一种复合菌剂及其应用的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于农业微生物应用技术领域，具体涉及一种复合微生物菌剂及其应用。背景技术：2.目前降低土壤重金属污染修复的主要方法有：物理法(如客土法、换土法、深耕翻土法)、化学法(淋溶法、施用改良剂)和生物法(植物修复和微生物修复)。其中物理法工程量大，化学法易造成二次污染，利用生物法来解决该问题不失为一种有效的方法。并且，生物修复法能保障土壤修复的长期有效性和维持土壤生态系统的长期稳定性。3.cn112538449a(一株粪产碱杆菌dy-8及其在去除重金属镉中的应用)，菌株用于镉污染土壤浸出，弱酸态镉和铁锰结合态镉以及总镉的去除率在65％-75％之间，有机结合态镉去除率在50％-60％之间，土壤ph值显著提高1-2.5个单位。4.cn112625981a(一株黏质沙雷氏菌及其应用)，公开了加入菌株c273在 cd2+初始浓度为10，20，40和80mg·l-1时，cd2+去除效率分别为40.08％、40.74％、 38.71％、49.81％。5.在(“2株耐镉微生物的筛选及其对镉的吸附钝化差异机制”，张旭辉，2019，南京农业大学学报)公开了一株属于无色杆菌属的菌株zxh21能最大对镉的去除率最大值分别为36.5％。6.cn104673715a(对镉具有固定效应并能促进植物生长的肠杆菌及其应用)，公开了一株肠杆菌对镉的去除率可达到70-75％。7.辣椒疫病的病原菌为鞭毛菌亚门真菌中的辣椒疫霉菌(phytophthoracapsici leon.)，辣椒疫霉菌的寄主范围较广，除辣椒外还有其他一些寄主如番茄和一些瓜类作物等。周启明研究报道辣椒疫霉菌的寄主包含9科21种栽培植物和杂草。辣椒疫病在辣椒生长发育的各个阶段均可发病，辣椒的各个组织液均可发病。8.辣椒灰霉病危害辣椒的整个生育期，主要危害叶片、茎秆、花、果实。苗期发病，初子叶顶端褪绿变黄，湿度大时呈水浸状软腐；后扩展至幼茎，幼茎变细缢缩呈棕褐色，使幼苗病茎折断或萎蔫枯死。成株期发病，初始叶外沿褪绿形成水浸状浅褐色病斑，扩展后呈圆形或椭圆形、褐色并带有浅褐色轮纹的大型病斑，湿度大时病斑上密布灰色霉层，发病末期可使整叶腐烂而死；茎秆和叶柄染病，初生水浸状不规则病斑，病部产生灰白色霉状物，病枝向下蔓延至分杈处；花器染病，花瓣呈褐色，水浸状，上密生灰色霉层；果实染病，幼果果蒂周围局部先产生水浸状褐色病斑，逐渐扩大后呈暗褐色，凹陷腐烂，表面产生不规则轮状灰色霉。辣椒灰霉病的病原是灰葡萄孢菌，属于半知菌的一种真菌。9.现有技术中没有出现既能实现土壤降镉效果，还能防治植物疫病和灰霉病的复合菌剂的存在。技术实现要素：10.为了克服上述的技术问题，本发明提供以下技术方案：11.一种复合菌剂，所述复合菌剂包含肠杆菌(enterobacter cancerogenus)sl12 和沙雷氏菌(serratia marcescens)sl11；所述肠杆菌(enterobacter cancerogenus) sl12的保藏号：cctcc no:m 2022288，2022年3月18日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址:中国.武汉.武汉大学；所述沙雷氏菌(serratiamarcescens)sl11的保藏号：cctcc no:m 2022287，2022年3月18日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址:中国.武汉.武汉大学。12.优选地，所述复合菌剂还包括产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7；所述产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7的保藏号：cctcc no:m 2022285。13.优选地，所述复合菌剂还包括无色杆菌(achromobacter insuavis)sl8的保藏号：cctcc no:m 2022286。14.优选地，所述肠杆菌(enterobacter cancerogenus)sl12、沙雷氏菌(serratiamarcescens)sl11、产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7和无色杆菌(achromobacterinsuavis)sl8的菌液比为：1:1:1:1。15.一种复合菌剂在制备钝化镉的菌剂中的应用。16.一种复合菌剂在制备防治植物病害的药剂中的应用。17.优选地，所述植物病害为疫病或灰霉病。18.优选地，所述植物为辣椒。19.本发明属于农业微生物应用技术领域，涉及一种复合菌剂及其应用。本发明将从镉污染场地分离的的无色杆菌(achromobacter insuavis)sl8和肠杆菌 (enterobacter cancerogenus)sl12产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7和沙雷氏菌(serratia marcescens)sl11的复合菌剂具有高效去除镉的能力还能防治植物疫病和灰霉病。附图说明20.图1为无色杆菌(achromobacter insuavis)sl8的系统发育进化树图。21.图2为肠杆菌(enterobacter cancerogenus)sl12的系统发育进化树图。22.图3为产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7的系统发育进化树图。23.图4为沙雷氏菌(serratia marcescens)sl11的系统发育进化树图。24.图5为无色杆菌(achromobacter insuavis)sl8在镉去除实验中的生长曲线图。25.图6为肠杆菌(enterobacter cancerogenus)sl12在镉去除实验中的生长曲线图。26.图7为产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7在镉去除实验中的生长曲线图。27.图8为沙雷氏菌(serratia marcescens)sl11在镉去除实验中的生长曲线图。具体实施方式28.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。29.本发明中的肠杆菌(enterobacter cancerogenus)sl12的保藏号：cctccno:m 2022288；所述沙雷氏菌(serratia marcescens)sl11的保藏号：cctccno:m 2022287；所述产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7的保藏号：cctcc no: m 2022285；无色杆菌(achromobacter insuavis)sl8的保藏号：cctcc no:m 2022286。上述4株微生物于2022年3月18号保藏于中国典型培养物保藏中心 (cctcc)，保藏地址:中国.武汉.武汉大学。30.实施例1:产碱杆菌sl7和沙雷氏菌sl11的分离鉴定。31.(1)样品采集：含微生物的镉污染土壤样品采集来自湖南省长沙市浏阳市某镉污染农田的5-20cm的表层土壤。32.(2)微生物富集：称取土壤样品10g，在无菌操作的条件下将其放入装有灭过菌的90ml液体lb培养基的三角瓶中，置于摇床，200rpm/min，28摄氏度振荡12小时。33.(3)镉抗性菌分离：吸取(2)中1ml土壤样品到9ml无菌生理盐水中按照逐步稀释法依次稀释至10-3，10-4，10-5，以上稀释浓度土壤样品分别取0.1ml 涂布在含50mg/l cdcl2的筛选培养基上，每个稀释浓度涂3个重复平板，置于 28摄氏度恒温培养至长出需要的具有镉抗性的候选菌落。液体lb培养基配制组分：酵母提取物5g/l，胰化蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，naoh调ph至7.0。在121摄氏度高压蒸汽灭菌锅中灭菌30分钟。固体lb培养基配制同液体lb 培养基，固体lb培养基中需另加2％琼脂。34.(4)划线分离纯化：再将步骤(3)中得到的不同菌落按照划线平板法进行划线分离，得到纯化的单一菌落。35.(5)镉抗性菌的筛选：将步骤(4)得到的单一菌落接种到含镉浓度为50 mg/l的lb固体培养基上进行初筛，每组设3个重复，平板置于28摄氏度恒温箱中倒置培养3天。将上述平板上长出的菌落依次划线接种于镉(cd2+)浓度为 50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l的lb固体培养基平板培养基上进行复筛，在30摄氏度恒温箱中倒置培养3天，重复3次操作，观察菌落生长情况。将有菌落生长的固体平板保存于4℃冰箱中保存。36.(6)镉去除菌的筛选：将步骤(5)中得到的菌株单克隆接种到含100mg/l 镉(cd2+)浓度的液体lb培养基中，测定单一菌株、不同组合菌株，溶液中剩余的cd2+含量。确定具有高效镉去除能力的菌株或菌株组合。37.镉去除菌的分类鉴定：一、16s核糖体rna鉴定：选择16s rrna基因高变区序列进行细菌群落测序，测序引物为27f(5‑ꢀagagtttgatcctggctcag-3)-1492r(5-taccttgttacgactt-3)，测序区域为v3～v4区。然后进行pcr扩增，合并引物接头并使用琼脂糖电泳对pcr 产物进行纯化、定量和均一化并合成测序文库。扩增产碱杆菌sl7与沙雷氏菌 sl11的16s核糖体rna后，得到的序列扩増产物进行测序，无色杆菌 (achromobacter insuavis)sl8的16s rrna的基因序列如seq id no:1所示；肠杆菌(enterobacter cancerogenus)sl12的16s rrna的基因序列如seq idno:2所示，产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7的16s rrna的基因序列如seqid no:3所示，沙雷氏菌(serratia marcescens)sl11的16s rrna的基因序列如seq id no:4所示，测序结果在genbank核酸序列库中进行blast分析。利用mega.7对无色杆菌(achromobacter insuavis)sl8、肠杆菌(enterobactercancerogenus)sl12产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7和沙雷氏菌(serratiamarcescens)sl11菌株进行系统发育树构建，确定其分类。构建的系统发育树 (图2)，结果发现，无色杆菌(achromobacter insuavis)sl8与肠杆菌(enterobactercancerogenus)sl12分别能与无色杆菌属与肠杆菌属的菌株聚类到一起，且其核苷酸序列同源性分别为99.79％和98.97％；产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7 与沙雷氏菌(serratia marcescens)sl11菌株分别能与产碱杆菌属与沙雷氏菌属的菌株聚类到一起，且其核苷酸序列同源性分别为99.72％和99.73％。因此将两种菌株分别鉴定为产碱杆菌alcaligenes faecalis sl7，沙雷氏菌serratiamarcescens sl11。二、利用电子扫描显微镜对镉去除菌株进行形态学观察。38.实施例2:菌株的镉去除曲线。39.(1)将纯化后的无色杆菌(achromobacter insuavis)sl8、肠杆菌 (enterobacter cancerogenus)sl12、产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7和沙雷氏菌(serratia marcescens)sl11菌株接种于100ml lb液体培养基中，在200 rpm/min，30摄氏度的摇床中振荡培养。待振荡培养至菌液od600值为0.8，取 300ul(各菌株的菌液比参照表1中16组试验设计，进行3个重复)于30ml 的100mg/l含cd2+液体lb培养基中，在200rpm/min，30℃摇床中振荡培养。分别在实验的第0，1，3，7天进行取样，每次取1ml于离心管，在12000rpm 离心10min，取上清液1ml。用45um过滤器过滤，用原子光谱吸收仪(aas) 测定滤液中cd2+浓度。40.(2)实验结果描述：当加入的镉的初始浓度为100mg/l时，在分别加入了sl7、 sl8、sl11和sl12的体系中，7天后分别含sl7、sl8、sl11和sl12的实验体系溶液中镉浓度分别下降到了32.23mg/l、30.45mg/l、37.98mg/l和29.19 mg/l，镉的去除率分别为67.77％、69.55％、62.02％和70.81％。镉去除率达到了67.77％。同时，将sl11和sl12按照菌液比1:1加入到100mg/l的含镉实验体系，则七天后，其镉去除率达到了78.03％。当将sl11、sl12和sl7按照菌液比1:1:1加入到100mg/l的含镉实验体系，七天后，其镉去除率达到了 81.03％。当将sl11、sl12、sl7和sl8按照菌液比1:1:1:1加入到100mg/l 的含镉实验体系，则七天后，其镉去除率达到了82.44％。因此，相比于单菌株的使用，复合菌株的共同使用对镉的去除具有协同效果。41.表1复配表及其结果42.[0043][0044]实施例3:菌株在镉溶液中的生长曲线。[0045](1)将纯化后的无色杆菌(achromobacter insuavis)sl8、肠杆菌 (enterobacter cancerogenus)sl12、产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7和沙雷氏菌(serratia marcescens)sl11菌株接种于100ml lb液体培养基中，在200 rpm/min，30摄氏度的摇床中振荡培养。待振荡培养至菌液od600值为0.8，取 300ul于30ml的0mg/l、50mg/l、100mg/l或含cd2+液体lb培养基中，在 200rpm/min，30摄氏度摇床中振荡培养。分别在实验的第0，6，24，30，54， 70小时进行取样，用光学显微镜进行观察，利用血球计数板法进行计数，记录实验过程中细菌浓度变化，绘出产碱杆菌无色杆菌(achromobacter insuavis)sl8、肠杆菌(enterobacter cancerogenus)sl12、产碱杆菌(alcaligenes faecalis)sl7 和沙雷氏菌(serratia marcescens)sl11在镉溶液中的生长曲线。[0046](2)实验结果：实验表明，添加100mg/l cd2+对于无色杆菌(achromobacterinsuavis)sl8、肠杆菌(enterobacter cancerogenus)sl12、产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)sl7和沙雷氏菌(serratia marcescens)sl11的生长都有影响，在此浓度下，细菌生长虽然受到抑制，但是其浓度也都能达到1011cells/ml以上。因此，适当浓度的镉环境对于四种细菌的生存影响不大。[0047]实施例4复合菌剂对植物病害的防治效果。[0048]实验设置16处理，选取6-7周长势一致的辣椒，采用表1中编号1-16的复配组合方式处理辣椒土壤(设置3个重复，每个重复30株辣椒)，施用量为50μl/ 每株；3天后采用疫霉菌液(3×108cfu/ml))和灰霉病致病菌液(3×108cfu/ml)) 处理，处理量各50μl/每株，20天后观察辣椒发病情况，当辣椒躯干或叶片或根或果实出现病变，统计为发病；反之，正常。按照下列公式计算防治效果：防治效果＝((对照发病率-处理发病率)/对照发病率)×100％；结果如表2所示；[0049]表2复合菌剂对植物病害的防治效果表[0050][0051][0052]实验结果：组号1-10的处理对辣椒疫病防治效果为93.02-97.67％；对灰霉病的防治效果为92.77-98.80％；相比对照组16，显著降低了辣椒疫病和灰霉病的发病率，具有良好的防治效果。









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