用于双靶标嵌合抗原受体T细胞疗法的蛋白酶开关 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术用于双靶标嵌合抗原受体t细胞疗法的蛋白酶开关1.相关申请的交叉引用2.本技术要求获得2019年10月30日提交的美国临时申请序列号62/927,898的利益，将该美国临时专利的公开内容(包括所有图纸、表格和氨基酸或核酸序列)通过引用全部纳入本技术。3.本技术的序列表被标记为“seq-list.txt”，其创建于2020年10月29日，大小为1,053kb。通过引用，将序列表的全部内容纳入本技术。背景技术：4.本节提供背景信息，以便于更好地理解本发明的各个方面。应当理解，本文件的本节陈述应以此解读，而不是作为现有技术的认可。5.利用通过基因工程靶向肿瘤抗原的自体细胞的过继性t细胞疗法已经彻底改变了针对血液恶性肿瘤的治疗。已经将靶向肿瘤抗原的合成嵌合抗原受体(car)用于转导t细胞(car-t细胞)，使其靶向表达肿瘤抗原的肿瘤。6.表达car的t细胞通过基因工程制备，并设计为用激活受体保护患者的免疫活性t细胞；所述激活受体包括：(1)免疫球蛋白的胞质外可变片段，例如针对肿瘤靶标的单链可变片段(scfv)；(2)胞内t细胞受体激活分子，例如cd3-ζ；(3)阳性共刺激分子，例如cd28和/或4-1bb。用载体(例如逆转录病毒或慢病毒载体)转化从患者身上获得的t细胞，所述载体将编码上述成分的所需dna序列转移到转导t细胞的基因组中，使得外源car在转导t细胞中表达。这些成分表达通常由启动子控制。所述启动子要么是组成型的，连续表达car成分；要么是诱导型的，仅当存在诱导剂时表达car成分。或者，启动子可以是内源调节的；只要在正常情况下由内源启动子控制的蛋白质表达，则启动子表达car成分。通常，在基因工程细胞中，诱导高水平蛋白质的强启动子是可取的。7.虽然大多数免疫活性t细胞用于表达car，但是任何能够被cd3-ζ和共刺激cd28和/或4-1bb分子激活的免疫细胞均可以用于表达car。8.表达car的患者的基因工程t细胞能够识别没有主要组织相容性复合体(mhc)限制的肿瘤靶等，并通过细胞毒性效应机制破坏靶。9.此外，可用造血干细胞供体的淋巴细胞来制备同种异体car-t细胞，并在同种异体移植后复发等情况下使用。10.使用car-t细胞的治疗方法包括：对患者t细胞进行淋巴细胞去除，为患者静脉输注后新制备的car-t细胞腾出空间。免疫去除还有可能减少残余肿瘤块、引发炎症、释放肿瘤抗原和减少调节性t细胞的数量减少调节性t细胞的数量；可抑制新输注的工程car-t细胞的功能。此外，如果car的任何成分都是非人类来源的，则淋巴细胞去除也可降低针对该car成分的免疫风险。在构建car的过程中使用人源化免疫球蛋白的可变片段也有助于降低针对car的免疫风险。11.car-t细胞注射到患者体内后无法控制，引发了安全问题。例如，在临床试验期间，观察到一些患者的靶/非靶抗原识别。此外，体内不受控制的car-t细胞作用可导致包括细胞因子释放综合征和car-t相关脑病综合征在内的严重不良事件。例如，car-t细胞疗法的两个主要安全性问题是细胞因子释放综合征和神经毒性，例如car-t细胞相关脑病综合征。不幸的是，细胞因子释放综合征相对频繁，并且大约50％至100％接受car-t细胞治疗的患者可能会出现这种综合征。此外，一般来说，t细胞的广泛激活，特别是car-t细胞的广泛激活，会导致t细胞死亡，从而导致car-t细胞群的衰竭。为了延长输注给患者后的car-t细胞寿命，需要控制car-t细胞的激活。这些安全性和有效性问题与无法控制car-t细胞的激活、扩增，更重要的是无法终止car在治疗性car-t细胞中的表达有关。因此，治疗性car-t细胞中car的时间和空间控制可以提高这一重要技术的安全性和功效，并且可以通过微调car-t细胞上的car表达水平来抑制细胞因子过度释放、car-t细胞衰竭等。此外，通过对car-t细胞进行car微调，car表达可以在缓解期停止，并在疾病复发时重新启用。12.car-t疗法的另一个问题是在car-t细胞治疗后没有反应和复发或反应和复发少，这与靶细胞上缺乏抗原表达有关。因此，使用靶向一种以上抗原的car-t细胞有助于解决这一问题。因此，需要开发新的car-t细胞疗法来解决安全性和有效性问题，提高靶细胞的潜在耐药性。技术实现要素：13.本发明提供了嵌合抗原受体(car)t细胞系统，以及系统的制备方法和使用系统治疗可用靶向免疫细胞治疗的疾病的方法。本发明的car-t细胞系统包括基于丙型肝炎病毒的非结构蛋白3(ns3)蛋白酶结构域的诱导型开关设计，从而微调基因工程car-t细胞中的car表达。通过这种设计，可以大大提高car t细胞疗法的安全性和效力。14.有利的是，即使car t细胞系统的ns3蛋白酶结构域在转导t细胞中默认自降解car，作为在不希望出现car的情况下，最大限度控制car表达和避免car在患者体内出现的手段。15.相反地，当需要car表达时，可以施用小分子抑制剂来抑制ns3结构域的蛋白水解活性，并阻断导致car在工程car-t细胞表面淮上表达的car自降解。此外，对用工程car-t细胞治疗的受试者进行所述小分子抑制剂的剂量相关施用，实现了对工程car-t细胞的car表达水平进行的微调，并且可以根据靶细胞的剩余负荷和/或细胞因子释放综合征等不良事件的发生情况进行调节。16.有利的是，本发明的car-t细胞系统可包括针对多种疾病相关抗原(包括但不限于癌症和/或免疫疾病相关抗原)的多个单链可变片段，以治疗癌症和/或免疫性疾病。17.还提供了car-t细胞系统，其同时靶向相同或不同靶细胞上的至少两种靶抗原，以提高治疗效果并降低不良事件的风险。18.例如，在一个实施例中，本发明提供了通过cd19-car和cd22-car的“组合给药(cocktail)”和/或cd19-car-t细胞和cd22-car-t细胞的“组合给药”来对b细胞白血病进行高效治疗。19.有利的是，本发明的car-t细胞系统结合了安全开关和双靶设计。例如，该策略同时靶向cd19和cd22，能够更广泛地覆盖b细胞恶性肿瘤，减少抗原逃逸导致的复发，并提高治疗效果。此外，新型蛋白酶开关系统精确调节car-t细胞活性，并避免体内car-t细胞的耗竭，因为可以停止car表达以防止car-t细胞过度激活并延长患者体内的car-t细胞寿命。因此，这种新型car-t细胞系统提高了car-t细胞疗法的安全性和效力。附图说明20.专利或申请文件包括至少一份彩色附图。由专利局应要求提供本专利或专利申请出版物的副本和彩色附图，并支付必要费用。21.图1a至图1c是本发明的car-t细胞系统图。图1a示出了靶细胞和t细胞通过car-肿瘤抗原(taa)结合事件相互作用。图1b示出了不存在和存在ns3抑制剂阿那匹韦(asv)的情况下，本发明的car在“关”和“开”状态下的详图。图1c示出了具有第一裂解位点(1cs)、第二裂解位点(2cs)和两个裂解位点的本发明所述的ns3-car构建体。黄线表示ns3裂解位点；红色箭头表示在不存在阿那匹韦时的情况下，ns3蛋白酶的裂解作用。22.图2示出了对照car(顶部)和ns3开关-car(底部)的car盒，用于转导t细胞以制备car-t细胞。23.图3示出了在未转导细胞、cd19-car转导细胞、用ns3-cd19-car转导但未用阿那匹韦处理的细胞和用ns3-cd19-car转导但用阿那匹韦处理的细胞中cd19-car表达的流式细胞术分析。24.图4a至图4b示出了在阿那匹韦浓度增加的情况下，car转导细胞中的car表达水平。图4a示出了通过流式细胞仪测定的car表达。图4b示出了在不同时间点和阿那匹韦不同浓度情况下的car表达细胞的百分比。25.图5a至图5b示出了停用阿那匹韦后car转导细胞中的car表达水平。图5a示出了停用阿那匹韦后24小时和48小时car表达的流式细胞术数据。图5b示出了在阿那匹韦存在下24小时和48小时时car表达的流式细胞术数据。26.图6a至图6b示出了存在和不存在阿那匹韦的情况下，car转导细胞的细胞死亡情况和cd4/cd8分布图。图6a示出了在阿那匹韦存在和不存在的情况下，未转导细胞、cd19-car转导细胞和用ns3-cd19 car转导的细胞的膜联蛋白v表达和丙啶碘染色的流式细胞术数据。图6b示出了在阿那匹韦存在和不存在的情况下，未转导细胞、cd19-car转导细胞和用ns3-cd19 car转导的细胞上cd4和cd8表达的流式细胞术数据。27.图7示出了质粒plvx-ef1a-ns3 wt的图谱。28.图8示出了质粒plvx-ef1a-ns3 t54a的图谱。29.图9示出了质粒plvx-ef1a-ns3 1cs的图谱。30.图10示出了质粒plvx-ef1a-ns3 2cs的图谱。31.图11示出了质粒plvx-ef1a-ns3 ai的图谱。32.图12示出了质粒plvx-ef1a-ns3 ti的图谱。33.图13示出了质粒plvx-ef1a-ns3双开关1的图谱。34.图14示出了质粒plvx-ef1a-ns3双开关2的图谱。35.序列说明36.seq id no:1是本发明所述car的cd8-α信号肽的氨基酸序列。37.seq id no:2是本发明所述car的cd19单链可变片段的氨基酸序列。38.seq id no:3是本发明所述car的cd22单链可变片段的氨基酸序列。39.seq id no:4是本发明所述car的cd8-α铰链区的氨基酸序列。40.seq id no:5是本发明所述car的cd28铰链区的氨基酸序列。41.seq id no:6是本发明所述car的igg4铰链区的氨基酸序列。42.seq id no:7是本发明所述car的igg4m铰链区的氨基酸序列。43.seq id no:8是本发明所述car的igg1铰链区的氨基酸序列。44.seq id no:9是本发明所述car的igg2铰链区的氨基酸序列。45.seq id no:10是本发明所述car的igg4 ch2 ch3铰链间隔区的氨基酸序列。46.seq id no:11是本发明所述car的igg2 ch2 ch3铰链间隔区的氨基酸序列。47.seq id no:12是本发明所述car的igg1 ch2 ch3铰链间隔区的氨基酸序列。48.seq id no:13是本发明所述car的cd28跨膜结构域的氨基酸序列。49.seq id no:14是本发明所述car的cd8-α跨膜结构域的氨基酸序列。50.seq id no:15是本发明所述car的cd4跨膜结构域的氨基酸序列。51.seq id no:16是本发明所述car的cd3-ζ跨膜结构域的氨基酸序列。52.seq id no:17是本发明所述car的icos跨膜结构域的氨基酸序列。53.seq id no:18是本发明所述car的4-1bb胞内结构域的氨基酸序列。54.seq id no:19是本发明所述car的cd28胞内结构域的氨基酸序列。55.seq id no:20是本发明所述car的cd3-ζ胞内结构域的氨基酸序列。56.seq id no:21-979是表2中所列抗体的轻链可变结构域与和重链可变结构域的氨基酸序列。57.seq id no:980是本发明所述car的野生型ns3蛋白酶结构域的氨基酸序列。58.seq id no:981是本发明所述car的t54a突变体ns3蛋白酶结构域的氨基酸序列。59.seq id no:982是本发明所述car的阿那匹韦抑制性(ai)ns3蛋白酶结构域的氨基酸序列。60.seq id no:983是本发明所述car的特拉匹韦抑制性(ti)ns3蛋白酶结构域的氨基酸序列。61.seq id no:984是本发明所述car的ns4a结构域的氨基酸序列。62.seq id no:985是本发明所述car的第一蛋白酶裂解位点的氨基酸序列。63.seq id no:986是本发明所述car的第二蛋白酶裂解位点的氨基酸序列。64.seq id no:987是本发明所述car的第三蛋白酶裂解位点的氨基酸序列。65.seq id no:988是本发明所述car的第四蛋白酶裂解位点的氨基酸序列。66.seq id no:989是本发明所述car的第一自裂解病毒2a肽(t2a)的氨基酸序列。67.seq id no:990是本发明所述car的第二自裂解病毒2a肽(p2a)的氨基酸序列。68.seq id no:991是本发明所述car的cd19轻链的氨基酸序列。69.seq id no:992是本发明所述car的cd19重链的氨基酸序列。70.seq id no:993是本发明所述car的cd22重链的氨基酸序列。71.seq id no:994是本发明所述car的cd22轻链的氨基酸序列。72.seq id no:995是第一单链可变片段连接子的氨基酸序列。73.seq id no:996是第二单链可变片段连接子的氨基酸序列。74.seq id no:997是第三单链可变片段连接子的氨基酸序列。具体实施方式75.本发明提供了嵌合抗原受体(car)t细胞系统，以及系统的制备方法和使用系统治疗肿瘤和其它疾病的方法。本发明的car-t细胞系统使用蛋白质功能的化学遗传控制来实现特定的和可靠的开/关效应。本发明的诱导型开关设计基于丙型肝炎病毒(hcv)的非结构蛋白3(ns3)蛋白酶结构域，所述ns3结构域在特定裂解位点进行自裂解。76.本发明的car-t细胞系统的ns3蛋白酶结构域位于car构建体中，使得ns3蛋白酶的自蛋白水解活性默认裂解car构建体。相反地，在存在阻断ns3蛋白水解活性的小分子抑制剂的情况下，本发明的工程car在car转导t细胞表面上表达。本发明的car-t细胞系统允许在转导t细胞上剂量依赖性地诱导car表达，并在停用小分子抑制剂后从t细胞中去除car。因此，这种新型调节的car-t细胞系统允许通过在转导t细胞上表达car来进行特定car-t细胞疗法，并进一步能够维持car转导t细胞。77.在本发明的具体实施例中，通过基因工程来制备表达car的t细胞，以便用激活受体保护患者的免疫活性t细胞；所述激活受体包括：(1)针对肿瘤靶标或免疫细胞靶标的免疫球蛋白的胞质外可变片段，例如单链可变片段(scfv)；(2)ns3蛋白酶结构域；(3)铰链区；(4)跨膜结构域；(5)来自cd28和/或4-1bb等的至少一个阳性共刺激分子结构域；(6)源于cd3-ζ等的胞内t细胞受体激活分子结构域。78.在一些实施例中，本发明的car是利用t细胞受体的完整胞内信号转导结构域来设计的。在其它实施例中，可使用t细胞受体的完整胞内信号转导结构域的一部分。就使用tcr的胞内信号转导结构域的截断部而言，只要所述截断部转导效应子功能信号，其就可用于替代完整链。在具体实施例中，本发明的car的胞内信号转导结构域是能够转导tcr效应子功能信号的胞内信号转导结构域的截断部。79.用于本发明的car的胞内信号转导结构域的实例包括但不限于t细胞受体和共受体的胞质序列，所述胞质序列在抗原受体结合后发起信号转导；这些序列和具有同等功能的任何合成序列的任何衍生物或变体。80.在某些实施例中，car的胞内结构域还包括二次信号或共刺激信号。共刺激信号转导部是指包括共刺激分子的胞内结构域的car区。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，是淋巴细胞有效响应抗原所必需的。81.在一些实施例中，t细胞激活由两类不同的胞内信号转导序列介导：通过tcr启动抗原依赖性初级激活序列(初级胞内信号转导序列)和以抗原非依赖性方式提供二次信号或共刺激信号的序列(二次胞内信号序列)。82.在一些实施例中，本发明的car的胞内结构域包括cd3-ζ信号转导结构域，并且任选地，在car中有用的任何其它所需细胞质结构域。例如，在一些实施例中，car的胞内结构域包括cd3-ζ链部和共刺激信号转导结构域。可以从中衍生出共刺激信号转导结构域并在制备本发明的car使用的共刺激分子的实例包括但不限于：cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos(cd278)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、tnfsf14、nkg2c、b7-h3、cd132和ilrβ(cd122)。与此同时，实例中例示了使用cd28和4-1bb作为共刺激信号成分(共刺激信号转导结构域)的实例，但其它共刺激信号转导结构域(例如，ox40、cd30、cd40、pd-1、icos(cd278)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、tnfsf14、nkg2c、b7-h3、cd132和ilrβ(cd122))可以被使用并属于本发明的范围内。83.在优选实施例中，本发明的car的胞内结构域包括一个或多个信号转导结构域，包括但不限于cd3-ζ、cd28和4-1bb信号转导结构域。84.在一些实施例中，本发明所述的car包括铰链区；所述铰链区包括但不限于cd8-α铰链区、cd28铰链区、igg4铰链区、igg4m铰链区、igg1铰链区、igg2铰链区。在一些实施例中，本发明的car包括铰链间隔区；所述间隔子包括但不限于igg4 ch2 ch3铰链间隔区、igg2 ch2 ch3铰链间隔区、igg1 ch2 ch3铰链间隔区。85.在一些实施例中，本发明的car包括跨膜结构域；所述跨膜结构域包括但不限于cd28跨膜结构域、cd8-α跨膜结构域、cd4跨膜结构域、cd3-ζ跨膜结构域、或icos跨膜结构。86.根据本发明有用的car包括第一代car、第二代car和第三代car。第一代car包括：特异性识别有益抗原的结合分子和激活信号转导结构域的t细胞(无胞内共刺激结构域)。第二代car和第三代car包括来自各共刺激分子的信号序列。第二代car包括特异性识别有益抗原的结合分子、激活胞内信号转导结构域的t细胞和胞内共刺激结构域。第三代car包括特异性识别有益抗原的结合分子、激活胞内信号转导结构域的t细胞和两个或更多个胞内共刺激结构域。87.在第一代car的一些实施例中，胞内结构域包括cd3-ζ信号转导结构域。在第二代car的一些实施例中，胞内结构域包括cd3-ζ和cd28信号转导结构域。在第三代car的一些实施例中，胞内结构域包括cd3-ζ、cd28和4-1bb信号转导结构域。在某些实施例中，car的细胞质结构域包括cd3-ζ、cd28和4-1bb信号转导结构域的任何组合或有助于诱导t细胞激活的任何其它信号转导结构域的组合。88.在优选实施例中，本发明的car包括抗体的单链可变片段(scfv)、丙型肝炎病毒(hcv)的非结构蛋白3(ns3)蛋白酶结构域、人cd8铰链和跨膜结构域，以及人cd3-ζ、人cd28和人4-1bb信号转导结构域。89.在一些实施例中，ns3蛋白酶结构域结合到位于特定位置的car，从而ns3蛋白酶活性在特定的预定蛋白酶裂解位点裂解car蛋白构建体，并阻止完整的car蛋白构建体在细胞表面上表达。90.在一些实施例中，ns3蛋白酶结构域进一步包括hcv的ns4蛋白序列，以确保适当的ns3蛋白酶表达和功能。在其它实施例中，car构建体可包括源自hcv ns2和ns3蛋白酶序列的蛋白酶结构域。在本发明的优选实施例中，ns3蛋白酶结构域包括ns4a序列(ns3/4a蛋白酶结构域)。91.在一些实施例中，car-t细胞包括抗体的抗原结合域，所述抗体的抗原结合域与癌症抗原和/或免疫细胞抗原特异性结合；ns3/4a蛋白酶结构域；裂解位点；铰链区；跨膜结构域；cd3-ζ胞内信号转导结构域。在一些实施例中，car-t细胞包括抗体的抗原结合域，所述抗体的抗原结合域与癌症抗原和/或免疫细胞抗原特异性结合；ns3/4a蛋白酶结构域；裂解位点；铰链区；跨膜结构域；cd3-ζ胞内信号转导结构域；cd28胞内信号转导结构域。在一些实施例中，car-t细胞包括抗体的抗原结合域，所述抗体的抗原结合域与癌症抗原和/或免疫细胞抗原特异性结合；ns3/4a蛋白酶结构域；裂解位点；铰链区；跨膜结构域；cd3-ζ胞内信号转导结构域；cd28胞内信号转导结构域；4-1bb胞内信号转导结构域。92.在一些实施例中，scfv包括通过柔性连接子连接的抗体重链和轻链的可变部分。本发明的car的连接子包括但不限于seq id no:995-997的单链可变片段连接子。在具体实施例中，柔性连接子允许scfv在不同的方向上定向，以实现抗原结合。在一些实施例中，本发明的car在t细胞中表达时，能够根据抗原结合特异性指示抗原识别，以激活t细胞介导的免疫反应。93.本发明的car的单链可变结构域可设计成靶向存在于靶细胞表面的任何一种或多种蛋白质。例如，与靶细胞上的抗原结合的抗体的可变结构域区可设计成car的单链可变片段，并可用于制备靶向特定抗原的本发明的car-t细胞。可由本发明的car-t细胞靶向的抗原包括但不限于寄生虫抗原、细菌抗原、病毒抗原和自身抗原。94.在一些实施例中，本发明的car包括抗癌抗体的单链可变片段(抗癌scfv)、ns3/4a蛋白酶结构域、裂解位点、人cd8铰链和跨膜结构域，以及人cd3-ζ信号转导结构域、人cd28信号转导结构域和人4-1bb信号转导结构域。95.在一些实施例中，本发明的car包括抗癌抗体的单链可变片段(抗癌scfv)、ns3/4a蛋白酶结构域、裂解位点、人cd8铰链和跨膜结构域，以及人cd3-ζ信号转导结构域、人cd28信号转导结构域和人4-1bb信号转导结构域。96.在一些实施例中，本发明的car包括结合寄生虫抗原、细菌抗原和/或病毒抗原的单链可变片段(抗感染scfv)、ns3/4a蛋白酶结构域、裂解位点、人cd8铰链和跨膜结构域，以及人cd3-ζ信号转导结构域、人cd28信号转导结构域和人4-1bb信号转导结构域。97.在一些实施例中，本发明的car包括结合自身免疫反应细胞的抗体单链可变片段(抗自身免疫细胞scfv)、ns3/4a蛋白酶结构域、裂解位点、人cd8铰链和跨膜结构域，以及人cd3-ζ信号转导结构域、人cd28信号转导结构域和人4-1bb信号转导结构域。有利的是，本发明的car可用于微调car-t细胞的car表达，从而可以安全地靶向自体反应性细胞上的抗原。其中，一旦靶向了自身反应性细胞，就可以关闭自体反应性细胞上的car表达，以避免靶向可能表达类似抗原的非自体反应性细胞。98.本文所述的抗癌抗体是指与癌细胞上存在的任何抗原结合的任何抗体。99.本文所述的抗免疫细胞抗体是指与免疫细胞上存在的任何抗原结合的任何抗体。100.包括可用于本发明car工程的可变结构域的抗体实例包括但不限于：特异性结合α-胎甲球蛋白1的抗体；间变性淋巴瘤激酶(cd246)；含v-set域t-细胞激活抑制剂1；b细胞cll/淋巴瘤2(bcl-2)；b细胞受体-abl融合蛋白(bcr/abl)；绒毛膜促性腺激素β亚单位3(β-hcg)；β-2微球蛋白；b-raf原癌基因(braf)；乳腺癌1型易感蛋白(brca1)；乳腺癌2型易感蛋白(brca2)；b细胞成熟抗原(bcma)；b7样分子h4(b7-h4)；癌抗原15-3(ca 15-3)；癌抗原19-9(ca 19-9)；降血钙素；钙网膜蛋白；脑啡肽酶(cd10)；吞噬细胞糖蛋白-1(cd44)；蛋白酪氨酸磷酸酶c型受体(cd45)；癌胚抗原(cea)；嗜铬粒蛋白a；酪氨酸蛋白激酶试剂盒(c-kit)；细胞角蛋白19；表皮生长因子受体(egfr)；上皮细胞黏附分子(epcam)；雌激素受体-α；雌激素受体-β；叶酸受体1；附睾分泌蛋白e4(he4)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc-3)；免疫球蛋白相关的β(cd79b)；v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同源物2(her2)；抑制素；整合素相关蛋白(iap/cd47)；白介素-3受体(cd123)；由单克隆抗体ki-67(ki-67)识别的抗原；kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kras)；溶酶体相关膜蛋白1(lamp1)；白细胞抗原cd37；黑色素a(mart1)；黑色素瘤细胞粘附分子(mcam/cd146)；间皮素；粘液蛋白1(muc1)；粘液蛋白16/卵巢癌抗原125(muc16/ca125)；核基质蛋白22(nmp22)；神经原特异性烯醇化酶(nse)；神经营养性酪氨酸激酶受体相关1(ror1)；神经生长因子受体(ngfr)；肿瘤蛋白53(p53)；细胞骨架相关蛋白4(p63)；程序性细胞死亡蛋白1(pd1)；程序性死亡配体1(pd-l1/cd274)；丙酮酸激酶肌(pkm)；磷脂酶a2激活蛋白(plap)；荚膜蛋白；孕酮受体。前列腺特异性抗原(psa)；唾液酸结合ig样凝集素3(cd33)；s100钙结合蛋白a4(s100a4)；丝氨酸蛋白酶抑制剂e(serpine1)；分泌型卷曲相关蛋白1(sfrp1)信号淋巴细胞激活分子相关受体家族，包括但不限于信号淋巴细胞激活分子(cd150)、2b4(cd244)、cd84、ntb-a(ly-108)和ly-9(cd229)；syndecan-1(cd138)；肿瘤相关糖蛋白72(tag-72)；胸苷激酶；甲状腺球蛋白；转录终止因子1(ttf1)；尿素激酶型胞浆素原激活子(upa)；血管内皮生长因子受体2(vegr2)；或波形蛋白。101.在本发明的一些实施例中，car包括与所需靶抗原结合的任何可变结构域的单链可变片段。有利的是，由于抗体可变结构域的氨基酸序列可易于转化为本发明car的单链可变片段序列，因此任何与所需靶抗原结合的抗体的可变结构域都可用于制备本发明的car。例如，在一些实施例中，来自双特异性抗体或具有与两个以上抗原结合的可变结构域的多特异性抗体的可变结构域可用于制备本发明的car。在一些实施例中，双特异性或多特异性抗体的第一可变结构域的重链和轻链可以用于生成一个car，而双特异性或多特异性抗体的第一个可变结构域的重链和轻链可以用来生成第二car。102.在一些实施例中，一种抗体的一个可变结构域的重链和/或轻链结构域和第二抗体的第二可变结构域的重链和/或轻链或双特异性或多特异性抗体的第二可变结构域可用于制备本发明的car。在另外的实施例中，一个以上重链结构域和一个以上轻链结构域可以通过连接子结合起来，以制备本发明的多特异性car。一个以上重链和一个以上轻链结构域可以来自不同抗体的单个可变结构域或来自双特异性或多特异性抗体的不同可变结构域。103.在另外的实施例中，无轻链结构域的重链结构域和无重链结构域的轻链结构域可用于制备本发明的car。在一些实施例中，来自第一可变结构域的重链和来自第二可变结构域的轻链可用于制备本发明的car。在一些实施例中，可结合来自一个以上可变结构域的一个以上重链来制备本发明的car。在一些实施例中，可结合来自一个以上可变结构域的一个以上轻链来制备本发明的car。在另外的实施例中，可结合来自一组以上的第一组可变结构域的不止一个重链和来自一组以上的第二组可变结构域的不止一个轻链来制备本发明的car。104.例如，本发明的car的单链抗体可以包括抗体的可变序列，包括但不限于：阿巴伏单抗、阿贝西单抗、依那妥组单抗、阿泽奇单抗、阿利鲁单抗、阿克托舒单抗、阿达木单抗、阿杜那单抗、阿法库单抗、阿拉赛珠单抗、阿仑单抗、阿莫罗布单抗、阿麦妥单抗、安德利昔单抗、那呐妥单抗、阿尼鲁单抗、安芦珠单抗、艾妥单抗、阿普卢妥单抗、依维苏单抗、阿特朱单抗、阿度尤单抗、阿替奴单抗、阿替韦单抗、阿维单抗、阿妥昔珠单抗、巴替利单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、巴维昔单抗、贝汀维单抗、贝戈洛单抗、贝兰他单抗、贝利尤单抗、贝马里妥珠单抗、贝那珠单抗、贝度尤单抗、贝迈奇单抗、博司利单抗、贝伐珠单抗、贝洛托舒单抗、比玛卢单抗、比美吉珠单抗、泊特埃单抗、布来鲁单抗、博纳吐单抗、布隆妥维单抗、布索组单抗、伯考赛珠单抗、布雷库单抗、维布妥昔单抗、布雷奴单抗、布罗达单抗、布洛赛珠单抗、布隆妥珠单抗、布格利单抗、布洛舒单抗、卡瑞利珠单抗、卡利尤单抗、卡瑞利珠单抗、卡那单抗、莫坎妥珠单抗、卡普赛珠单抗、卡芦单抗、卡罗妥昔单抗、塞米普利单抗、申达奇单抗、瑟妥珠单抗、赛妥珠单抗、西利单抗、西妥昔单抗、赛必妥单抗、辛帕奈单抗、泊西他组单抗、西妥木单抗、克拉扎珠单抗、克雷那芙普、克利妥珠单抗、考伯利单抗、考曲妥珠单抗、考非妥珠单抗、考妥昔单抗、可那木单抗、康赛珠单抗、考韦昔单抗、克雷内治单抗、立赞利珠单抗、克罗特度单抗、可伐利单抗、古妥珠单抗、达西珠单抗、达珠单抗、达洛珠单抗、达匹利珠单抗、达雷妥尤单抗、德屈库单抗、登赛珠单抗、地宁妥珠单抗、地舒单抗、迪妥昔珠单抗、美妥昔单抗、迪扎米珠单抗、迪帕西单抗、地妥昔单抗、地利伏单抗、迪西妥单抗、多玛洛珠单抗、多奈单抗、多塔利单抗、多奈单抗、度戈妥珠单抗、度普利尤单抗、德瓦鲁单抗、度司妥单抗、度妥昔珠单抗、依库珠单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、依芬古单抗、埃迪鲁单抗、依来努单抗、依更妥单抗、依帕韦单抗、埃罗妥珠单抗、依米妥珠单抗、依玛鲁单抗、依米赛珠单抗、可那木单抗、依玛妥珠单抗、依那妥组单抗、恩诺单抗、依诺凯组单抗、依诺苏单抗、恩妥昔单抗、恩弗利单抗、依帕珠单抗、依普奈珠单抗、厄瑞努单抗、埃达组单抗、艾替利单抗、艾托奇单抗、依曲利组单抗、依维苏单抗、依洛尤单抗、法里昔单抗、法拉妥单抗、法司努单抗、非扎奴单抗、非卡妥珠单抗、芬妥木单抗、非利伏单抗、弗兰妥他单抗、弗列珠单抗、氟妥珠单抗、曲妥珠单抗、福拉鲁单抗、福拉韦单抗、弗雷曼单抗、非苏木单抗、依洛尤单抗、夫卢维单抗、富拉尼单抗、利妥昔单抗、伽奈珠单抗、加利昔单抗、甘妥单抗、加尼妥单抗、甘特珠单抗、加达西单抗、加托索单抗、伽妥珠单抗、格迪伏单抗、吉伏组单抗、吉伏组单抗、吉维单抗、瑾司鲁单抗、吉妥昔单抗、格巴妥木单抗、格仑西单抗、戈利木单抗、戈苏拉单抗、古塞库单抗、伊利尤单抗、伊巴珠单抗、伊库鲁单抗、依达赛珠单抗、艾拉米单抗、奥妥珠单抗、阿仑单抗、伊马单抗、伊普利单抗、伊马珠单抗、恩库拉单抗、英达妥昔单抗、英度妥单抗、英比利珠单抗、英夫利西单抗、奥英妥珠单抗、英妥木单抗、伊匹单抗、伊妥木单抗、艾萨妥昔单抗、伊卡利单抗、伊妥尤单抗、伊利组单抗、伊西贝单抗、拉贝珠单抗、拉妥珠单抗、拉可妥单抗、拉妥珠单抗、兰帕利珠单抗、拉那芦人单抗、兰洛珠单抗、利妥昔单抗、拉韦昔单抗、来瑞组单抗、伦韦单抗、仑兹鲁单抗、来罗单抗、来索伏单抗、来利珠单抗、乐维利单抗、来沙木单抗、利法妥珠单抗、利戈组单抗、利洛托单抗、林妥珠单抗、利瑞鲁单抗、洛迪赛珠单抗、洛吉维单抗、朗妥昔单抗、昔林可基、洛沃妥珠单抗、罗妥昔珠单抗、卢卡木单抗、鲁利珠单抗、鲁昔单抗、鲁妥珠单抗、鲁帕妥单抗、鲁吉珠单抗、玛替韦单抗、莫洛利单抗、玛格妥昔单抗、马塔西单抗、马妥珠单抗、玛弗利木单抗、美泊利单抗、米拉组单抗、米吉珠单抗、米妥昔单抗、米扎利单抗、扎妥昔单抗、莫格利珠单抗、莫那利珠单抗、莫舒内珠单抗、莫维组单抗、莫妥昔单抗、莫伦妥单抗、莫罗单抗、那米单抗、那普妥莫单抗、那妥昔单抗、那呐妥单抗、那他珠单抗、奈韦人单抗、那赛昔珠单抗、那昔妥单抗、耐昔妥珠单抗、奈莫利珠单抗、奈伐苏单抗、尼塔奇单抗、尼达利单抗、尼迈西单抗、尼妥珠单抗、尼塞韦单抗、纳武利尤单抗、奥贝利单抗、奥托萨昔单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥卡妥珠单抗、奥瑞组单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、奥来鲁单抗、奥仑达利珠单抗、奥伐西单抗、奥洛组单抗、奥马珠单抗、奥博妥单抗、奥那妥组单抗、昂塔利单抗、昂妥昔珠单抗、奥瓦利单抗、奥匹努单抗、莫妥组单抗、奥诺利单抗、奥替苏单抗、奥索西单抗、奥昔组单抗、奥替米单抗、奥乐妥珠单抗、奥塞芦单抗、奥扎尼珠单抗、奥利组单抗、帕滨芙普、帕利珠单抗、潘瑞鲁单抗、帕尼单抗、帕巴库单抗、帕萨妥珠单抗、帕妥昔珠单抗、帕替组单抗、帕曲妥单抗、帕姆单抗、派比奈单抗、培拉凯珠单抗、帕妥珠单抗、匹地利珠单抗、匹那妥珠单抗、普拉鲁单抗、帕拉莫妥单抗、洛扎利珠单抗、泊洛妥珠单抗、泊奈组单抗、珀韦昔单抗、普尼珠单抗、普瑞鲁单抗、瑞托萨昔单抗、帕洛利单抗、奎莫利单抗、奎利珠单抗、雷妥莫单抗、雷曲妥单抗、雷韦单抗、雷泮赛珠单抗、雷莫芦单抗、雷奈维单抗、雷尼株单抗、雷划卡单抗、依库珠单抗、瑞法奈珠单抗、瑞拉利单抗、瑞弗维单抗、壬托鲁单抗、瑞利珠单抗、利妥木单抗、利努苏单抗、利妥珠单抗、利妥昔单抗、利伐巴珠单抗、罗妥木单抗、罗来度单抗、洛林妥单抗、若奇单抗、罗莫珠单抗、隆利组单抗、洛曼妥珠单抗、洛伐妥珠单抗、洛利昔珠单抗、rozipafusp、卢利珠单抗、赛妥珠单抗、萨特利珠单抗、沙马妥单抗、赛诺菲单抗、萨特利珠单抗、司库奇尤单抗、塞鲁单抗、西瑞奈单抗、瑟瑞妥单抗、瑟托萨昔单抗、赛图苏单抗、西法木单抗、司妥昔单抗、辛妥珠单抗、信迪利单抗、斯妥尤单抗、西鲁库单抗、索非妥珠单抗、苏兰组单抗、索利托单抗、斯巴达珠单抗、司柏索利单抗、舒他伏单抗、苏替莫单抗、舒维组单抗、苏托舒单抗、他贝芦单抗、坦比妥昔单抗、他度组单抗、他法西他单抗、塔妥珠单抗、他林妥单抗、坦妥维单抗、他尼组单抗、他瑞妥单抗、他利昔珠单抗、替本福司、特立妥单抗、特立妥珠单抗、特瑞普利单抗、特那妥单抗、替利组单抗、替普迪单抗、特普妥木单抗、特斯多鲁单抗、特折鲁单抗、替布利珠单抗、泰妥单抗、替加组单抗、替拉奈单抗、替拉珠单抗、替莫鲁单抗、替瑞利尤单抗、替雷利珠单抗、替索妥单抗、托珠单抗、托拉利单抗、托木妥昔单抗、特瑞普利单抗、托萨托舒单抗、托维妥单抗、曲罗芦单抗、曲妥珠单抗、曲利组单抗、曲美木单抗、曲戈卢单抗、乌妥昔单抗、乌洛鲁单抗、乌瑞芦单抗、乌司奴单抗、乌托鲁单抗、伐达妥昔单抗、伐那福司、万替妥单抗、伐努赛珠单抗、伐利苏单抗、伐立鲁单抗、伐利组单抗、维多珠单抗、维妥组单抗、维森库单抗、维克妥单抗、维西珠单抗、沃巴利珠单抗、沃凡妥单抗、沃拉德单抗、珀伽利珠单抗、伏派利单抗、沃瑟妥珠单抗、伏那吉珠单抗、珍妥珠单抗、泽弗利单抗、扎芦木单抗、佐比利单抗、扎诺莫单抗、泽妥珠单抗、佐贝妥昔单抗，以及这些抗体的任一个的可变轻链和/或可变重链序列的任意组合。上述抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列可在imgt网站上获得(参见全球网站：imgt.org，所附序列列表和表2中也有提供)。105.在另外的实施例中，在本发明公开后的任何时间在本领域中发现的任何抗体的任何可变区均可包括在本发明的car构建体中，因为本领域的技术人员或普通技术人员可以基于本发明，采用常规方法将可变区序列并入car构建体中并根据本发明制备car-t细胞。106.在优选实施例中，用于构建本发明的car的细胞结合抗体的单链可变片段是与靶抗原的膜近端区结合的片段，使由这种结合片段制备的car的结合能够在物理上有效阻断靶抗原与任何二聚化配偶体的二聚化。107.在一些实施例中，本发明的car的抗原结合片段来自被设计锚重复蛋白，所述锚重复蛋白与靶细胞上的抗原结合。在本发明的car中有用的被设计锚重复蛋白的结合片段可以包括1到20个，最好是2到6个锚重复蛋白；所述锚重复蛋白包括框架序列和可变序列，并可以从锚重复蛋白库中检索出来。有利的是，锚重复蛋白与靶细胞表面上的所需靶分子结合，并且具有高稳定性和低抗原性，从而降低了不良副作用的风险。108.本发明的car包括至少一个细胞质结构域和/或胞内信号转导结构域，其激活表达car的t细胞的正常效应子功能的至少一个。如本文所使用的，术语"胞内信号转导结构域"是指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指示细胞执行特殊功能。术语"效应子功能"是指t细胞的一种特殊功能。t细胞的效应子功能可为包括炎症细胞因子在内的细胞毒性和免疫刺激活等。109.在一些实施例中，本发明的car进一步包括跨膜结构域。在优选实施例中，跨膜结构域与car的胞外抗原结合结构域结合。在某些实施例中，跨膜结构域来自其跨膜结构域与本发明的car的结构域之一天然相关的分子。在某些实施例中，对跨膜结构域进行修饰(例如，通过氨基酸取代)，以避免与其它细胞膜分子的跨膜结构域结合，从而尽量减少与其它膜相关分子发送非所需相互作用。110.跨膜结构域可以从天然或合成来源获得。在一些实施例中，来源是天然的，并且结构域可以来自任何膜结合或跨膜蛋白。根据本发明有用的跨膜区可以来自于或可以包括t细胞受体的α、β或ζ链、cd4、cd8-α、cd28、cd3-ε、cd3-ζ、cd45、cd5、cds、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154和/或icos(诱导性t刺激因子)的跨膜区中的至少一个。111.在一些实施例中，根据本发明有用的跨膜结构域可以是合成的，并且可以包括亮氨酸和缬氨酸等主要疏水残基。优选地，合成跨膜结构域的n端和/或c端包括苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。112.可选地，本发明的car的跨膜结构域和胞内信号转导结构域均可通过短寡肽或多肽间隔子连接，优选地长度为2到10个氨基酸。113.如本文所使用的，术语"间隔子"或"连接子"是指用于将多肽链中的跨膜结构域与胞外结构域或胞内结构域连接起来的任何寡肽或多肽。间隔子可包括多达300个氨基酸，优选地10到100个氨基酸，更优选地25到50个氨基酸，最优选地5至20个氨基酸。114.本发明的car的ns3/4a蛋白酶结构域可裂解特定裂解位点。在一些实施例中，裂解位点是包括位于裂解侧的n端侧的6个氨基酸以及位于c端的4个残基的十肽。在其它实施例中，裂解位点包括1到100个氨基酸以及两者之间任何数量的氨基酸，并在裂解位点肽内的任何位置进行裂解。115.在优选实施例中，本发明的car的裂解位点包括氨基酸dlevvt/stwv，demeec/sqhl，ecttpc/sgsw，和/或edvvcc/smsy，其中"/"表示裂解的肽键。116.在优选实施例中，本发明的car的ns3/4a蛋白酶结构域位于单链可变片段和铰链区之间。117.在其它实施例中，car的ns3/4a蛋白酶结构域位于铰链区和跨膜结构域之间。在又一些实施例中，ns3/4a蛋白酶结构域位于胞内结构域之间，例如，位于cd28结构域和4-1bb结构域之间，位于cd28结构域和cd3-ζ结构域之间；位于4-1bb结构域和cd3-ζ结构域之间；或只要其不干扰car的表达、膜位置和/或功能，可位于本发明car的任何部分中。118.在优选实施例中，本发明的car包括单个ns3/4a裂解位点。在其它优选实施例中，本发明的car包括单个ns3/4a裂解位点。119.在优选实施例中，本发明的car的单个ns3/4a裂解位点位于或邻近ns3/4a蛋白酶结构域的n端。120.在其它优选实施例中，本发明的car的单个ns3/4a裂解位点位于或邻近ns3/4a蛋白酶结构域的c端。121.在更优选的实施例中，本发明的car包括一个以上的ns3/4a裂解位点，并且所述至少一个ns3/4a裂解位点位于或邻近ns3/4a蛋白酶结构域的n端。122.在另外的优选实施例中，本发明的car包括一个以上的ns3/4a裂解位点，并且所述至少一个ns3/4a裂解位点位于或邻近ns3/4a蛋白酶结构域的c端。123.在最优选的实施例中，本发明的car包括一个以上的ns3/4a裂解位点；所述至少一等。138.本文所用的术语"治疗"或其任何语法意义变异(例如，治疗(treat)、治疗(treating)和治疗(treatment)等)，包括但不限于改善或减轻疾病或状况的症状，从而减少、阻止、抑制、减轻或影响状况的进展、严重程度和/或范围。139.本文所用的术语"预防"或其任何语法变化(例如，预防(prevent)、预防(preventing)和预防(prevention)等)包括但不限于，延迟症状的发生，防止疾病的复发，减少复发的数量或频率，增加症状发作之间的潜伏期或其组合。140.在一些实施例中，从患有将利用本发明的car-t细胞治疗的疾病的患者或供体受试者身上提取混合细胞群来治疗。随后，在分离的t细胞中对本发明的car进行逆转录病毒或慢病毒介导表达，并将治疗有效量的1到1014个car-t细胞输注给患者。本发明的car-t细胞能够在体内复制，可导致持续的疾病控制长期且持续存在。例如，输注的car-t细胞在施用后可以在患者体内持续存在至少一个月。在一些实施例中，基因工程car-t细胞的持续群在施用后在人体内持续存在至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。141.进一步提供的是双开关car-t细胞系统，其包括利用编码car的至少一个car构建体转导的t细胞，所述至少一个car具有与第一抗原结合的单链可变片段；利用编码car的至少一个car构建体转导的t细胞，所述car具有与第二抗原结合的单链可变片段。142.在一些实施例中，car构建体对结合第一抗原的scfv和结合第二抗原的scfv进行编码，以及组合在单载体内并转移到同一个t细胞中。143.在其它实施例中，car构建体对结合第一抗原的scfv和结合第二抗原的scfv进行编码，以及包括在单独载体内并转移到不同的t细胞中。144.在一个优选实施例中，car对结合第一抗原的scfv进行编码，并且包括ns3/4a蛋白酶结构域；所述ns3/4a蛋白酶结构域包括至少一处突变，使ns3/4a结构域对小分子抑制剂的抑制敏感。145.在另一个优选实施例中，car对结合第二抗原的scfv进行编码，并且包括ns3/4a蛋白酶结构域；所述ns3/4a蛋白酶结构域包括至少一处突变，使ns3/4a结构域对另一小分子抑制剂的抑制敏感。146.在更优选的实施例中，car构建体对结合第一抗原的scfv和结合第二抗原的scfv进行编码，并且包括对不同小分子抑制剂的抑制敏感的ns3/4a蛋白酶结构域。147.在最优选的实施例中，本发明的第一car构建体对结合cd19抗原的scfv进行编码，并且包括对小分子抑制剂阿那匹韦的抑制敏感的ns3/4a蛋白酶结构域；第二car构建体对结合cd22抗原的scfv进行编码，并且包括对小分子抑制剂特拉匹韦的抑制敏感的ns3/4a蛋白酶结构。148.例如，在一些实施例中，利用ns3/4a蛋白酶开关的不同变体构建慢病毒载体，所述载体同时编码可切换的抗cd19 car和可切换的抗cd22 car(见表达载体质粒plvx等)，不同的ns3/4a变体受到不同小分子抑制剂抑制。单个慢病毒表达质粒中共同表达两个car是通过自裂解病毒2a肽序列等来实现的。每个car包括，除cd3-ζ激活结构域(第三代)外的cd28和4-1b共刺激结构域。通过将带有ppax2质粒等慢病毒包膜质粒和pmd2.g等慢病毒包装质粒的表达载体共转染到293t细胞中，将慢病毒包装到293t细胞中，并且获得由转染的293t细胞制成的慢病毒。如此制备的慢病毒包括抗cd19 car构建体和抗cd22 car构建体，并且用于转导从需要car-t疗法的患者获得的t细胞或从供体获得的t细胞。随后通过输注向需要car-t细胞疗法的患者施用car-t细胞。149.有利的是，在无阿那匹韦等小分子抑制剂的情况下培养时，通过抗cd19-car的抗体和流式细胞术测量，本发明的car-t细胞不会在细胞表面上表达car。150.然而，在阿那匹韦存在的情况下，t细胞的相当一部分在其细胞表面表达通过流式细胞术测定的本发明的car。151.此外，存在于转导的t细胞的细胞表面上的本发明的car的表达水平随着所述t细胞接触的阿那匹韦的浓度增加而增加。152.在阿那匹韦存在的情况下，car-t细胞上的car表达水平随时间的推移而稳定。例如，表达水平至少在1小时至约4周内稳定，例如2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、1周、2周、3周、和/或4周。153.重要的是，本发明的car中存在ns3/4a蛋白酶结构域，不会对表达本发明的car的t细胞杀伤能力产生任何负作用。例如，t细胞的肿瘤或癌细胞杀伤活性与本发明的car-t细胞的肿瘤杀伤活性相似，所述t细胞表达无ns3/4a蛋白酶结构域的car，所述car-t细胞表达ns3/4a蛋白酶结构。154.有利的是，当停用小分子抑制剂时，本发明的car在car-t细胞的细胞表面上的表达水平显著降低，或者经抑制剂处理的car-t细胞的表面上不存在car。155.例如，停用阿那匹韦24小时后，导致car-t细胞表面上的car显著减少；停用阿那匹韦48小时后，car-t细胞上不存在car。156.然而，本发明的car-t细胞不管小分子抑制剂存在与否，均不会发生细胞凋亡、坏死细胞死亡和/或自噬。157.此外，本发明的car-t细胞不管小分子抑制剂存在与否，均不会改变其cd4和/或cd8的表达水平。158.从car-t细胞表面有效去除car，使本发明的car-t细胞恢复到非激活状态。因为t细胞和car-t细胞的广泛激活通常会导致细胞死亡，从而使car-t细胞群耗竭，因此本发明的car的双位开关使患者的car-t细胞具有长期生存能力，并避免激活诱导的细胞死亡和car-t细胞耗竭。159.核酸分子、载体和表达构建体160.在一些实施例中，本发明提供了编码本发明抗原特异性car的核酸分子。本发明还提供了包括编码本发明抗原特异性car的核酸分子的表达构建体和载体。161.在优选实施例中，car序列包括在基因构建体中，所述基因构建体使car构建体定点插入t细胞基因组中，以实现更加一致的car的表面水平表达。162.根据本发明有用的核酸序列可以利用本领域已知的重组方法获得，例如，通过筛选表达目的基因的细胞库，从已知包括相同基因的载体中衍生出目的基因，或直接从含有相同基因的细胞和组织中分离。另外，目的核酸序列可通过合成方式制备。163.编码car的天然或合成核酸的表达可通过将编码car多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接，并将所述构建体纳入表达载体来实现。这些载体可适合在真核细胞中进行复制和整合。典型的克隆载体包括起始序列、用于调节所需核酸序列表达的启动子，以及转录和转译终止子。164.如本文所使用的，术语"表达构建体"是指用于转录可操作连接核酸序列的核酸序列的组合。本发明的表达构建体通常还包括调节成分，所述调节成分在要表达构建体的预期宿主细胞中起作用。调节成分包括启动子、转录终止序列、转译终止序列、增强子和多腺苷酸化成分。165.本发明的表达构建体可以包括启动子序列，所述启动子序列与编码本发明的肽的多核苷酸序列可操作地连接。可以使用本领域已知的标准技术将启动子纳入多核苷酸。在本发明的表达构建体中可使用启动子的多个副本或多个启动子。在优选实施例中，启动子与转录起始位点之间的距离与其在自然基因环境中与转录起始位点之间的距离大致相同。在不显著降低启动子活性的情况下，这一距离的一些变化是允许的。转录起始位点通常包括在表达构建体中。166.如本文所使用的，术语"可操作地连接"是指所述成分的并置；其中各成分之间的关系允许它们以其预期的方式发挥作用。通常，可操作连接成分的关系是邻近。与编码序列可操作连接的序列可能影响编码序列的复制、转录和/或转译。例如，当启动子能够指示编码序列的转录时，编码序列与启动子可操作地连接。[0167]“编码序列"或"编码区"是指转录成mrna和/或转译成多肽的多核苷酸序列。例如，编码序列可以编码目的多肽。编码序列的边界由位于5'端的转译起始密码子和位于3'端的转译终止密码子决定。[0168]本文所用的术语"启动子"是指与要转录的核酸序列(例如，编码所需分子的核酸序列)可操作地连接的dna序列。启动子通常位于要转录的核酸序列的上游，并且提供rna聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。在具体实施例中，启动子通常位于进行转录制备所需分子的核酸序列的上游，并且提供rna聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。[0169]在某些实施例中，根据本发明有用的启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)启动子、延长生长因子-1α(ef-1a)启动子、猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。[0170]根据本发明有用的载体包括但不限于病毒载体；所述病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)和慢病毒载体。[0171]在优选实施例中，提供了慢病毒载体，其包括核酸分子；所述核酸分子编码特异性用于癌抗原或免疫性疾病抗原的car。如果本发明的car构建体大小超过病毒载体包装容量，则可使用包括但不限于piggybac转位子系统的其它方法将car构建体转移到靶细胞中。[0172]t细胞的转导、分离和分选[0173]在一些实施例中，使用各种病毒载体来转导t细胞，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体。在一些实施例中，病毒载体包括编码本发明的car的核酸分子。[0174]本文所用的术语"转染"或"转化"或"转导"是指将外源性核酸转移到或引入宿主细胞中的过程。[0175]在一些实施例中，本发明提供了使用慢病毒载体转导t细胞的方法。源自慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体可以转导非增殖细胞，因此比逆转录病毒(例如，鼠白血病病毒)的载体更有优势。慢病毒载体还具有免疫原性低的额外优势。[0176]选定基因可利用本领域已知的技术插入载体并包装在病毒(例如，慢病毒)粒子中。然后，重组病毒可被分离出来并传递给受试者体内或体外的t细胞等细胞。在一些实施例中，本发明的慢病毒载体包括编码本发明car的核酸分子。[0177]在一些实施例中，为了评估car多肽或其部分的表达，要引入细胞的表达载体也可以包括可选择的标记基因或报告基因。报告基因用于识别潜在转染和/或感染的细胞，并且用于评估调节序列的功能。通常，报告基因是一种不存在于受体生物或组织中或不由受体生物或组织表达的基因，并且编码多肽，所述多肽的表达表现为某种易于检测的特性，例如酶活性或荧光活性。在dna已引入受体细胞后的适当时间，检测报告基因的表达。合适的报告基因包括但不限于编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶和绿色荧光蛋白等任何荧光蛋白基因。合适的表达系统在本领域中是公知的，可以用本领域中已知的技术来制备，或利用商业方式获得。[0178]本文所使用的术语"激活"或其任何语法变化(如激活(activate)、激活(activating)、激活(activation)等)是指t细胞已被充分激活以诱发可检测的细胞增殖的状态。激活也可能与诱导细胞因子制备和可检测效应子功能有关。[0179]本文所用的术语"激活t细胞"，是指除其它细胞外正在进行细胞分裂的t细胞。[0180]在一个实施例中，在对本发明的t细胞进行扩增和基因修饰之前，可以从受试者处获得t细胞的来源。[0181]本文所使用的术语"分离"或其任何语法变化(例如，分离(isolate)、分离(isolating)、分离(isolation)等)是指从其自然环境(例如，外周血中)中移除，并从血液的组合混合物中分离出来使其至少与自然存在的其它细胞保持大约75％的自由度，最优选地是大约90％的自由度的细胞；但是，这些细胞缺乏细胞表面标记，而这些细胞正是基于细胞表面标记来分离的。[0182]t细胞可从多种来源获得，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在本发明的某些实施例中，可使用本领域内的任何数量的t细胞系。[0183]在优选实施例中，从受试者的血液或骨髓中分离和纯化t细胞，随后将富集car-t细胞的组合物引入受试者的血液或骨髓中。受试者可以是需要抑制针对免疫细胞相关抗原的免疫反应癌症患者或患有免疫相关疾病的患者。在一些实施例中，受试者是患有癌症或自身免疫性疾病的人。[0184]另外，t细胞可从不同于患者的供体中获得。在某些实施例中，t细胞可以使用技术人员已知的任何数量的技术(例如，ficolltm分离液法)，从受试者收集的单位血液中获得。在优选实施例中，通过抽血获得来自个体循环血液的细胞。单采产物通常含有淋巴细胞；所述淋巴细胞包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。[0185]在一些实施例中，可清洗通过抽血或ficolltm分离液法收集的细胞，以去除血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中执行后续处理步骤。在另外的实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)清洗细胞。在的可选地实施例中，清洗液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或可能缺乏多个(即便不是全部)二价阳离子。本领域普通技术人员易于理解，清洗步骤可通过本领域人员已知的方法完成，例如，根据制造商的说明使用半自动"流通式"离心机(例如cobe 2991细胞处理器、baxter cytomate、或haemonetics细胞回收器5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如，无ca2+、无mg2+的pbs、plasmalyte a、automacs运行缓冲液或其它带或不带缓冲液的盐水溶液。例如，automacs运行缓冲液含有牛血清白蛋白(bsa)和0.09％的叠氮化物。另外，也可以去除单采样品中不需要的成分，直接将细胞重悬于培养基中。[0186]所得淋巴细胞可使用基于t细胞特异性细胞标记的细胞分离术进行分离，如本文所述。通过选择从血样中获得的细胞表型性状，识别物种特异性的标记品种的抗体用于富集和选择t细胞。例如，识别cd4、cd25和cd45ra的物种特异性品种以及本领域已知的其它标记的抗体用于富集或分离人的t细胞(例如，用于人t细胞的人cd4抗体)。[0187]在特定实施例中，使用结合t细胞特异性细胞表面标记的试剂从细胞群中富集t细胞，并使用荧光激活细胞分选法(facs)、固相磁珠法等本领域已知的细胞分选法来分离这些细胞。在一些实施例中，可使用组合方法来分选细胞，例如，磁选，然后是facs。为了加强富集，正选择(例如，使用在t细胞上表达的表面标记)与负选择(例如，使用在t细胞上不表达的表面标记)相结合。可按任何顺序分离/富集使用细胞表面标记的t细胞。因此，正选择步骤可后紧接负选择步骤，反之亦然。也可以考虑通过分组正选择和负选择步骤来进行分离/富集。因此，分离/富集是通过首先执行该方法的正选择步骤，然后再执行该方法的负选择步骤，反之亦然。[0188]也可以通过去除非cd4+和非cd8+免疫细胞来富集cd4+和cd8+细胞。此类细胞包括但不限于b细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、单核细胞、粒细胞和红系细胞。可用于去除非cd4+和非cd8+细胞的表面标记的抗体是本领域已知的，并且包括但不限于cd14、cd16、cd19、cd36、cd56、cd123和血型糖蛋白a。[0189]例如，在本发明的一个实施例中，首先将细胞群与第一试剂或结合cd14、cd16、cd19、cd36、cd56、cd123和血型糖蛋白a中的一种或多种的一组试剂接触，然后与分别结合cd4和/或cd8和/或cd45ra的试剂接触。[0190]无论是在对t细胞进行基因修饰以表达所需car之前还是之后，均可以使用本领域已知的方法激活和扩增t细胞。[0191]通常，本发明的car-t细胞通过与附有刺激cd3 tcr复合体相关信号的制剂和刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。特别是，t细胞群可按本文所述进行激活，例如，与抗cd3抗体或其抗原结合片段接触，或与固定在表面上的抗cd3抗体接触，或结合钙离子载体与蛋白激酶c激活剂(例如，苔藓抑素)接触。为了对t细胞表面上的辅助分子进行共刺激，需要使用与辅助分子结合的配体。例如，在适合激活t细胞增殖的条件下，t细胞群可与抗cd3和抗cd28抗体接触。[0192]在某些实施例中，可通过不同方案提供用于t细胞的主要刺激信号和共刺激信号。例如，提供每个信号的制剂可存在于溶液中或耦合到表面上。当耦合到表面时，这些制剂可耦合到同一表面(即"顺式"形成)或不同的表面(即"反式"形成)。另外，一种制剂可耦合到表面上，而另一种制剂存在于溶液中。在一个实施例中，提供共刺激信号的制剂与细胞表面结合，并且提供主要激活信号的制剂存在于溶液中或耦合到表面上。在某些实施例中，两种制剂均可存在于溶液中。在其它实施例中，制剂可为可溶性形式，然后交联到表面上，例如，表达fc受体的细胞或抗体或将与制剂结合的其它结合剂。[0193]在一些实施例中，两种制剂均固定在珠子上，要么在同一个珠子上(即"顺式")，要么在不同的珠子上(即"反式")。举例来说，提供主要刺激信号的制剂是抗cd3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的制剂是抗cd28抗体或其抗原结合片段；两种制剂以相等分子量共同固定在同一个珠子上。在一个实施例中，将每个抗体以1:1的比例结合到珠子上，用于t细胞扩增和t细胞生长。在本发明的某些方面中，按比例将抗cd3:cd28抗体结合到珠子上，以便发现与按1:1的比例的扩增相比，t细胞扩增有所增加。[0194]在一些实施例中，与珠子结合的cd3:cd28抗体的比例为100:1至1:100以及两者之间的所有整数值。在本发明的一些实施例中，与颗粒结合的抗cd28抗体比抗cd3抗体多，从而使cd3:cd28的比例小于1。[0195]在某些实施例中，与珠子结合的抗cd28抗体和抗cd3抗体的比例大于2:1。在一个特定的实施例中，结合到珠子的抗体的cd3:cd28比例为1:100。在另一个实施例中，结合到珠子结合的抗体的cd3:cd28比例为1:75。在另一个优选实施例中，结合到珠子结合的抗体的cd3:cd28比例为1:50。在另一个实施例中，结合到珠子结合的抗体的cd3:cd28比例为1:30。在一个优选实施例中，结合到珠子结合的抗体的cd3:cd28比例为1:10。在另一个实施例中，结合到珠子结合的抗体的cd3:cd28比例为1:3。在又一个实施例中，结合到珠子结合的抗体的cd3:cd28比例为3:1。[0196]颗粒与细胞的比例可以从1:500到500:1，中间的任何整数值均可用于刺激t细胞或其它靶细胞。正如本领域普通技术人员易于理解的那样，颗粒与细胞的比例可能取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小珠只能结合一些细胞，而大珠可以结合多个细胞。在某些实施例中，细胞与颗粒的比例从1:100到100:1及两者之间的任何整数值，并且在进一步的实施例中，比例包括1:9到9:1及两者之间的任何整数值，也可用于刺激t细胞。在另一个实施例中，每天或每隔一天添加颗粒。本领域的技术人员将理解，多种其它比例可适合用于本发明。特别是，比例可根据颗粒大小而变化。[0197]在另外的实施例中，t细胞与制剂包覆珠结合，将珠子和细胞分离，然后将分离的细胞进行培养。在可选的实施例中，在进行培养之前，制剂包覆珠与细胞未分离，而是一起培养。在另一个优选实施例中，珠子和细胞首先通过施加磁力等力来浓缩，导致细胞表面标记增加连接反应，从而诱发细胞刺激。[0198]在一些实施例中，可将制剂包覆珠和细胞的混合物培养数小时(约3小时)至约21天或其间的任何小时整数值。在优选实施例中，将珠子和t细胞一起培养约8天。在其它优选实施例中，珠子和t细胞一起培养约2-3天。可能还需要几个周期的刺激，导致t细胞可培养60天以上。[0199]适合t细胞培养的条件包括适宜培养基(例如，最小必需培养基或rpm1培养基1640或x-vivo 15，(lonza))；所述适宜培养基可能含有增殖和活力所需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-γ、il-4、il-7、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgfβ和tnf-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于，表面活性剂、人血浆蛋白粉和n-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇等还原剂。培养基可包括添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素的rpmi 1640、aim-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo 15、x-vivo 20和optimizer，无血清或补充有适量血清(或血浆)或一组规定的激素，和/或一些足够t细胞生长和扩增的细胞因子。青霉素和链霉素等抗生素仅包括在实验培养基中，而不是将要注入受试者体内的细胞培养基中。在适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％的co2)等支持生长的必要条件下维持靶细胞。[0200]抗体和抗体结构域[0201]一种预期用于本发明的抗体可以有多种形式，包括全分子抗体，fv、fab和类似片段等抗体片段，以及包括可变结构域互补性决定区(cdr)的单链抗体和类似形式，所有上述术语均属于本文所用的广义术语"抗体"。[0202]本文所使用的术语"人源抗体"旨在包括具有与人种系免疫球蛋白序列相同、基本相同或来自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。此类人类抗体可以包括未被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或体内定点诱变体细胞突变引入的突变)。然而，本文所使用的术语"人源抗体"并不包括小鼠等其它哺乳动物物种的殖系cdr序列已经移植到人框架序列的抗体。[0203]术语"抗体片段"是指全长抗体的一部分，通常是指抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为fab片段)，每个片段都有单个抗原结合位点；以及一个剩余"fc"片段(因其易于结晶而得名)。胃蛋白酶处理抗体产生f(ab')2片段，所述f(ab')2片段具有能够交联抗原的两个抗原结合片段和剩余的另一个片段(称为pfc')。其它片段可以包括二抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所使用的，相对于抗体而言，"抗原结合片段"是指fv、f(ab)和f(ab')2等片段。对结合特别重要的是本文例举的位于氨基酸序列的n端的前110至130个氨基酸。因此，构成可变区的n端110、115、120、125或130个氨基酸的高度一致性是优选的。优选地，变体序列在这个区域中有超过75％、90％、甚至95％的一致性。[0204]fab是包括抗体分子的单价抗原结合片段的抗体片段。可通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体来制备fab片段，从而得到完整轻链和一个重链的一部分。[0205]fab'是抗体分子的片段，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后进行还原以得到完整轻链和重链的一部分。每个抗体分子均可获得两个fab'片段。fab'片段与fab片段的不同之处在于，在包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链ch1结构域的羧基端添加了一些残基。[0206](fab')2是一种可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体而不进行后续还原来获得的抗体片段。(fab')2是由两个fab'片段通过两个二硫键结合在一起的二聚体。[0207]fv是包括完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体(vh-vl二聚体)组成。在这种结构中，每个可变结构域的三个cdr相互作用，以在vh-vl二聚体的表面上形成抗原结合位点。总的来说，这六个cdr赋予了抗体的抗原结合特异性。[0208]然而，甚至是包括对抗原特异的仅三个cdr的单个可变结构域，或fv的一半也有能力识别和结合抗原，尽管可能比整个结合位点的亲和力低。[0209]单链抗体是指含有轻链(vl)可变区和重链(vh)可变区的基因工程分子，轻链(vl)可变区和重链(vh)可变区通过作为基因融合单链分子的合适多肽连接子来连接。此类单链抗体也称为"单链fv"或"sfv"抗体片段。通常，fv多肽进一步包括vh和vl结构域之间的多肽连接子，使sfv形成抗原结合所需结构。[0210]"特异性结合"或"特异性"是指抗体或其它制剂能够可检测地与抗原上显示的表位结合，而与其它蛋白质或结构的可检测反应性相对较小。特异性可通过结合或竞争性结合试验(例如，使用biacore仪器)相对地确定。特异性可表现为，例如，与特异性抗原结合的亲和力/亲合力与其它无关分子的非特异性结合的亲和力/亲合力之比约10:1、约20:1、约50:1、约100:1、10.000:1或更大。[0211]抗体优化策略有时采用随机诱变法进行。在这些情况下，位置是随机选择的，或者采用简单的规则改变氨基酸，例如，将所有残基依次改变为丙氨酸，可使用丙氨酸扫描诱变绘制抗体的抗原结合残基等。基于序列的亲和力成熟法也可用于提高抗体的结合亲和力。[0212]本发明范围内的抗体可以是任何同种型，包括igg、iga、ige、igd和igm。igg同型抗体可进一步细分为igg1、igg2、igg3和igg4亚型。iga抗体可进一步细分为iga1和iga2亚型。[0213]配方和施用[0214]在一些实施例中，将表达本发明的car的t细胞施用于受试者。本文所用的术语"受试者"是指生物体，包括灵长类动物等哺乳动物。可以从所公开的治疗方法中受益的哺乳动物物种包括但不限于猿猴、黑猩猩、猩猩、人猴；以及狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠等驯养动物和实验动物。在一个具体的实施例中，受试者是人。[0215]在一些实施例中，可以使用细胞转移等本领域公知的方法，将根据本发明设计的有效量的car表达t细胞施用于需要治疗疾病的患者。[0216]在一个实施例中，从患有将用本发明的car-t细胞进行治疗的疾病的患者或从供体受试者身上提取混合细胞群。随后，在分离的t细胞中对本发明的car进行逆转录病毒或慢病毒介导表达，并将治疗有效量的1到1014个car-t细胞输注给患者。本发明的car-t细胞能够在体内复制，可导致持续的疾病控制长期且持续存在。例如，输注的car-t细胞在施用后可以在患者体内持续存在至少一个月。在一些实施例中，基因工程car-t细胞的持续群在施用后在人体内持续存在至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。[0217]本发明还提供了一种药物组合物，包括一个或多个本发明的car-t细胞。在某些实施例中，组合物包括至少1、10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个car-t细胞，或超过1014个car-t细胞的任何数量。[0218]在一些实施例中，基因工程car-t细胞的持续群包括选自曾施用于人类的t细胞、曾施用于人类的t细胞的后代，以及其组合的至少一种细胞。[0219]在一些实施例中，本发明的car-t细胞可稳健扩增体内t细胞。在优选实施例中，本发明的car-t细胞进化成特异性记忆t细胞，所述记忆t细胞可被重新激活，以抑制最初用car-t细胞治疗疾病的任何额外的肿瘤细胞或免疫细胞。[0220]在一些实施例中，注入患者体内的本发明的car-t细胞可消除癌症或免疫相关疾病患者体内的癌细胞或免疫细胞。[0221]在一些实施例中，将本发明的car-t细胞注入患者体内，可以减轻患有癌症或免疫相关疾病的患者体内的肿瘤负荷或免疫反应。[0222]在其它实施例中，将本发明的car-t细胞注入患者体内，可以防止癌细胞或引起免疫性疾病的免疫细胞的复发。[0223]在又一些实施例中，注入患者体内的本发明的car-t细胞可预防患有癌症或免疫相关疾病的高风险受试者体内出现癌症或免疫相关疾病，其中风险可基于患者的既往史、家族史、各种风险因素的积累或存在癌前病变或视为免疫相关疾病前兆的免疫系统而改变。[0224]本发明的car-t细胞可以单独施用，但优选地作为药物组合物施用；所述药物组合物通常包括根据预定施用途径选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体。[0225]car-t细胞可通过任何合适的途径施用给需要施用的患者。应用方式可以不尽相同，例如，在某些实施例中，含有本发明的组的合物car-t细胞通过静脉注射、皮下注射、腹膜注射、肌肉注射和阴道注射或直接在肿瘤或炎症的部位注射的方式施用。无论如何，任何常规的疫苗施用方法均适用。疫苗的剂量将取决于施用途径，并根据宿主的大小而有所不同。[0226]在一个实施例中，本发明的组合物通过注射施用。[0227]一些进一步合适的施用途径包括但不限于口服、直肠、鼻腔、局部(包括口腔和舌下)、皮下、阴道或肠外(包括皮下、肌内、静脉、皮内、鞘内和硬膜外)施用。[0228]对于静脉注射和在病灶部位注射，活性成分以胃肠外可接受的水溶液形式存在；所述水溶液不含热原，具有适当的ph值、等渗性和稳定性。[0229]本领域的技术人员可使用等渗赋形剂(例如，氯化钠注射液、林格注射液、林格乳酸注射液等)来制备合适的溶液。根据需要，可以添加防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或一些其它的添加剂。口服药物组合物可为片剂、胶囊、粉剂或口服液等形式。明胶或佐剂等固体载体均可包括在片剂中。液体药物组合物通常包括水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油等液态载体。还可以包括生理盐水、葡萄糖或其它糖类溶液或乙二醇、丙二醇或聚乙二醇等二醇类。[0230]材料和方法[0231]pbmc是从供体的血液或者血库中获得的血沉棕黄层分离出来的。在肝素化采血管(vwr,west chester,pa.)中抽取约150ml供体的血液，然后在pbs中以1:1的比例稀释。血沉棕黄层在pbs中稀释至最终体积为200ml。在3体积的ficoll-paque plus(ge healthcare bio-sciences,pittsburgh,pa.)上方对大约4体积的稀释样品分层，然后在抑制无的情况下，在室温下以800rcf离心30分钟。在macs缓冲液中获得、清洗并再悬浮界面上的细胞，以便进行进一步分离。[0232]对于动物的体内研究和体外实验，包括但不限于raji、k562、nalm-6、293t的细胞系均从atcc处购买，并按照atcc的说明进行维护。细胞系每2-3天传代一次，并使用处于对数生长期的细胞进行实验。[0233]通过密度梯度离心法分离pbmc。用cd3磁性微珠从pbmc中分选t细胞后，在含有cd3/cd28刺激剂的完全t细胞培养基中培养这些细胞。t细胞在分离后二十四小时内用浓缩慢病毒转导。之后，每天都会用培养基调整细胞密度。[0234]细胞的分离方式是，先利用macs微珠(miltenyi biotec,auburn,calif.)，然后按照制造商的协议使用ls柱(miltenyi biotec)来分离。为了洗脱结合细胞，从磁场中移出柱。将3ml的macs缓冲液加入柱中，并收集洗脱的细胞。[0235]对于流式细胞术来说，采用标准程序来对细胞染色。简而言之，细胞以1×107/ml的浓度悬浮在pbs+3％fbs中进行分析，或在分类缓冲液(pbs，25mm hepes，1mm edta，0.1％bsa)中进行分类。抗体的添加量根据制造商的建议量或采用滴定法确定。通过cytoflex(beckman coulter life sciences,indianapolis,in)采用流式细胞术分析细胞，并按照标准程序操作。为了富集cd4+和/或cd8+细胞亚群，用抗cd4抗体和/或抗cd8抗体对磁分离细胞进行染色，并在facscalibur细胞分选仪上进行分选。[0236]本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物在不与本说明书的明确教导相抵触的情况下，均通过引用全部引入，包括所有图和表格。[0237]下文是说明实施本发明的程序的实例。这些实例均不应解释为具有限制性。除非另有说明，所有百分比均按重量计算，所有溶剂混合物的比例均按体积计算。[0238]实例1—载体构建和慢病毒包装[0239]通过使用ns3蛋白酶开关的不同变体，构建了同时编码可切换的抗cd19 car和可切换的抗cd22 car的慢病毒载体。通过自分裂病毒2a肽序列来实现两个靶标的共同表达。每个car包括除cd3-ζ激活结构域(第三代)外的cd28和4-1-bb共刺激结构域。对于慢病毒包装，293t细胞与表达载体、pspax2和pmd2.g共同转染。下表示出了本发明的car名称和相应的car结构。[0240][0241][0242]实例2—体外功能分析[0243]t细胞转导后，提供了不同的药物，并且cd19-car和cd22-car通过流式细胞术利用cd19蛋白和cd22蛋白进行检测。此外，还确定了双靶点可转换car-t细胞的生物学特性。例如，cd25和cd69抗体用于激活实验，cfse用于增殖试验，cd4、cd8、ccr7和cd45ra抗体用于确定t细胞亚群，annexin-v用于凋亡试验。此外，进行细胞毒试验(钙黄绿素-am释放)、cd107a试验和细胞因子制备检测。这些试验在检测效力和确定转换系统如何工作方面是非常重要的。[0244]实例3—动物实验[0245]通过shrna对nalm-6/raji细胞系进行基因编辑以产生cd19阴性细胞和/或cd22阴性细胞。将荧光素酶的突变体构建到这些细胞中，因此表达不同抗原的细胞仅与唯一的荧光素[14]发生反应。通过这种方式，可通过测量不同靶细胞的发光强度来确定双靶开关的活性。[0246]将修饰nalm-6/raji细胞系静脉注射到nsg小鼠(nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj)体内。每周腹腔注射修饰荧光素后进行生物发光成像。肿瘤负荷通过外周血、骨髓和脾脏流式细胞术测量。[0247]实例4—杀肿瘤分析[0248]阳性靶细胞(raji)和阴性靶细胞(k562)用钙黄绿素-am(biolegend)标记，然后与效应细胞(cart细胞与asv)在96孔板中以不同比例进行共培养。共培养使用的培养基是pbs+5％fbs。具有共培养的靶细胞和pbs+5％fbs的孔用作自发释放孔，具有共培养的靶细胞和裂解液的孔用作最大释放孔。孵化3小时后对培养物进行离心，并将上清液转移到另一个96孔板。用酶标仪测量每个孔的荧光值(f)，并根据以下公式计算肿瘤杀伤效率：裂解率＝((f实验孔-f自发释放)/(f最大释放-f自发释放)×100％。[0249]表1示出了体外杀肿瘤试验的结果。图6a至图6b中也示出了结果；这些结果表示car转导细胞在有和没有阿那匹韦的情况下的细胞死亡情况和cd4/cd8分布图。[0250][0251][0252][0253][0254][0255][0256][0257][0258][0259][0260][0261][0262][0263][0264][0265][0266][0267][0268][0269][0270][0271][0272][0273][0274][0275][0276][0277][0278][0279][0280][0281][0282][0283][0284][0285][0286][0287][0288][0289][0290][0291][0292][0293][0294][0295][0296][0297][0298][0299][0300][0301][0302][0303][0304][0305][0306][0307][0308][0309][0310][0311][0312][0313][0314][0315][0316][0317][0318][0319][0320][0321][0322][0323][0324][0325][0326][0327][0328][0329][0330][0331][0332][0333][0334][0335][0336]car-t 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