用于癌症免疫治疗的生物标记物及其用途的制作方法 专利技术说明

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及用于癌症免疫治疗的生物标记物及其用途。背景技术：2.肿瘤细胞以多种方式作用于宿主免疫，以逃避肿瘤微环境中的免疫防御。这种现象通常被称为“癌症免疫逃逸”。该系统中最重要的组成部分之一是由程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)受体及其配体程序性死亡配体(pd-l1)介导的免疫抑制协同信号(免疫检查点)。3.pd-1受体和pd-l1配体在免疫调节中起重要作用。在激活的t细胞上表达的pd-1被pd-l1和pd-l2激活，pd-l1和pd-l2由基质细胞、肿瘤细胞或两者表达，通过这一点，t细胞死亡和局部免疫抑制被启动，为肿瘤的发展和生长提供潜在的免疫耐受环境。相反，抑制这种相互作用可以增强局部t细胞反应并介导抗肿瘤活性(iwai y等，proc natl acad sci usa 2002；99:12293-97)。4.因此，癌症免疫治疗，特别是免疫检查点抑制剂，最近已被开发成一种通过激活人体免疫系统来杀死癌细胞的疗法，并用于癌症治疗。作为应用最广泛的免疫检查点抑制剂，有使用抗pd-1或pd-l1单克隆抗体的抑制剂。这些抑制剂通过抑制t细胞表面上的pd-1和癌细胞表面上的pd-l1的结合来消除癌细胞，从而激活t细胞等免疫细胞，据报道，这些抑制剂显著提高了癌症患者的存活率，一些患者几年内没有癌症复发。5.使用抗pd-1和pd-l1单克隆抗体的抑制剂仅对表达pd-l1的癌细胞有效。因此，这些抑制剂仅适用于在使用pd-1和pd-l1抑制剂之前通过分析癌组织中pd-l1的表达来表达pd-l1的癌症。然而，据报道，50％或更多表达pd-l1的癌症患者对pd-1和pd-l1抑制剂没有反应，但原因仍不清楚。因此，为了使用靶向pd-1和pd-l1的癌症免疫治疗剂有效治疗癌症，应澄清表达pd-l1的癌细胞对pd-1和pd-l1抑制剂无反应的原因，并基于此迫切需要选择对pd-1及pd-l1抑制剂具有高治疗效果的患者。技术实现要素：技术问题6.本发明旨在解决相关技术中的上述技术问题，本发明的目的是提供一种用于预测癌症免疫治疗剂的治疗反应的组合物或试剂盒，或一种用于提供关于使用该组合物或试剂盒的癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后预测的信息的方法等。7.更具体地说，本发明人确认，当发育调控的gtp结合蛋白2(drg2)基因或drg2蛋白的表达水平降低时，尽管癌细胞中有pd-l1的表达，但能够杀死癌细胞的t细胞被激活。因此，本发明人确认，drg2的表达水平与癌细胞中pd-l1的表达和凋亡t细胞的激活两者相关，并且可以通过测量drg2的表达水平预测癌症免疫治疗剂对pd-l1阳性癌症的治疗反应，从而完成本发明。8.因此，本发明的一个目的是提供用于预测癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的组合物或试剂盒。9.本发明的另一个目的是提供用于预测pd-l1阳性癌症中癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的伴随诊断的组合物或试剂盒。10.本发明的另一个目的是提供一种用于提供用于预测癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的信息的方法。11.本发明的又一个目的是提供一种用于提供用于预测pd-l1阳性癌症的癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的信息的方法。12.然而，本发明要解决的技术问题不限于上述技术问题，其他尚未提及的技术问题将由本发明所属领域的普通技术人员从以下描述中清楚地理解。技术方案13.本发明提供了一种用于预测癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的组合物，其包括测量发育调节的gtp结合蛋白2(drg2)基因或drg2蛋白水平的制剂。14.此外，本发明提供了一种用于预测癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的试剂盒，其包括用于预测肿瘤免疫治疗剂治疗反应或预后的组合物。15.此外，本发明提供了一种用于预测pd-l1阳性癌症中癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的伴随诊断的组合物，其包括测量drg2基因或drg2蛋白水平的制剂。16.此外，本发明提供了一种用于伴随诊断以预测pd-l1阳性癌症中癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的试剂盒，其包括用于预测pd-l1阳性癌症的癌症免疫治疗剂的治疗反应和预后的伴随诊断的组合物。17.在本发明的一示例性实施方案中，测量drg2基因水平的制剂优选可以是特异性结合drg2基因的引物或探针，但不限于此，只要该制剂是能够通过扩增整个drg2基因组序列或其一部分来测量drg2基因的表达水平的制剂即可。18.在本发明的另一示例性实施方案中，测量drg2蛋白水平的制剂可以优选为特异性结合drg2蛋白的抗体或适配体，并且抗体可以是整个抗体或其一部分，但该制剂不限于此，只要该制剂是能够结合drg2蛋白以测量蛋白的量的制剂即可。19.在本发明的又一示例性实施方案中，癌症免疫治疗剂可以是特异性结合程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)或程序性死亡配体1(pd-l1)的药物，但不限于此。20.在本发明的又一示例性实施方案中，特异性结合pd-1的药物可以是抗pd-1抗体，并且可以优选为帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)或西米普利单抗(cemilimab)等，但不限于此，只要该药物是已知特异性结合pd-1以用作癌症免疫治疗剂的药物即可。21.在本发明的又一个示例性实施方案中，特异性结合pd-l1的药物可以是抗pd-l1抗体，并且可以优选地是阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或德瓦鲁单抗(durvalumab)等，但不限于此，只要该药物是已知特异性结合pd-l1以用作癌症免疫治疗剂的药物即可。22.在本发明的又一示例性实施方案中，该组合物可以用于预测癌症免疫治疗剂对pd-l1阳性癌症的治疗反应或预后。例如，pd-l1阳性癌症可以是通过免疫组织化学检测确定为针对pd-l1表达为阳性的癌症，但不限于此，只要pd-l1阳性癌症是通过通常使用的用于确定pd-l1阳癌症的方法确定的pd-l1阳性癌症即可。23.在本发明的又一示例性实施方案中，与对照相比，该组合物可预测drg2基因或drg2蛋白的表达水平降低的癌症为对癌症免疫治疗剂的治疗反应低的癌症或预后差的癌症，但不限于此。对照可在从正常人(即无癌症的人)分离的生物样本中有drg2基因或drg2蛋白的表达水平，或者在癌组织周围的正常组织中而不是癌组织中有测量到的drg2基因或drg1蛋白的表达水平。24.在本发明的又一示例性实施方案中，该组合物可预测与对照相比其drg2基因或drg2蛋白的表达水平降低的pd-l1阳性癌症为对癌症免疫治疗剂治疗反应低的癌症或预后差的癌症，但不限于此。25.在本发明的又一个示例性实施方案中，drg2基因或drg2蛋白的表达降低可间接显示癌细胞表面上表达的pd-l1水平的降低，这可能显示癌细胞pd-l1和t细胞pd-1之间的结合的量降低，或可显示癌细胞中pd-l1的水平增高，以及cd8 t细胞的数量或其活性增加，但不限于此。26.在本发明的又一示例性实施方案中，drg2基因或drg2蛋白的水平可优选地在从癌症患者分离的生物样本中测量，该生物样本为癌细胞、癌组织、血液、血浆、血清、骨髓、唾液、尿液、粪便等，优选癌细胞或癌组织，但不限于此，只要生物样本是包含drg2基因或drg2蛋白的样本即可。27.此外，本发明提供了一种用于提供用于预测癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的信息的方法，该方法包括：测量从癌症患者分离的生物样本中drg2基因或drg2蛋白的水平。28.此外，本发明提供了一种用于提供用于pd-l1阳性癌症中癌症免疫治疗剂的伴随诊断的信息的方法，该方法包括：测量从pd-l1阳性癌症患者分离的生物样本中drg2基因或drg2蛋白的水平。29.在本发明的示例性实施方案中，当drg2基因或drg2蛋白的水平与对照相比降低时，可以预测对癌症免疫治疗剂的治疗反应是低的或预后是差的，但预测并不限于此。30.此外，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，该方法包括：a)测量从癌症患者分离的生物样本中drg2基因或drg2蛋白的水平；b)选择其中与对照相比drg2基因或drg2蛋白的水平降低的患者；以及c)对所选择的患者施用癌症免疫治疗剂。31.此外，本发明提供了一种组合物的用途，该组合物包括测量发育调节的gtp结合蛋白2(drg2)基因或drg2蛋白的水平以预测癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的制剂。32.此外，本发明提供了一种组合物的用途，该组合物包括测量发育调节的gtp结合蛋白2(drg2)基因或drg2蛋白的水平以选择施用癌症免疫治疗剂的患者的制剂。有利效果33.本发明的drg2是癌症患者对pd-l1阳性癌症中癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的预测因子，并且是可用于伴随诊断以确定pd-l1阳性癌症中癌症免疫治疗剂的施用的生物标记物。具体而言，在测量pd-l1阳性癌症组织细胞内和/或表面上存在的drg2的量后，可以分析所测量的drg2的量，以确定是否施用癌症免疫治疗剂。通过本发明的选择方法确定是否施用癌症免疫治疗剂，癌症免疫治疗剂可以选择性地施用给将显示出高的治疗效果的患者，从而有望更有效地治疗pd-l1阳性癌症。附图说明34.图1示出了临床数据库中高pd-l1表达和低drg2表达之间的相关性。kd b16f10细胞裂解物中的pd-l1脱糖基化的蛋白免疫印迹结果(左)和相应的图(右)。55.图5b示出了共焦显微镜图像(左)，其显示了对照和drg2kd黑色素瘤细胞中经ifn-γ处理或未处理后pd-l1的蛋白表达，以及相应的图(右)。红色荧光表示pd-l1，蓝色荧光表示细胞核。56.图5c示出了共焦显微镜图像(左)，显示了对照和drg2 kd人卵巢癌细胞(skov3)中经ifn-γ处理后pd-l1的蛋白表达，相应的图(右上行)显示了细胞表面上表达的pd-l1比率，以及确认drg2 kd和ifn-γ的作用的蛋白免疫印迹结果(右下行)。红色表示pd-l1，蓝色表示细胞核。57.图6是示意性示出了根据drg2表达水平的变化癌细胞表面上pd-l1表达水平的变化，以及癌细胞表面上pd-l1与t细胞的pd-1之间的相互作用的相应变化。具体实施方式58.本发明人关注这样的事实，即当对pd-l1阳性癌症患者施用癌症免疫治疗剂时，癌症免疫治疗剂仅对20％至30％的癌症患者表现出治疗效果，并且本发明人已经对用于选择患者以施用癌症免疫治疗剂的方法进行了深入研究。因此，他们确认，在drg2基因或drg2蛋白表达降低的患者的情况下，pd-l1通常不位于细胞表面，导致癌症免疫治疗剂的治疗效果降低，从而完成本发明。更具体地说，总体上已经确认，当pd-l1的表达增高时，由于免疫细胞(如t细胞)的激活减少，存活率降低，但当drg2基因或drg2蛋白的表达降低时，pd-l1的表达增高，但癌症的生长受到抑制。在这方面，作为详细研究的结果，已确认当drg2基因或drg2蛋白的表达降低时，表达增高的pd-l1并不正常地位于细胞表面上，因此，与pd-1的结合程度降低。也就是说，尽管针对pd-1或pd-l1的癌症免疫治疗剂通过抑制pd-1和pd-l1结合而表现出癌症免疫治疗剂的疗效，但可以确认，癌症免疫治疗剂不能作用于drg2基因或drg2蛋白表达水平降低的癌症。也就是说，可以确认的是，现有的仅测量pd-l1表达水平并施用癌症免疫治疗剂的方法无法准确选择能够显示癌症免疫治疗剂的疗效的患者。因此本发明通过提供选择其中drg2基因或drg2蛋白表达增高的癌症患者，或选择作为pd-l1阳性癌症患者同时其drg2基因或drg2蛋白表达增强的癌症患者作为要施用癌症免疫治疗剂的患者的方法，来显著增强癌症免疫治疗剂的治疗效率，因此有望有效降低癌症患者的疼痛和治疗成本。59.在本说明书中，发育调控的gtp结合蛋白2(drg2)是参与各种细胞内调节的蛋白，并且已知形成大的超家族，这个超家族有三个重要的亚家族：三聚体g蛋白(例如，转导蛋白)、单体g蛋白(例如ras)，以及参与蛋白质合成的gtpase(例如，延伸因子tu)，最近，从这些亚家族中发现了新的具有不同碱基序列和功能的g蛋白组。发育调节的gtp结合蛋白(drg)是其中之一，它具有与gtp结合所需的g1到g5的所有五个区域，并且在大小上与三聚体g蛋白相似。然而，drg具有不仅与三聚体g蛋白，而且与现有的g蛋白亚家族完全不同的氨基酸序列特征，因此被归类为新的亚家族。60.此外，drg包括drg1和drg2，存在于从细菌到人类的几乎所有类型的细胞中。例如，已确认drg存在于红皮盐杆菌(halobacterium cutirubrum)、嗜酸热原体(thermoplasma acidophilum)、詹氏甲烷球菌(methanococcus jannaschii)、秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、黑腹果蝇(drosophila melanogaster)、非洲爪蟾(xenopus laevis)、拟南芥(arabidopsis thaliana)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)等中。然而，目前尚不清楚drg2与癌细胞中pd-l1的表达和凋亡t细胞的激活有关。61.在本说明书中，drg2的基因或蛋白的水平(或表达水平)在某种意义上用来包括drg2基因的mrna表达水平和由此表达的drg2蛋白的表达水平两者。在本说明书中，基因的水平(表达水平)是确认生物样本中drg2基因的mrna的存在或缺失和/或其表达程度的过程，以便预测癌症免疫治疗剂的治疗效果，并且可以通过测量mrna的量来确认。这方面的分析方法包括逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)、竞争性rt-pcr、实时rt-pcr、核糖核酸酶保护试验(rpa)、northern印迹法、rna测序(rna-seq)、纳米串、dna微阵列芯片等，但不限于此，只要该方法是能够测量mrna表达水平的方法即可。此外，在本说明书中，蛋白的水平(表达水平)是确认生物样本中由drg2基因编码的蛋白的存在或缺失以及表达水平的过程，以便预测癌症免疫治疗剂的治疗效果，并且可以通过使用特异性结合蛋白的抗体或适配体来确认蛋白的量，或者通过测量蛋白的活性来发现。这方面的分析方法包括蛋白免疫印迹法(western blotting)、酶联免疫吸附试验(elisa)、放射免疫分析、放射免疫扩散、ouchterlony免疫扩散、rocket免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀试验、完全固定试验、荧光激活细胞分选(facs)、蛋白芯片、配体结合试验、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(maldi-tof)分析、表面增强激光解吸/电离飞行时间光谱(seldi-tov)分析、二维电泳分析、液相色谱-质谱(lc-ms)、液相色谱-质谱/质谱(lcms/ms)等，但不限于此，只要该方法是能够测量蛋白表达水平的方法即可。62.如本文所用，“伴随诊断”是指用于确定将特定治疗药物施用于特定患者的可行性的诊断试验之一，并且在本发明中，癌症患者中drg2的表达水平可以作为伴随诊断标记进行测量，以便确认对患有pd-l1阳性癌症的患者施用癌症免疫治疗剂(例如抗pd-1抗体)的可能性。63.如本文所用，“提供用于预测癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的信息的方法”涉及一种预测癌症免疫治疗剂的治疗效果并通过预测来预测预后的方法，是指一种用于获取癌症免疫治疗剂对drg2基因或drg2蛋白表达降低的患者的治疗效果可能较低的可能性的信息的方法。64.在本说明书中，测量drg2基因水平的制剂可以是特异性结合drg2基因的引物或探针，但不限于此。引物或探针具有与本发明的生物标记物(drg2)核苷酸序列互补的序列。如本文所用，术语“互补”是指具有能够在任何特定杂交或退火条件下选择性地与上述核苷酸序列杂交的足够的互补性。因此，由于术语“互补”具有不同于术语“完全互补”的含义，本发明的引物或探针可以具有一个或多个不匹配的碱基序列，同时能够选择性地与上述核苷酸序列杂交。65.如本文所用，术语“引物”是指在合适的温度下在合适的缓冲溶液中在合适的条件下(即四种不同类型的三磷酸核苷和聚合酶)可作为与模板序列合成的起始点的单链寡核苷酸。引物的合适长度可以根据各种因素(例如温度和引物的使用)而变化，但通常为15到30个核苷酸。短引物分子通常需要较低的温度以与模板形成足够稳定的杂合物。引物可以由本领域技术人员通过参考上述核苷酸序列容易地设计，并且可以使用例如引物设计程序(例如：primer 3程序)来生产。66.如本文所用，术语“探针”是指天然或改性单体或键的线性低聚物，可以包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，可以特异性地与靶标核苷酸序列杂交，并且是自然存在或人工合成的。67.在本说明书中，测量drg2蛋白水平的制剂可以是特异性结合drg2蛋白的抗体或适配体，但不限于此。68.抗体是指将drg2蛋白的一部分或全部识别为抗原位点，以特异且直接结合到抗原位点，并且包括所有多克隆抗体、单克隆抗体或其片段。此类抗体可由本领域技术人员已知的公知方法制备。也就是说，单克隆抗体可使用本领域广泛已知的融合方法、重组dna方法或噬菌体抗体文库技术制备。69.适配体是单链dna或rna分子，可通过使用寡核苷酸文库(称为通过指数富集的配体系统进化(selex))的进化方法分离与具有高亲和力和选择性的特定化学分子或生物分子结合的低聚物来获得。适配体可以特异性地结合到靶标以调节该靶标的活性，例如，可以通过结合阻断靶标的功能活性。70.如本文所用，“癌症免疫治疗剂”是指完全或部分抑制、干扰或调节一个或多个免疫检查点蛋白(也称为免疫检查点抑制剂)的材料。免疫检查点蛋白调节t细胞的激活或功能。已知许多免疫检查点蛋白，例如pd-1、pd-l1、ctla-4等。这些蛋白参与t细胞反应的共刺激或抑制相互作用。癌症免疫治疗剂可包括抗体或可衍生自抗体。71.在本说明书中，癌症免疫治疗剂可以是特异性结合程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)的药物，但不限于此。在具体实施方案中，特异性结合pd-1的药物可以是抗pd-1抗体，并且抗pd-1的抗体的例子包括帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)或西米普利单抗(cemilimab)等。72.在本说明书中，癌症免疫治疗剂可以是特异性结合程序性细胞死亡配体1(pd-l1)的药物，但不限于此。在具体实施方案中，特异性结合pd-l1的药物可以是抗pd-l1抗体，并且抗pd-ll抗体的例子包括阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或德瓦鲁单抗(durvalumab)等。[0073]“抗体”是特异性结合免疫检查点蛋白(如pd-1、pd-l1和ctla4)以显示免疫检查点抑制活性的材料。抗体的范围不仅包括完整的抗体，而且包括抗体分子的抗原结合位点。[0074]如本文所用，癌症是指恶性实体瘤，预计它将与各种血液癌症一起无限生长，这些血液癌症起源于缺氧骨髓中的干细胞，可通过浸润局部扩散并且通过转移全身扩散。虽然不特别限于此，但癌症的具体例子包括肾上腺癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管癌、结肠癌和/或直肠癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、神经组织癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状旁腺癌、皮肤癌、胃癌和甲状腺癌。其他癌症例子包括腺癌、腺瘤、基底细胞癌、宫颈发育不良和上皮癌、尤文氏肉瘤(ewing's sarcoma)、鳞状细胞癌、腋窝细胞癌、恶性脑瘤、母细胞瘤、肠神经节神经瘤、增生性角膜神经癌、胰岛细胞癌、卡波西癌(kaposi cancer)、平滑肌瘤、白血病、淋巴瘤、恶性类癌、恶性黑色素瘤、恶性高钙血症、类马方氏综合症体质癌(marpanoid habitus cancer)、髓样癌、转移性皮肤癌、粘膜神经瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、丝状肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、卵巢癌、嗜铬细胞瘤、真性红细胞增多症、原发性脑肿瘤、小细胞肺癌、溃疡性和乳头状鳞状细胞癌、精原细胞瘤、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肾细胞瘤或肾细胞癌、网状细胞肉瘤和维耳姆斯瘤(wilms'tumor)。癌症的具体例子还包括星形细胞瘤、胃肠道间质瘤(gist)、胶质瘤或胶质母细胞瘤、肾细胞癌(rcc)、肝细胞癌(hcc)和胰腺神经内分泌癌。优选地，癌症可选自由以下组成的组：肺癌、胃癌、胶质瘤、肝癌、黑色素瘤、肾癌、尿路上皮癌、头颈癌、梅克尔细胞癌(merkel-cell carcinoma)、前列腺癌、恶性血液系统肿瘤、乳腺癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、脑癌、卵巢癌、膀胱癌、支气管癌、皮肤癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、甲状腺癌、骨癌及其组合，但不限于此。[0075]在本发明中，本发明组合物可用于预测pd-l1阳性癌症中癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后，但不限于此。pd-l1阳性癌症可以是通过免疫组织化学分析确定针对pd-l1表达为阳性的癌症，并且通过用于通过免疫组化分析确定pd-l1阳性或pd-l1阴性癌症的方法和用于此的试剂盒(例如pd-l1 ihc 22c3 pharmdx，它是keytrudatm的伴随诊断试剂盒)是已知的。[0076]pd-l1伴随诊断试剂盒(例如，pd-l1 ihc 22c3 pharmdx)在染色期间对细胞膜和细胞质两者中的pd-l1进行染色，以确定pd-l1的表达程度，并且在pd-l1阳性癌症(肿瘤比例评分≥50％)的情况下，以使用癌症免疫治疗剂(例如keytruda)作为治疗剂的方式使用。也就是说，是否施用癌症免疫治疗剂的决定基于癌组织中表达pd-l1的癌细胞的比例。癌pd-l1具有抑制cd8 t细胞的机制，从而进一步促进癌症的生长。相反，癌症免疫治疗剂是通过抑制pd-l1从而增加t细胞活性来治疗癌症患者的方法。为了进行这种治疗，pd-l1需要在癌组织中得到良好表达。当癌症免疫治疗剂施用于pd-l1表达差的癌症患者时，几乎没有治疗效果。[0077]在本说明书中，“pd-l1阳性”可以指至少约1％的pd-l1表达。pd-l1的表达可通过相关技术领域已知的任何方法进行测量。例如，pd-l1蛋白的表达可通过免疫组织化学(ihc)进行测量。由于通过ihc进行测量，因此pd-l1阳性癌症(肿瘤)可以是至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％或至少约20％的肿瘤细胞表达pd-l1的癌症。[0078]在本发明中，本发明试剂盒是指能够通过测量样本中drg2基因或drg2蛋白的水平来预测癌症免疫治疗剂的治疗效果的诊断设备，但不限于此，只要试剂盒是能够确认从癌症患者分离的生物样本中drg2基因或drg2蛋白的量的形式即可。该试剂盒可以是基因扩增试剂盒、微阵列芯片等形式，但不限于此。术语“扩增”是指扩增核酸分子的反应。本领域已经报道了各种扩增反应，例如在美国专利no.4683195、no.4683202和no.4800159中公开的聚合酶链反应(pcr)。在微阵列中，可以包括探针，并且探针用作可杂交阵列元件并固定在底物上。优选的底物是合适的刚性或半刚性支撑物，其示例可以包括膜、过滤器、芯片、载玻片、晶片、纤维、磁性或非磁性珠、凝胶、管、板、聚合物、微粒和毛细管。上述可杂交阵列元件被布置并固定在气体上。这种固定可通过化学键合方法或共价键合方法(如uv)进行。应用于本发明微阵列的样本可以被标记，并与微阵列上的阵列元件杂交。杂交条件可以不同。杂交程度的检测和分析可以根据标记材料进行不同的操作。此外，本发明的试剂盒可以额外包括家政基因、β-肌动蛋白等作为对照。[0079]如本文所用，术语“参考值或对照”是指区分基因(mrna)或蛋白质的过表达/欠表达的参考值。例如，参考值可以是正常人的平均mrna/蛋白表达水平，或者癌组织周围正常组织的平均mrna/蛋白表达水平，但不限于此。此外，参考值或对照可由特定患者组的平均mrna/蛋白表达水平的分布决定，但不限于此。[0080]下文将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例只是为了可以更容易地理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。[0081][实施例][0082]实验材料和实验方法[0083]细胞培养[0084]小鼠黑色素瘤b16f1和b16f10细胞系以及人卵巢癌skov3细胞系购自korean cell line bank(kclb，韩国首尔)。细胞在湿度为5％的co2气氛下，在37℃的温度下在补充10％的牛胎血清(韩国welgene)的dmem培养基中培养。通过在多气体培养箱(galaxy r，new brunswick scientific)中培养细胞来测试缺氧对b16f10细胞系中基因表达的影响，该培养箱保持由93％n2、5％co2和2％o2组成的气体混合物。[0085]1-1.实验动物[0086]从orient bio(韩国釜山)购买6周龄雌性c57bl/6小鼠。这些小鼠是在釜山大学的实验动物设施中，在特定的无病原体条件下繁殖的，并根据釜山大学动物护理和使用委员会(the animal care and use committee of university of ulsan)的指南使用。[0087]tcga(癌症基因组图谱)数据分析[0088]使用基因表达谱交互分析(gepia)，基于tcga肿瘤中pd-l1(cd274)基因表达与tcga正常和gtex数据进行总体存活率(os)分析。关于假设检验，gepia考虑了对数秩检验。cd274高表达和低表达队列基于50％(中位数)的cd274表达阈值进行分类。因此，cd274表达水平高于或低于50％的样本分别分类为高表达队列(截止高)和低表达队列(截止低)。使用基因表达谱交互分析(gepia)获得了包括若干患者的drg2表达谱和临床信息在内的数据。获得了样本水平(每百万转录本的每千碱基的片段数(fpkm)归一化)。[0089]质粒、sirna、转染和报告基因检测[0090]从sigma购买了小鼠drg2的质粒建构体plko-drg2-shrna，包括shrna(drg2-shrna,trc0000047195,5'-ccgggctcatcctacatgaatacaactcgagttgtattcatgtaggatgagctttttg-3'(seq id no:25))和非靶向shrna对照载体(missionplko.1-puro非哺乳动物shrna对照质粒dna，shc002)。小鼠/人类的sirna(sidrg2，5'-cauugaauacaaaggugccaaca-3'(seq id no:26))和对照sirna(scrna)购自genepharma。[0091]为了产生drg2缺陷细胞，用plko-drg2-shrna转染b16f10细胞，并用嘌呤霉素(sigma p9620)选择b16f10/shdrg2。使用plko.1-puro中的非靶向shrna产生对照细胞b16f10/plko。使用turbofect(thermo scientific)转染细胞。为了监测转染效率，将gfp表达载体pegfp-n1/c1(clontech)与质粒构建体共转染。在确认转染效率(》80％)后，将细胞用于进一步研究。[0092]实时和半定量rt-pcr[0093]使用trizol试剂(invitrogen)从细胞中提取总rna。使用nanodroptm 2000系统(thermo fisher scientific，waltham，美国ma)测量rna浓度后，使用2μg总rna和m-mlv逆转录酶(promega)合成cdna，并使用表1所示的基因特异性引物将cdna作为实时和半定量pcr的模板。使用abi 7500快速实时pcr系统(applied biosystems)，使用sybr green pcr master mix(qiagen)进行实时qrt-pcr。使用taq聚合酶(韩国大田solgent)进行半定量rt-pcr。[0094][表1][0095]蛋白免疫印迹法[0096]对于脱糖分析，通过sds-page分离细胞提取物或浓缩上清液中的蛋白质，并将蛋白质分别用抗drg2(proteintech)、小鼠抗pd-l1(abcam)、抗磷酸stat1(cell signaling)和抗β-肌动蛋白(sigma)稀释液处理。使用pierce ecl蛋白免疫印迹法底物(thermo scientific)检测免疫反应性带。[0097]pd-1和pd-l1相互作用测定[0098]为了测量pd-1和pd-l1蛋白的相互作用，将悬浮细胞在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，并与重组人pd-1fc蛋白(r&d systems)孵育1小时。使用抗人alexa fluor 488染料偶联物(life technologies)作为二级抗体。将细胞核用dapi(蓝色；life technologies)染色。然后，使用facs流式细胞术分析仪(becton dickinson，inc.)测量alexa fluor 488染料的荧光强度。[0099]免疫细胞化学[0100]对于免疫细胞化学分析，将细胞在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，用5％tritonx-100渗透5分钟，然后用一级抗体染色。作为二级抗体，使用了抗鼠alexa fluor 488或594染料偶联物和/或抗兔alexa floor 488或594染料偶联物(life technologies)。将细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi；蓝色；life technologies)染色。安装后，使用奥林巴斯1000/1200激光扫描共聚焦系统观察细胞。[0101]共培养和il-2测量[0102]为了分析肿瘤细胞对t细胞失活的影响，将肿瘤细胞与用小鼠t-activator cd3/cd28(life technologies)激活的小鼠脾脏cd4 t细胞共同培养。将肿瘤细胞以5:1(jurkat：肿瘤细胞)的比率培养48小时。使用小鼠il-2elisa试剂盒(thermo scientific)测量分泌到培养基中的il-2水平。[0103]统计显著性[0104]所有实验至少重复三次，结果显示为平均值±标准偏差。学生t检验确认了统计显著性，当p《0.05时，确定具有统计显著性。ns表示不显著，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001，****表示p《0.00001。[0105]实验结果[0106]实施例1.pd-l1与存活率之间相关性的确认[0107]已知的是，使用临床数据确认了当pd-l1水平为高时显示存活率是否为低。结果如图1a和1b所示。[0108]如图1a所示，已确认pd-l1水平高的癌症患者表现出低的存活率。由于确认了drg2在此类患者中的表达水平，因此确认了与正常周围组织相比，癌细胞中drg2的表达增高。[0109]相反，如图1b所示，由于确认了pd-l1水平高但存活率高的患者中drg2的表达水平，因此与正常周围组织相比，癌细胞中drg1的表达降低。[0110]通过这一点，可以确认高水平的pd-l1并不一定显示出低存活率，正如之前所知，存活率取决于drg2的表达程度而不同。[0111]实施例2.根据drg2表达水平确认癌症生长和免疫细胞分布[0112]为了确认drg2表达水平对癌症的影响，将癌症注射到小鼠中，并确认癌症生长和免疫细胞分布。结果如图2a至2e所示。[0113]图2a示出了qrt-pcr(左)和蛋白免疫印迹(右)实验的结果，显示drg2敲除黑色素瘤中drg2的水平降低。如图2a所示，确认转染shdrg2的细胞具有降低的drg2表达。[0114]图2b示出了将细胞(plko/b16f10或shdrg2/b16f10)皮下注射到小鼠侧腹部后测量癌症随时间生长的结果。如图2b所示，已确认当将drg2水平降低的癌细胞(shdrg2/b16f10)注射到小鼠中时，与对照(plko/b16f10)相比，癌细胞生长受到抑制。[0115]进行流式细胞术以确认上述癌症生长的差异是否是由于癌症周围免疫细胞分布的差异所致(图2c)。癌症周围存在各种免疫细胞，而直接杀死癌症的主要细胞是凋亡t细胞(cd8t细胞)。因此，确认了cd8+ifn-γ+t细胞(cd8 t细胞的激活形式)在drg2水平降低的癌组织中的分布。结果如图2c所示。如图2c所示，确认shdrg2/b16f10癌组织中cd8+ifn-γ+t细胞显著增加，但其他免疫细胞(间接影响cd8 t细胞的细胞)与对照无差异。由此确认，当癌细胞中drg2水平降低时，癌细胞不能调节cd8 t细胞的活性，这种活性调节不是通过其他免疫细胞的机制实现的，而是通过与cd8 t细胞的相互作用直接实现的。[0116]癌组织表面蛋白的量在调节t细胞中起重要作用，通过qrt-pcr在mrna水平上得到确认。结果如图2d所示。如图2d所示，由于确认了在drg2水平降低的癌症组织中激活和抑制t细胞的表面蛋白，因此确认抑制t细胞活性的pd-l1基因的表达水平增高。[0117]进行蛋白免疫印迹和流式细胞术以确认是否在蛋白质水平上表现出相同的效果。结果如图2e所示。如图2e所示，与mrna结果类似，已确认在drg2水平降低的癌组织中pd-l1蛋白水平增高。[0118]通过上述结果，众所周知，癌组织中pd-l1表达的增高会抑制t细胞的激活，从而促进肿瘤的生长和转移，可以确认，在drg2水平降低的癌组织中，pd-l1水平升高，但t细胞被激活以抑制肿瘤的生长。[0119]实施例3.drg2表达水平对pd-l1表达影响的确认[0120]进行体外实验以确认drg2水平降低对pd-l1的直接影响。结果如图3a至3f所示。为了模拟t细胞与癌组织之间的相互作用，将培养基与细胞因子ifn-γ联合处理，以增高pd-l1的表达，并进行实验。[0121]图3a中的上图显示了使用shdrg2降低drg2的水平，下图显示了使用sidrg2降低drg2水平。在人工降低drg2的水平后，通过qrt-pcr确认了ifn-γ诱导的pd-l1基因的水平。如图3a所示，确认当drg2水平降低时，pd-l1基因的表达增高。[0122]此外，通过流式细胞术确认pd-l1蛋白的水平。结果如图3b所示。如图3b所示，确认drg2的水平降低，pd-l1蛋白的量增加。[0123]图3c和3d示出了分别通过蛋白免疫印迹和qrt-pcr确认了stat1磷酸化(其是ifn-γ的主要激活途径)和irf1的表达程度的结果以便确认当drg2水平降低时pd-l1水平升高的机制。如图3c和3d所示，已确认drg2水平的降低显著增高了stat1磷酸化和ifn-γ对irf1的表达程度。此外，通过这一点，确认pd-l1的表达可以增高。[0124]图3e和3f示出了确认t细胞在体外的活性是否有与实施例2的体内实验结果不同的结果。癌细胞通过使用表面蛋白(如pd-l1)直接接触来抑制t细胞的活性，但也可以通过分泌细胞因子在不直接接触的情况下来调节t细胞。因此，当癌细胞和t细胞被共同培养以保持直接接触时(图3e的左视图)，以及当t细胞和癌细胞在未直接接触的情况下使用侵袭实验孔板进行共培养时(图3f的左视图(rt-qpcr测量结果)和右视图(elisa测量结果)，当t细胞使用已去除癌细胞的癌细胞培养液(调整培养基)培养时(图3e的右视图)，测量il-2的量。如图3e和3f所示，已经确认，只有当t细胞和癌细胞直接接触时(图3e的左视图)时，il-2的量才会增加，而当t细胞与癌细胞不直接接触时il-2的量没有显示出显著差异。通过这一点，确认t细胞的活性通过直接接触而增加。[0125]通过上述结果，确认drg2水平降低的癌细胞通过ifn-γ增高pd-l1的表达，并且只有当与t细胞直接接触时，t细胞才被激活。[0126]实施例4.确认drg2表达降低对pd-l1功能的影响[0127]为了确认pd-l1的表达水平升高但pd-l1在drg2水平降低的癌症中不正常发挥作用的原因，首先确认了t细胞表面蛋白pd-1与癌细胞表面蛋白pd-l1之间的结合程度。结果如图4a至4c所示。[0128]如图4a所示，当用pd-1蛋白治疗癌细胞时，使用流式细胞分析仪确认与pd-1蛋白结合的癌细胞量的结果是，确认与plko/b16f10+ifn-γ相比，shdrg2/b16f10+ifn-γ样本中与pd-1的接触进一步减少。[0129]图4b示出了重新确认图4a中使用的细胞中pd-l1的量的结果，确认当drg2的水平减少时，pd-l1的量增加。[0130]图4c示出了计算图4a中确认的与pd-1的接触的量与图4b中确认的pd-l1的量相比的结果，确认了当drg2的水平降低时，与pd-1接触的量与pd-l1水平相比显著降低。[0131]通过上述结果可以确认，癌症中pd-l1的表达增高，drg2水平降低，但t细胞的pd-l1与pd-1之间的结合的量反而减少。也就是说，可以确认，在癌细胞drg2水平降低的情况下，与t细胞的直接接触受到抑制，以增加t细胞的活性，而在pd-l1表达增高的情况下，其功能不能正常维持。[0132]实施例5.根据drg2水平的降低确认癌细胞中pd-l1功能恶化的机制[0133]为了确认drg2水平的降低增高pd-l1的表达但抑制pd-l1的功能的机制，确认了pd-l1糖基化程度和pd-l1在癌细胞中的位置。结果如图5a至5d所示。[0134]图5a示出了通过蛋白免疫印迹确认pd-l1的糖基化程度的结果(左)和对其进行量化的结果(右)，并且已知，当pd-l1糖基化不发生时，与pd-1的相互作用的效率降低。如图5a所示，确认了在pd-l1的完全糖基化的情况下，观察到尺寸为55kda的pd-l1，但当不完全糖基化部分被endo h裂解时，观察到尺寸为30至35kda的带。然而，已经确认，即使当drg2水平降低时，仍有大量未被endo h裂解的完全糖基化的pd-l1。通过上述结果，可以确认，当drg水平降低时，pd-l1的功能并未因糖基化不完全而表现出恶化。[0135]图5b示出了确认pd-l1的细胞内位置的结果。如图5b所示，已确认细胞中存在的pd-l1比例在drg2水平降低的癌细胞中较高。通过上述结果，这意味着pd-l1不能通过内吞作用移出细胞，而存在于细胞内，因此，可以确认，由于与pd-1的相互作用的效率降低，t细胞不能被激活。[0136]图5c示出了使用人类卵巢癌细胞系skov3的实验结果。如图5c所示，确认即使在使用sidrg2(左底视图)降低sidrg2s水平的人类癌细胞中，pd-l1的表达也通过ifn-γ增高，但pd-l1通常不位于细胞表面上。[0137]通过上述结果，可以确认pd-l1在癌症中的表达增高，drg2基因和/或drg2蛋白水平降低，但t细胞表面上pd-l1与pd-1之间的结合率降低，因为pd-l1不能正常定位在细胞表面上，pd-l1无法借此正常发挥作用。通过这一点，可以确认一种常用的癌症免疫治疗剂，即抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体等，通常不起作用，因此，只有20％-30％的pd-l1阳性癌症患者表现出癌症免疫治疗剂的治疗效果。[0138]因此，可以确认，通过测量生物样本中drg2基因或drg2蛋白的水平，可以选择可能表现出癌症免疫治疗剂治疗效果的患者，尤其是通常对pd-l1阳性癌症患者施用癌症免疫治疗剂，但是，通过测量pd-l1阳性癌症患者中drg2基因或drg2蛋白的水平，可以更有效地选择施用癌症免疫治疗剂的患者。用于预测本发明癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的组合物，或用于使用该组合物提供信息的方法，用于显著增强癌症免疫治疗剂的治疗效率，因此有望有效降低癌症患者的疼痛和治疗成本。[0139]本发明的上述描述是为了说明目的而提供的，本发明所属领域的技术人员将理解，本发明可以容易地修改为其他特定形式，而不会改变本发明的技术精神或基本特征。因此，应当理解，上述实施方案仅在所有方面具有示范性，并不具有限制性。工业实用性[0140]用于预测本发明癌症免疫治疗剂的治疗反应或预后的组合物，或用于使用该组合物提供信息的方法，与使用现有pd-l1来确定是否施用癌症免疫治疗剂相比，可以高精度确认对癌症免疫治疗剂的治疗反应。因此，所述组合物或方法可以更准确地确定是否对各种癌症患者施用癌症免疫治疗剂，并可以借此增强治疗效果，从而有望有效降低癌症患者的疼痛和治疗成本。









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