一种重组人β2微球蛋白及其单克隆抗体的制备方法与流程 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术gacactgatg 7014.ttctgaaagc ggacggtgca atcctggtag atttctgggc agaatggtgt ggcccatgca aaatgattgc 14015.tccgatcctg gacgagatcg ccgacgagta ccagggtaaa ctgactgtgg ctaaactgaa catcgaccaa 21016.aaccctggca ccgctccgaa atatggcatt cgtggcatcc cgaccctgct gctgtttaaa aacggtgagg 28017.tagctgctac taaagttggc gcgctgtcca agggccagct gaaagaattt ctggatgcaa acctggcgct 35018.ggaagtcctg ttccagggcc ctatccagcg taccccgaaa atccaggtgt acagccgtca cccggctgag 42019.aacggtaaat ctaacttcct gaactgttat gtttccggct tccacccgag cgatatcgaa gttgacctgc 49020.tgaaaaacgg tgagcgcatc gaaaaagtag aacacagcga tctgtctttc tccaaagact ggagcttcta 56021.tctgctgtac tacactgaat tcaccccgac cgagaaagac gaatacgctt gtcgcgttaa ccatgttacg 63022.ctgtctcagc cgaaaatcgt caaatgggac cgtgacatg 669。23.其中，所述纯化包括用辛酸-硫酸铵沉淀法及琼脂糖亲和介质proteina层析得到。24.其中，所述以pet28a(+)为表达载体，将t7启动子控制下的n-端融合了6个his标签、trx标签和pp酶酶切位点的β2-mg基因导入大肠杆菌进行诱导表达包括如下步骤：25.重组β2-mg表达菌株发酵，将bl21重组菌株溶解后置于种子培养基培养，并转接扩大培养，待菌体浓度od600上升至1.0左右时再转接至发酵培养基；26.菌体的收集与裂解，发酵结束后，收集菌体并利用pbs缓冲液冲洗，将洗涤后的菌体置于冰水混合物中超声破壁，并收集沉淀。27.其中，所述将大肠杆菌包涵体变性、复性包括如下步骤：28.用沉淀洗涤液洗涤所述沉淀，离心处理后收集洗涤后的沉淀；29.在洗涤后的沉淀中加入包涵体变性液重置沉淀，上下颠倒离心后收集上清液；30.将收集的上清液置于透析袋中，并将透析袋依次浸没在第一包涵体复性液、第二包涵体复性液和第三包涵体复性液中透析，再次离心后收集上清液，即可获取β2-mg融合蛋白粗提液。31.其中，所述沉淀洗涤液组成为：1l1×tris-hcl溶液(ph8.0)加入1％tritonx-100；32.所述包涵体变性液组成为：1l1×tris-hcl溶液(ph8.0)加入8m尿素，1mmedta；33.所述第一包涵体复性液组成为：1l1×tris-hcl溶液(ph8.0)加入2m尿素，1mmedta；34.所述第二包涵体复性液组成为：1l1×tris-hcl溶液(ph8.0)加入1m尿素，1mmedta；35.所述第三包涵体复性液组成为：1l1×tris-hcl溶液(ph8.0)加入1mmedta。36.一种重组人β2微球蛋白的单克隆抗体的制备方法，采用如上述所述的重组人β2微球蛋白，37.所述单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：38.将纯度≥95％的β2微球蛋白多次免疫balb/c小鼠后，取小鼠脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮筛选得到单克隆细胞株；39.制备单抗腹水并纯化，获得β2微球蛋白的单克隆抗体。40.本发明的一种重组人β2微球蛋白及其单克隆抗体的制备方法，通过提出一种重组人β2微球蛋白及其单克隆抗体的制备方法，进而使得本技术中的重组β2微球蛋白不仅具有活性，而且成本低廉，不受原料限制，可大规模生产，在临床诊断、体外诊断方面具有潜在而广泛的应用价值。附图说明41.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。42.图1是本发明的表达载体pet28a-6×his-trx-β2-mg的示意图。43.图2是本发明的包涵体变性复性及ni柱纯化的sds-page检测结果。具体实施方式44.本发明提供一种重组人β2微球蛋白及其单克隆抗体的制备方法，请参阅图1-图2，具体实施方式如下：45.重组β2-mg表达菌株发酵，将委托擎科生物有限公司构建好的活性良好的bl21(pet28a-6×his-trx-β2-mg)重组菌株从-20℃冰箱取出，溶解，取50ul菌液，加入到含有100ug/mlkan(卡那霉素)的5ml种子培养基中，混匀后，于37℃，220rpm条件下培养培养12-14h后按接种量10％转接至含有100ug/mlkan的50ml种子培养基中，37℃，220rpm条件下扩大培养约2-4h，当菌体浓度od600上升至1.0左右时再按接种量10％转接至含有100ug/mlkan的1000ml发酵培养基，所述发酵培养基组成为胰蛋白胨15g/l，酵母粉25g/l，mgso40.6g/l，na2hpo423g/l，nah2po45g/l，葡萄糖15g/l，ph7.2中，37℃，220rpm条件下扩大培养约1-2h，当菌体浓度od600上升至0.8时，加入iptg，使发酵液中iptg终浓度为0.5mm/l，放至18℃、220rpm摇床中继续培养12-14h。46.菌体的收集与裂解，发酵结束后将菌液离心，4℃下以5000rpm离心15min，弃上清，收集菌体，用与菌液等体积的冷的pbs缓冲液洗涤菌体，然后，4℃，6000rpm离心15min，收集菌体，菌体用发酵液体积的1/20的pbs重悬，置于冰水混合物中超声破壁，超声仪工作参数：超声功率75％，超声5s，间歇20s，总时间60min，报警温度20℃，菌体裂解液离心，4℃，9000rpm离心30min，收集沉淀，用于β2-mg融合蛋白变性及复性。47.包涵体变性与复性，用1/2发酵液体积的沉淀洗涤液洗涤沉淀，4℃9000rpm离心30min，收集沉淀，加入1/4发酵液体积的包涵体变性液重悬沉淀，上下颠倒30min，4℃，9000rpm离心30min，收集上清液，装入透析袋(截留分子量10kda)中扎好，然后将透析袋浸没在5l，4℃第一包涵体复性液里透析，12-14h时换成第二包涵体复性液继续透析12-14h，然后换成第三包涵体复性液继续透析12-14h。将透析袋里的溶液进行离心，4℃，9000rpm离心30min，收集上清液，即可得到可溶的β2-mg融合蛋白粗提液。相关溶液配方如下：48.沉淀洗涤液：1l1×tris-hcl溶液(ph8.0)加入1％tritonx-100。49.包涵体变性液：1l1×tris-hcl溶液(ph8.0)加入8m尿素，1mmedta。50.第一包涵体复性液：1l1×tris-hcl溶液(ph8.0)加入2m尿素，1mmedta。51.第二包涵体复性液：1l1×tris-hcl溶液(ph8.0)加入1m尿素，1mmedta。52.第三包涵体复性液：1l1×tris-hcl溶液(ph8.0)加入1mmedta。53.β2-mg融合蛋白纯化，β2-mg融合蛋白变性及复性液上清先采用镍离子亲和层析纯化的方法，nifocurose6ff填料装柱，用10倍柱体积去离子水清洗，再用10倍柱体积的nifocurose6ff平衡液平衡，平衡完毕后将裂解液上清过柱，过柱完毕后用10倍柱体积的nifocurose6ff洗杂液洗杂，最后加1.5-3倍体积的nifocurose6ff洗脱液洗脱，收集起峰的洗涤液(用蛋白检测仪检测)，该nifocurose6ff洗脱液即为β2-mg融合蛋白，相关溶液配方如下：54.nifocurose6ff平衡液：nah2po4·2h2o0.59g/l、na2hpo4·12h2o5.8g/l、nacl29.22g/l、ph7.455.nifocurose6ff洗杂液：nah2po4·2h2o0.59g/l、na2hpo4·12h2o5.8g/l、nacl29.22g/l、咪唑1.36g/l、ph7.456.nifocurose6ff洗脱液：nah2po4·2h2o0.59g/l、na2hpo4·12h2o5.8g/l、nacl29.22g/l、咪唑34.04g/l、ph7.457.β2-mg融合蛋白透析与酶切，将上述纯化收集的洗脱液装入透析袋(截留分子量10kda)，扎好，然后将透析袋浸没在5l，4℃，nifocurose6ff平衡液里透析，每12h时换一次nifocurose6ff平衡液，共换三次nifocurose6ff平衡液，将洗脱液中的咪唑去除，按每20mgβ2-mg融合蛋白加入1u的量加入3c酶，混匀，在4℃条件下进行酶切14-16h。58.β2-mg纯化，纯化采用镍离子亲和层析纯化的方法，填料装柱后先过10倍柱体积去离子水清洗，再用10倍柱体积的nifocurose6ff平衡液平衡，平衡完毕后融合蛋白酶切液过柱，过柱完毕后用10倍柱体积的nifocurose6ff洗杂液洗杂，最后加1.5-3倍体积的nifocurose6ff洗脱液洗脱，收集起峰的洗涤液(用蛋白检测仪检测)，该nifocurose6ff洗脱液即为β2-mg蛋白。59.小鼠免疫及细胞融合，取6只6-8周龄雌性balb/c小鼠进行免疫，每只小鼠首次免疫时按剂量为100ug/只在皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的重组β2-mg蛋白，之后每隔12-14天按剂量为100ug/只注射不完全佐剂乳化的重组β2-mg蛋白抗原进行加强免疫，连续加强2次，第3次免疫后7天每只小鼠经腹腔注射50ug重组β2-mg蛋白抗原再进行加强免疫，72h后眼眶取血，处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬浮液，细胞计数，按脾细胞数量的1/10-1/5取生长状态良好的sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，两种细胞混匀后1200rpm合离心10min，去除上清后在37℃水浴中加入聚乙二醇peg-1500使二者融合，另外再加入等体积的饲养细胞，混合后分置于96孔细胞板(200ul/孔)，在37℃、5％二氧化碳培养箱培养，3天与6天时进行半保留换液，10天后采用间接酶联免疫吸附法检验96孔细胞培养板中杂交瘤细胞的上清液。60.β2-mg单克隆细胞株的筛选，细胞融合后第10天时在显微镜下观察，选取有细胞集落的孔的上清液进行间接酶联免疫吸附法检测。具体方法如下：61.用包被液分别将重组β2-mg蛋白稀释至终浓度为1ug/ml，以100ul/孔加入酶标板，4℃包被12小时后通过洗板机用洗涤液洗涤3次并拍干，加入封闭液，200ul/孔，37℃封闭2小时，洗板机洗板3次，加待检细胞培养上清、阳性对照血清及阴性对照样本，100ul/孔，37℃孵育30min后，洗涤液洗涤3次并拍干，加hrp(辣根过氧化物酶)标记的兔抗鼠igg，100ul/孔，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤4次并拍干，每孔加显色液100μl/孔(1ml显色液a+1ml显色液b+0.4μl30％h2o2混合后使用，现配现用)，37℃避光显色10分钟后，加2m的h2so4终止反应，50ul/孔，最后用酶标仪450nm波长空白孔校零后读取od值，相关溶液配方如下：62.10×包被液母液(1l)：na2co315.9g，nahco329.3g，ph9.6，母液加9倍去离子水稀释后使用。63.10×封闭液母液(1l)：na2hpo4·12h2o26.8g，nah2po4·2h2o3.9g，nacl85g，200g牛血清白蛋白，ph7.4，母液加9倍去离子水稀释后使用。64.10×洗涤液母液(1l)：na2hpo4·12h2o26.8g，nah2po4·2h2o3.9g，nacl85g，tween-205ml，ph7.4，母液加9倍去离子水稀释后使用。65.10×显色液a母液(1l)：2gtmb溶于100ml无水乙醇，加去离子水定容至1l，母液加9倍去离子水稀释后使用。66.10×显色液b母液(1l)：柠檬酸21g，na2hpo4·12h2o710g，加去离子水定容至1l，母液加9倍去离子水稀释后使用。67.终止液(2mh2so4)：111.11ml浓h2so4加去离子水定容至1l。68.对检测od值高的阳性杂交瘤细胞进行克隆，再使用有限稀释法进行亚克隆，将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生长到全孔的1/6时在显微镜下观察，选出有单克隆的孔的上清液进行elisa检测，将检测od值最高的单克隆再进行有限稀释接入96孔板中，按如上所述的方法再次进行亚克隆，重复此过程直至阳性孔比率为100％，即可获得单克隆细胞株，经过3-5次亚克隆，共筛选出7株单克隆细胞株(3a5、5b1、3c5、7e3、3f6、2g7、6h8)，将这7株单克隆细胞株扩大培养，按2×106个细胞/管进行冻存。同时收集细胞为腹水制备做准备。69.β2-mg单克隆抗体制备及纯化，取14只6-8周龄的健康balb/c小鼠，按剂量为500ul/只在腹腔注射液体石蜡，3天后在腹腔注射单克隆细胞(约1.0×106个/只)，每一种单克隆细胞注射两只健康balb/c小鼠，7-12天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水，10000rpm离心10分钟，收集上清，按1：2的比例加入120mmol/lph4.0醋酸-醋酸钠缓冲液，用150mmol/lnaoh调ph4.5，按100ml腹水上清加入2.5ml正辛酸的比例在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温下搅拌40min后，4℃5000rpm离心30min，收集上清，将4℃的上清液按100ml上清液加入23g硫酸铵的比例缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温条件下搅拌40min后，5000rpm离心15min，收集沉淀，沉淀用腹水上清1/20体积的0.01mpbs缓冲液(ph7.4)复溶，将复溶液在0.01mpbs缓冲液(ph7.4)中透析至无硫酸铵后过0.45um滤膜，并用琼脂糖亲和介质proteina层析柱进一步纯化，用10倍柱体积的0.01mpbs平衡缓冲液(ph＝7.4)平衡琼脂糖亲和介质proteina层析柱，平衡完毕后将透析液过柱，过柱完毕后用10倍柱体积的pbs平衡缓冲液(ph＝7.4)洗杂，之后加1.5-3倍柱体积的0.1m甘氨酸(ph＝3.0)衡液洗涤，收集起峰的洗涤液(用蛋白检测仪检测)，最后将收集液用1mtrisbase把ph调至7.5，即得到高纯β2-mg单抗。70.通过上述方法可制备得3a5、5b1、3c5、7e3、3f6、2g7、6h8β2-mg单抗。71.辣根过氧化物酶标记β2-mg单抗的制备，取15mg辣根过氧化酶加入1ml含有150mm氯化钠0.02m磷酸盐的缓冲液中溶解。5分钟后加入0.1ml0.4m高碘酸钠，混匀后室温下避光反应30min，加入0.1ml甘油混匀，室温下静置30min。然后加入0.3ml1m碳酸盐缓冲液(ph9.6)，即可将醛基化的辣根过氧化酶稀释到10mg/ml，用1m碳酸盐缓冲液(ph9.6)分别将抗体稀释到2mg/ml，取1ml辣根过氧化酶加到2ml抗体溶液中，混匀，室温静置60min，加入3ul5m氰基硼氢化钠，混匀，室温静置15min，加入15ul1m乙醇胺，混匀，室温静置15min装入透析袋中，用150mm氯化钠0.02m磷酸盐缓冲液(ph7.2)于4℃透析24h，每8h小时换液一次，加入等体积50％无菌甘油，混匀后于-20℃保存，相关溶液配方如下：72.0.4m高碘酸钠：称取85.6mg高碘酸钠于1ml纯水中。73.5m氰基硼氢化钠：称取1.654g氰基硼氢化钠于5ml1m氢氧化钠中。74.1m乙醇胺:取300ul乙醇胺加到2.5ml纯水中，盐酸调ph值至9.6，定容到5ml。75.1m碳酸盐缓冲液ph9.6：称取31.8g碳酸钠和58.6g碳酸氢钠于1000ml纯水中。76.0.2m磷酸氢二钠：称取35.61g二水磷酸氢二钠，定容至1000ml。77.0.2m磷酸二氢钠：称取31.21g二水磷酸二氢钠，定容至1000ml。78.150mm氯化钠0.02m磷酸盐缓冲液ph7.2：取72ml0.2m磷酸氢二钠，28ml0.2m磷酸二氢钠和8.775g氯化钠，定容至1000ml。79.通过上述方法可制备得hrp标记的3a5、5b1、3c5、7e3、3f6、2g7、6h8β2-mg单抗。80.配对单抗的筛选，用包被液分别将7种β2-mg单克隆抗体(3a5、5b1、3c5、7e3、3f6、2g7、6h8)稀释到终浓度1ug/ml，以100ul/孔加入酶标板，4℃包被12小时后通过洗板机用洗涤液洗涤3次并拍干，加入封闭液，200ul/孔，37℃封闭2小时，洗板机洗板3次并拍干，加肾病患者临床血清标本及正常人血清标本，100ul/孔，37℃孵育30min后，洗涤液洗涤3次，加制备的hrp标记单抗，100ul/孔，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤4次并拍干，每孔加显色液100μl/孔(1ml显色液a+1ml显色液b+0.4μl30％h2o2混合后使用，现配现用)，37℃避光显色10分钟后，加2m的h2so4终止反应，50ul/孔，最后用酶标仪450nm波长空白孔校零后读取od值。81.通过述方法正交检测各包被单抗与酶标单抗配对情况，求肾病患者临床血清标本检测均值与正常人血清标本检测均值的比值。82.进一步的，所述重组β2-mg融合蛋白包涵体表达，经过超声破壁和离心后进行包涵体变性、复性，再经过nifocurose6ff柱进行纯化，得到纯度≥90％的β2-mg融合蛋白。83.进一步的，所述重组β2-mg蛋白为高纯免疫抗原，纯度纯度≥95％的，是将β2-mg融合蛋白透析、酶切及过nifocurose6ff柱纯化而得的。84.进一步的，所述发酵条件为按5％接种量将种子液接种至含有100ug/mlkan的1000ml发酵培养基中，37℃，220rpm条件下扩大培养约1-2h，当od600上升至0.8时，加入iptg，使发酵液中iptg终浓度为0.5mm/l，放至18℃、220rpm的摇床中继续培养12-14h。85.进一步的，所述发酵培养基含有胰蛋白胨15g/l，酵母粉25g/l，mgso40.6g/l，na2hpo423g/l，nah2po45g/l，葡萄糖15g/l，ph7.2。86.进一步的，所述β2-mg单克隆细胞株通过β2-mg蛋白多次免疫balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮筛选得到。87.进一步的，所述单克隆抗体通过制备单抗腹水并用辛酸-硫酸铵沉淀法及琼脂糖亲和介质proteina层析得到。88.进一步的，用纯化得到的β2-mg单抗进行辣根过氧化物酶标记，通过正交实验配对筛选确定最佳配对单抗组合。89.以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。









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