分析。如中国专利zl201010140309.2一种细菌i型、ii型、iii型整合子基因的pcr检测方法，公开了一种细菌i型、ii型、iii型整合子基因的pcr检测方法，采用i型、ii型、iii型整合酶基因的引物对对细菌是否含有i型、ii型、iii型整合子进行检测，该方法仅能进行是否存在整合子的初步定性判断，并不能对整合子是否含有目标抗生素抗性基因(args)以及目标args的丰度进行有效的定性和定量检测。4.采用宏基因组分析的手段，可以在宏基因组数据中挖掘整合子所携带抗性基因的信息，但技术难度大，分析过程复杂，数据出现分析错误的概率较高，定量分析程度低，分析周期长，难以广泛应用。5.通过传统的克隆文库方法进行整合子基因和序列的分析，又由于克隆文库整体分析通量较低，对于整合子的解析深度不够，其携带的抗生素抗性基因分析不够全面，也无法获得定量的数据。6.因此，对于整合子携带抗生素抗性基因(args)的定量检测方法是本领域的重点研究方向，具有重要的前景意义。技术实现要素：7.发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，掌握抗生素抗性基因在i型整合子上的相对丰度特征。8.技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：9.本发明的第一个目的是，提供一种环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，包括以下步骤：10.(1)提取样品的dna；11.(2)所述dna的i型整合子进行pcr扩增，得i型整合子扩增产物；12.(3)所述i型整合子扩增产物进行纯化回收，得纯化回收产物；13.(4)以所述纯化回收产物为模板进行定量pcr定量检测；14.(5)根据定量pcr定量检测结果，计算i型整合子在整合子上的相对丰度。15.可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述提取样品的dna的方法包括：将样品在10000r/min下离心10min，倒干上清液，使用powersoil dna isolation kit提取dna。16.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述样品包括污泥样品、污水样品、土壤样品、沉积物样品等环境样品。17.可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述pcr扩增的反应体系包含2×transstart fastpfu pcr supermix(-dye)12.5μl，上下游引物各1μl，dna模板1μl，ddh2o 9.5μl。18.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述上下游引物包括：上游引物ggcatccaagcagcaag，下游引物aagcagacttgacctga。19.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述pcr扩增的温度程序为95℃10min；35×(94℃30s，55℃30s，72℃2min30s)，72℃10min。20.可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述纯化回收的方法包括：所述i型整合子扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，再进行切胶纯化。21.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述琼脂糖凝胶电泳的方法包括：1体积当量的质量体积分数为1％-1.5％(单位为g/ml)的琼脂糖凝胶完全融化，冷却但未凝固前加入0.0001体积当量的sybr safe dna gel stain，摇匀后倒入制胶板，待凝固后放入电泳槽中，将所述i型整合子扩增产物依次加入至凝胶孔内，在150v条件下跑胶30min。22.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述切胶纯化的方法包括：使用产物切胶回收试剂盒将整合子条带从200bp-4500bp的位置切胶回收并纯化。23.可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，所述定量pcr定量检测的体系包括：[0024]1×powerup sybr green master mix，[0025]1mg/ml牛血清白蛋白，[0026]500nm目标抗性基因前引物，[0027]500nm目标抗性基因后引物，[0028]10-20ng/l dna模板，所述dna模板为所述i型整合子扩增产物的纯化回收产物。[0029]可选的，在本发明的一种实施方式中，所述定量pcr定量检测的反应程序为：预热95℃，10min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，40s；共40个循环。[0030]可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述i型整合子的相对丰度的计算方法包括：args定量pcr测试单位体积拷贝数/单位体积i型整合子浓度，单位为copie/ng i型整合子。[0031]本发明的第二个目的是，提供上述的方法的应用，具体为应用于抗生素抗性基因检测领域。[0032]有益效果：本发明提供的一种环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，具有以下优势：[0033](1)以pcr为基础，避免了使用宏基因组测序分析难度大、数据挖潜困难、定量分析程度不足的问题；[0034](2)通过对i型整合子进行扩增纯化并作为后续定量pcr模板的方式，克服了直接定量pcr无法区分args是否为i型整合子携带的困扰；[0035](3)采用定量pcr分析，克服了克隆文库分析通量低，无法定量，基因分析不足的问题；[0036](4)本发明为环境样品i型整合子抗生素抗性基因的相对丰度分析，提供了新的技术方法和研究方向。附图说明[0037]图1为实施例1中i型整合子pcr扩增产物电泳图；[0038]图2为实施例1中样品i型整合子中检出args相对丰度图；[0039]图3为实施例2中i型整合子pcr扩增产物电泳图；[0040]图4为实施例2中样品i型整合子中检出args相对丰度图。具体实施方式[0041]本发明首先对样品dna的i型整合子进行pcr扩增，对i型整合子的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化，而后以该切胶纯化产物为模板进行定量pcr的分析，从而对抗生素抗性基因进行检测，并进行基因在整合子上相对丰度的分析与比较，从而掌握抗生素抗性基因在i型整合子上的相对丰度特征。[0042]下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。[0043]实施例1污水处理系统i型整合子args相对丰度分析[0044]本实施例选取了9个污水处理厂的好氧池污泥作为实验样本，其中4个来自市政污水处理厂，5个来自工业废水处理系统(1个工业园区综合污水处理厂，2个制药工业废水处理系统，2个农药工业废水处理系统)，样品以污水厂名称缩写命名，具体信息如表2所示。[0045]表2实施例1的采样信息[0046][0047]在本发明实施例中，所采用的环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法具体包括以下步骤：[0048](1)提取样品的dna[0049]在本发明实施例中，样品采用的是污泥样品，具体是污水处理系统使用的活性污泥。在其他实施例中，还可以是其他的环境样品，如污水样品、土壤样品、沉积物样品等。[0050]将以上9个污泥样品在10000r/min下离心10min，倒干上清液，每个样品分别取0.25g污泥，使用powersoil dna isolation kit提取dna，操作步骤按照试剂盒说明书进行。[0051](2)i型整合子扩增[0052]对提取到的样品dna的i型整合子进行pcr扩增，得i型整合子扩增产物。[0053]pcr扩增反应体系为25μl，包含2×transstart fastpfu pcr supermix(-dye)(北京，全式金生物技术有限公司)12.5μl，前后引物各1μl，dna模板1μl，ddh2o 9.5μl。使用的i型整合子引物和温度程序见表1。[0054]表1 i型整合子pcr引物序列与温度程序[0055][0056](3)i型整合子扩增产物纯化回收[0057]对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：制备1％琼脂糖凝胶，称取0.7g琼脂糖置于锥形瓶中，加入70ml1×tae，微波炉加热煮沸3次至琼脂糖完全融化，拿出冷却，待其未凝固前加入7μl的sybr safe dna gel stain(美国，thermo fisher)，摇匀后倒入制胶板，待凝固后放入电泳槽中，将样品pcr产物依次加入至凝胶孔内，在150v条件下跑胶30min，通过紫外凝胶成像可清晰观察到pcr产物中整合子片段条带。如图1所示为本实施例i型整合子pcr扩增产物电泳图。图中显示的条带为扩增所得到的i型整合子片段，不同长度的条带表述携带不同长度基因盒阵列的i型整合子。图中显示，在各样品中均扩增到不同长度条带的i型整合子，说明本方法有效地实现了样品中不同长度i型整合子的扩增。[0058]使用产物切胶回收试剂盒(上海，生工生物工程有限公司)将各个样品的整合子条带从200bp-4500bp的位置切胶回收并纯化，用于后续定量pcr分析。[0059](4)定量pcr定量检测[0060]本发明实施例进行qpcr检测的平台为abi公司生产的quantstudio 3定量pcr仪。[0061]检测基因包括ermb、teta、teto、tetq、suli、sulii、qaca，使用引物为文献已报道引物，包括：[0062]ermb(taaagggcatttaacgacgaaact和tttatacctctgtttgttagggaattgaa)、[0063]teta(ctcaccagcctgacctcgat和cacgttgttatagaagccgcatag)、[0064]teto(atgtggatactacaacgcatgagatt和tgcctccacatgatatttttcct)、[0065]tetq(cgcctcagaagtaagttcatacactaag和tcgttcatgcggatattatcagaat)、[0066]suli(cagcgctatgcgctcaag和atcccgctgcgctgagt)、[0067]sulii(tcatctgccaaactcgtcgtta和gtcaaagaacgccgcaatgt)、[0068]qaca(tggcaataggagctatggtgttt和aaggtaacactattttcggtccaaatc)。[0069]qpcr反应体系包括：[0070]1×powerup sybr green master mix，[0071]1mg/ml牛血清白蛋白，[0072]500nm目标抗性基因前引物，[0073]500nm目标抗性基因后引物，[0074]10-20ng/l dna模板，其中dna模板即为步骤(3)获得的i型整合子扩增产物的纯化回收产物。[0075]本发明实施例中，定量pcr定量检测的反应程序为：预热95℃，10min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，40s；共40个循环。[0076](5)i型整合子相对丰度计算[0077]i型整合子相对丰度计算：args定量pcr测试单位体积拷贝数/单位体积整合子浓度，单位为copie/ng i型整合子。[0078]本实施例中，如表2所示的活性污泥样品i型整合子扩增产物进行args定量pcr的检出体积浓度，即为args定量pcr测试单位体积拷贝数，具体获得如下分析结果：[0079]表2活性污泥样品i型整合子扩增产物进行args定量pcr的检出体积浓度[0080][0081][0082]w1、w2、w3、w4、w5、w6、w7、w8、w9样品i型整合子扩增产物浓度(即为单位体积整合子浓度)分别为：13.4ng/μl、14.2ng/μl、19.8ng/μl、20.0ng/μl、20.0ng/μl、20.0ng/μl、20.0ng/μl、20.0ng/μl、20.0ng/μl。则根据args定量pcr测试单位体积拷贝数/单位体积整合子浓度可得到各污泥样品i型整合子携带args的相对丰度，如表3和图2所示。[0083]表3活性污泥样品i型整合子携带args的相对丰度[0084][0085]如图2所示为本实施例样品i型整合子中不同args的相对丰度，从图中可以看出，所检测的7种args在各样品整合子中的检测种类为3种至7种。通过计算args在i型整合子的相对丰度(表3)得出，所检出的args在污泥样品中的相对丰度范围为2.04×100-1.67×103copies/ng integron。其中，sulii在i型整合子上的相对丰度显著高于其他几个检测基因，其相对丰范围为2.74×102-1.67×103copies/ng integron。而qaca在i型整合子上的检出率最低，检测的相对丰度也最低，为2.04×100-4.75×100copies/ng integron。[0086]本方案应用于污水处理厂活性污泥i型整合子args相对丰度的检测，有效的检测得到目标args在i型整合子上的相对丰度。[0087]实施例2厌氧消化污泥i型整合子args相对丰度分析[0088]本实施例选取了厌氧消化污泥作为实验样本，其中，厌氧消化污泥来源于半连续式污泥厌氧消化反应器，厌氧消化运行使用的厌氧消化底物为剩余污泥，取自某污水处理厂，总固体含量(ts)为24.4g/l，挥发性固体(vs)为13.3g/l，使用前污泥含水率调整为94％，于105℃烘箱中进行热预处理48h，取出后待冷却至室温方可向反应器中投加。接种污泥为厌氧颗粒污泥，ts为37.4g/l，vs为17.0g/l，使用前用去离子水调整含水率为94％。[0089]本实施例中，厌氧消化运行相关条件如下：[0090](1)反应器有效容积：1000ml，实际反应体积：600ml；[0091](2)底泥与接种污泥投加体积分别为480ml和120ml；[0092](3)反应温度设置25℃、35℃和55℃分别代表低温、中温和高温；[0093](4)反应器初始ph调节至7，通过调低每次投加底物的ph来维持反应器内部的ph，将ph稳定在较小的波动范围内；[0094](5)运行反应器之前先曝氮气20min，以确保反应器内厌氧环境；[0095](6)污泥停留时间(srt)：30天，每三天进行一次出料和进料，每次进出料体积均为60ml；[0096](7)反应器内的ph控制在6.8～7.8。[0097]样品采集：取反应器运行第141天的3个温度反应器中的污泥样品以及厌氧消化运行前污泥样品进行i型整合子携带args分析，25℃、35℃和55℃下样品分别命名为pp、pm、pt，厌氧消化运行前初始样品命名为initial。[0098]采用如实施例1所示的境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，首先对pp、pm、pt及initial样品dna的i型整合子进行pcr扩增，对i型整合子的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化。如图3所示为本实施例i型整合子pcr扩增产物电泳图。图中显示的条带为扩增所得到的i型整合子片段，不同长度的条带表述携带不同长度基因盒阵列的i型整合子。图中显示，在各样品中均扩增到不同长度条带的i型整合子，说明本方法有效地实现了样品中不同长度i型整合子的扩增。此外，pt样品中条带数量和亮点均低于pp和pm，说明pt样品中的i型整合子数量低于pp和pm。[0099]而后以该切胶纯化产物为模板进行定量pcr的分析，从而对抗生素抗性基因进行检测，并进行基因在整合子上相对丰度的分析与比较，从而掌握抗生素抗性基因在i型整合子上的相对丰度特征。[0100]其中，检测的目标args为：ermb、ermf、tetm、tetg、suli、sulii、dfra，使用引物为文献已报道引物，包括：[0101]ermb(taaagggcatttaacgacgaaact和tttatacctctgtttgttagggaattgaa)、[0102]ermf(cagctttggttgaacatttacgaa和aaattcctaaaatcacaaccgacaa)、[0103]tetm(catcatagacacgccaggacatat和cgccatcttttgcagaaatca)、[0104]tetg(tcaaccattgccgattcga和tggcccggcaatcatg)、[0105]suli(cagcgctatgcgctcaag和atcccgctgcgctgagt)、[0106]sulii(tcatctgccaaactcgtcgtta和gtcaaagaacgccgcaatgt)、[0107]dfra(ggaatggccctgatattcca和agtcttgcgtccaaccaacag)。[0108]本实施例中，如表4所示的活性污泥样品i型整合子扩增产物进行args定量pcr的检出体积浓度，即为args定量pcr测试单位体积拷贝数，具体获得如下分析结果：[0109]表4污泥样品i型整合子扩增产物进行args定量pcr的检出体积浓度[0110][0111]initial、pp、pm、pt样品i型整合子扩增产物浓度(即为单位体积整合子浓度)分别为：10.0ng/μl、10.0ng/μl、10.0ng/μl、10.0ng/μl。则根据args定量pcr测试单位体积拷贝数/单位体积整合子浓度可得到各污泥样品i型整合子携带args的相对丰度，如表5和图4所示。[0112]表5污泥样品i型整合子携带args的相对丰度[0113][0114]如图4所示为本实施例样品i型整合子中不同args的相对丰度，从图中可以看出，所检测的7种args在各样品整合子中的检测种类为5种至7种。通过计算args在i型整合子的相对丰度(表5)得出，所检出的args在污泥样品中的相对丰度范围为8.47×100-1.87×105copies/ng integron。其中，suli和dfra在i型整合子上的相对丰度相对较高，其相对丰范围分别为7.21×103-8.65×104copies/ng integron和1.24×103-1.87×105copies/ng integron。而tetg在i型整合子上的检出率最低，检测的相对丰度也最低，为8.47×100-1.21×101copies/ng integron。[0115]本方案应用于厌氧消化污泥i型整合子args相对丰度的检测，有效的检测得到目标args在i型整合子上的相对丰度。[0116]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!