口服肽施用的制作方法 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术口服肽施用1.相关申请2.本技术要求于2020年1月17日提交的澳大利亚临时专利申请第2020900129号的优先权，所述澳大利亚临时专利申请的全部内容特此通过交叉引用并入。技术领域3.本发明涉及用于通过口服途径向受试者施用处理剂量的如胰岛素等多肽和蛋白质的组合物和方法。背景技术：4.在患有多种疾病或多种病状的情况下，受试者无法产生足够的肽来维持健康。这些病状包含例如人生长激素不足导致的生长和发育病状，以及缺乏胰岛素导致的糖尿病。在哺乳动物中，存在许多因肽产生受损而引起的其它病状的实例。5.i型糖尿病，也被称为胰岛素依赖型糖尿病或青少年糖尿病，是一种慢性病状，其特征在于胰腺无法产生胰岛素。胰岛素是仅由胰腺的胰岛细胞产生的以用于调控血流中的葡萄糖量的激素。在非糖尿病受试者中，当血流中的葡萄糖水平上升时，由胰腺向血流中分泌胰岛素，使得将葡萄糖用作能量或储存作为糖原的如肌肉和肝等全身细胞摄取所述葡萄糖，并且因此所述葡萄糖从血流中流出。随着血糖水平降低，胰岛素的分泌也会减少。6.被诊断为患有i型糖尿病的受试者无法产生胰岛素，并且因此无法调控自身血流中的葡萄糖量。血糖水平过低和过高都可能对健康产生严重影响。虽然i型糖尿病受试者可以通过非药物干预来限制血液中葡萄糖的变化，如监测大量营养素的摄入以及限制单一碳水化合物过高的食物等，但仍然需要胰岛素来调控葡萄糖和将葡萄糖摄取到细胞中，尤其是在饭后。7.ii型糖尿病通常发生在成年人身上，特别是体重超重的成年人。在疾病的早期阶段，ii型糖尿病与胰岛素抵抗和胰岛素循环水平升高相关。各种口服和可注射药物用于治疗ii型糖尿病。许多患有长期ii型糖尿病的人最终也需要胰岛素疗法，这是因为胰岛素产生变得不足以调控全身代谢。8.糖尿病患者通常需要一整天频繁监测其血糖，并且在血液水平过低的情况下摄取葡萄糖，或者在血液水平过高的情况下通常通过侵入性皮下注射来肠胃外施用胰岛素。由于胰岛素是蛋白质并且依赖于其三级结构来被胰岛素受体识别，因此目前无法通过口服方式递送。这是因为在消化道中发现的如胰岛素等肽过大而无法被吸收并完整地进入到全身细胞，并且由于消化道中的低ph和蛋白酶导致的恶劣环境破坏了这种结构，并且使胰岛素失效。蛋白质通常也不会在其三级结构完整的情况下被肠道吸收。9.一种方法一直是提供一种胰岛素调配物，所述胰岛素调配物包含如氯喹等用于延迟胰岛素在胃中的降解的赋形剂以及吸收增强剂、抗氧化剂和粘合剂。然而，此类调配物往往在肠道中吸收缓慢，导致作用时段过长，在一些情况下，这可能会导致胰岛素活性比可商购获得的长效注射的活性长。此类延长的活性曲线可能使受试者更难以维持恒定的血糖水平，和/或可能导致初始活性期延长，使得此类调配物不太能够快速治疗高血糖症发作。10.另一种避免通过胃肠道递送胰岛素的方法是将胰岛素调配成通过口腔和鼻膜透皮吸收的剂型，如喷雾剂、口香糖或锭剂等。然而，此类调配物通常要求胰岛素不受环境影响，如在微乳液调配物中，并包含赋形剂，如缓冲剂、渗透增强剂和稳定剂等。此类调配物通常还需要冷藏储存，以确保胰岛素的完整性。还应注意的是，通过口腔和鼻腔膜的吸收可以避免肝代谢。11.另一种方法已将胰岛素拴系到纳米颗粒以供口服递送。此类纳米颗粒先前是由生物聚合物制成的。在一个此类实例中，描述了这样一种壳聚糖，将已官能化为季铵盐形式的所述壳聚糖作为核，并且然后将其用透明质酸涂覆以吸收到肠道的粘液层。然而，由于这些纳米颗粒过大(近似平均大小为约120nm)，以至于纳米颗粒本身无法被吸收，而需要在肠道中释放胰岛素以供使用。在另一个此类实例中，已描述了金纳米颗粒将含硫醇的蛋白质连接到金表面。然而，这些纳米颗粒作为透皮剂在通过口腔和鼻粘膜吸收方面效果最佳，而通过肠道吸收的效果则较差。如下文所指出的，舌下吸收避免了肝首过代谢。12.虽然以上讨论涉及将胰岛素作为基于蛋白质或基于肽的门诊疗法的主要实例，但在目前的技术水平中存在的与胰岛素递送相关的问题对于其它蛋白质和肽也存在，如果被调配成口服施用，所述蛋白质和肽可能对受试者的治疗有益。13.因此，需要促进在被吸收时维持生物活性的治疗性蛋白质或肽(例如，胰岛素)的非侵入性施用的组合物和方法。期望组合物和方法能够支持口服施用，从而允许通过肠进行吸收并进入到肠血管中。这可以提供一种方式来克服在口服递送如胰岛素等蛋白质和肽期间遇到的一些现有问题。此外，在一些特定的应用中，可能期望此类组合物和方法主要作用于肝，即胰岛素作用的主要靶标，这可以减少胰岛素的循环全身水平，并限制如低血糖和增重等不良反应。技术实现要素：14.本发明旨在缓解现有方法中的至少一种现有缺陷，所述方法用于治疗由受试者的内源性肽或蛋白质产生不足引起的病状，和/或口服施用蛋白质和肽来治疗此类病状。15.在本发明的第一方面中，提供了一种组合物，所述组合物包括治疗量的缀合物，其中所述缀合物包括量子点和治疗有效的肽或蛋白质。所述肽或蛋白质的大小可以小于约30kda。所述大小可以介于1kda与25kda之间，或介于3kda与25kda、10kda与20kda、5kda与30kda或15kda与30kda之间，即，所述大小可以为约1kda、2kda、3kda、4kda、5kda、6kda、7kda、8kda、9kda、10kda、11kda、12kda、13kda、14kda、15kda、16kda、17kda、18kda、19kda、20kda、21kda、22kda、23kda、24kda、25kda、26kda、27kda、28kda、29kda或30kda。其可以具有可用于连接到qd的伯胺基。其可以选自由以下组成的组：胰岛素、生长激素、成纤维细胞生长因子21(fgf21)、胰高血糖素样肽-1(glp-1)激动剂、glp-2受体激动剂、血小板源性生长因子(pdgf)β受体调节剂、整合素α-4/β-7拮抗剂、pyy(3-36)类似物、加压素、白介素(大小小于30kda)、脑啡肽、内啡肽、或任何其它合适的蛋白质或肽和其组合。所述胰岛素可以是天然胰岛素(如猪来源天然胰岛素)，或者可以是长效类似物(如甘精胰岛素或地特胰岛素)、中效类似物(如鱼精蛋白锌胰岛素或中性鱼精蛋白胰岛素)或者速效类似物(如门冬胰岛素、赖脯胰岛素或葡萄糖胰岛素)。所述glp-1激动剂可以选自利拉鲁肽或艾塞那肽，或者其可以是任何其它合适的glp-1激动剂。所述glp-2激动剂可以是阿普拉鲁肽，或者其可以是任何其它合适的glp-2激动剂。所述pdgfβ受体调节剂可以是bot191(也称为fibroferon)，或者其可以是任何其它合适的pdgfβ受体调节剂。所述整合素α-4/β-7拮抗剂可以是pn-10943，或者其可以是任何其它合适的整合素α-4/β-7拮抗剂。小于30kda并且包括至少一个伯胺基的其它合适的肽和蛋白质可以是本领域技术人员已知的并且将适于qd缀合。16.以下选项可以单独或以任何合适的组合与第一方面或第二方面结合使用。17.所述组合物可以被调配用于口服施用。18.所述量子点可以是ag2s量子点。所述量子点的平均直径可以介于约1nm与约20nm之间。其可以是约1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm或20nm。所述量子点的平均直径可以小于约10nm。19.所述缀合物可以进一步包括聚合物。所述聚合物可以是生物聚合物。生物聚合物可以覆盖缀合物的至少一部分或者其可以基本上覆盖缀合物的全部。所述生物聚合物可以选自由以下组成的组：肝素、明胶、透明质酸、壳聚糖、半乳糖、葡萄糖和其任何组合。所述聚合物或所述生物聚合物可以覆盖所述缀合物的至少一部分。这些聚合物或生物聚合物可以在穿过胃肠道期间保护缀合物的蛋白质或肽或特异性靶向肝中的肝细胞。在口服施用之后，所述缀合物可以积聚在受试者的肝细胞的表面中或其表面上。20.所述组合物可以用于施用于可能已被诊断为患有与内源性肽产生不足有关的病状的受试者。所述病状可以是i型糖尿病或ii型糖尿病或与内源性肽产生不足有关的另一种病状。所述组合物可以用于施用于可能已被诊断为患有需要通过外源性(即，非天然存在的)蛋白质或肽治疗的病状的受试者。所述病状可以是糖尿病性肾脏学、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肾纤维化、乳糜泻、炎性肠病(ibd)、溃疡性结肠炎或另一种胃肠疾病。所述病状可以通过将蛋白质或肽递送到肝、小肠、肾、胰腺或其它胃肠器官或组织来治疗或可治疗。21.所述组合物可以进一步包括药学上可接受的赋形剂。22.在本发明的第二方面中，提供了一种治疗有需要的受试者的高血糖症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗量的缀合物，所述缀合物包括量子点和胰岛素。23.在本发明的第三方面中，提供了一种治疗有需要的受试者的内源性肽产生不足的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗量的缀合物，所述缀合物包括量子点和有效替代不足的内源性肽的蛋白质或肽。24.在本发明的第四方面中，提供了一种治疗患有病状的受试者的方法，其中所述病状可通过施用治疗性外源性肽或蛋白质来治疗，所述方法包括向所述受试者施用治疗量的缀合物，所述缀合物包括量子点和所述治疗性外源性肽或蛋白质。25.以下选项可以单独或以任何合适的组合与第二、第三或第四结合使用。26.所述缀合物可以口服施用于所述受试者。所述受试者可能已被诊断为患有糖尿病或导致所述受试者的组织中内源性肽或蛋白质的量不足的另一种病状。受试者的正在治疗的糖尿病可以是i型糖尿病或ii型糖尿病。27.所述量子点可以是ag2s量子点。所述量子点的平均直径介于约5nm与约20nm之间，或者可以为约1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm或20nm。28.所述缀合物可以进一步包括聚合物。所述聚合物可以是生物聚合物。所述生物聚合物可以至少部分地涂覆所述缀合物，或者其可以基本上涂覆所述缀合物。所述生物聚合物可以选自由以下组成的组：肝素、明胶、透明质酸、壳聚糖、半乳糖、葡萄糖和其任何组合。29.在本发明的第五方面中，提供了一种向受试者的器官递送肽或蛋白质的方法，所述方法包括向所述受试者口服施用缀合物，所述缀合物包括量子点和所述肽或蛋白质，其中所述器官选自肝、胰腺、小肠或肾。30.以下选项可以单独或以任何合适的组合与第五方面结合使用。31.所述量子点可以是ag2s量子点。所述ag2s量子点的直径可以介于约5nm与约20nm之间。32.所述缀合物可以任选地包括聚合物。所述聚合物可以是生物聚合物。所述生物聚合物可以选自由以下组成的组：明胶、壳聚糖、半乳糖、葡萄糖和其任何组合。33.在本发明的第六方面中，提供了一种降低受试者的血糖的方法，所述方法包括向所述受试者口服施用缀合物，所述缀合物包括如本文所描述的量子点和胰岛素，其中所述量子点是介于约5nm与约20nm之间的ag2s量子点，并且其中所述缀合物在肝细胞中代谢或与所述干细胞的表面结合，由此将所述胰岛素释放到所述受试者的血流中。34.在本发明的第七方面中，提供了一种缀合物用于制造用于治疗i型糖尿病和ii型糖尿病的药物的用途，所述缀合物包括如本文所描述的量子点和胰岛素。所述药物可以被配制成口服施用。所述药物可以进一步包括聚合物或生物聚合物。35.在本发明的第八方面中，提供了一种缀合物在制备药物中的用途，所述缀合物包括量子点和蛋白质或肽。所述药物可以用于治疗受试者的肽或蛋白质的内源性产生不足，或者其可以用于提供治疗活性的外源肽或蛋白质。所述药物可以被配制成口服施用。所述药物可以进一步包括聚合物或生物聚合物。附图说明36.现在将参考附图，仅通过举例来描述本发明的优选实施例，在附图中：37.图1示出了用于合成和表征本发明的水溶性ag2s量子点的方法的示意性表示。具体地：(a)示意性展示了环己烷可溶性qd的产生。(b)由658nm激发产生的1175nm nir ii发射。(c)显示了qd的表面上的十二烷c-h链的ftir光谱。(d)qd的示出了排列、大小和晶格结构的tem图像。(e)cooh封端的qd的相转移以及1mm qd于有机溶剂和水中的代表性样品的示意图。(f)示出了oh官能团以及c＝o指纹、c-o指纹和oh指纹的ftir光谱。(g)单分散于水中的qd的tem图像。38.图2示出了量子点的蛋白冠和合成表面拓扑结构改变。具体地：(a)水溶性qd的ftir；(b-d)用(b)rpmi培养基、(c)小鼠血清和(d)bsa温育24小时后形成的蛋白冠。蛋白冠显示出胺官能团(胺i和胺ii)的形成。(f-g)qd表面拓扑上的合成聚合物沉积。灰色插入框示出原材料的ftir光谱，其中灰色箭头示出opus向导标识的决定峰。生物聚合物与qd的结合是使用点击化学(edc/nhs偶联)进行的。qd-肝素(e)和qd-明胶(f)均显示出与原始生物聚合物的光谱类似的ftir光谱。黑色箭头示出opus向导标识的决定峰，所述决定峰与插图中示出的峰相对应。所标识的峰为胺i、胺ii和胺iii。sc-ins或100iu/kg qd-ins对血糖高于31mg/dl的小鼠进行治疗。在-15分钟、0分钟、15分钟、30分钟、45分钟和60分钟时收集血糖样品。此图中的数据示出了血糖相对于初始血糖浓度的变化。数据点示出了平均值±sd。45.图9显示出与qg-胰岛素的处理剂量(25.6ng/ml)相比，ag2s qd在3-4个月大的wt c57bl/6j小鼠的体内毒性情况发生在256μg/ml时。46.图10示出了qd-利拉鲁肽缀合物对15个月大wt c57bl/6j小鼠的(a)血糖水平和(b)体重的影响。在腹膜内注射250μg/kg利拉鲁肽后30分钟，或在以1250μg/kg或2500μg/kg口服强饲qd-利拉鲁肽后两小时获取血糖水平(图10a)。在每周用2500μg/kg口服qd-利拉鲁肽治疗3次后，测量体重(图10b)。47.图11示出了100,000dpm剂量的口服14c标记的二甲双胍、14c标记的qd-二甲双胍缀合物(np-二甲双胍)和14c标记的qd(np)在施用后经24小时在3-4个月大的wt c57bl/6j小鼠(每个治疗组n＝3)中的分布。48.定义49.以下定义旨在使技术人员能够更好地理解本文所公开的本发明。这些旨在是一般性的，而不旨在将本发明的范围仅限制于这些术语或定义。50.如本文所使用的，术语“血糖”是指在受试者循环系统的血液中循环的葡萄糖量。因此，相关术语“血糖减少(lowering blood glucose)”或“血糖降低(decreasing blood glucose)”等应理解为与较早时间相比，即可能在施用治疗之前，受试者血液中循环的葡萄糖更少。同样，如“血糖升高(raising blood glucose)”或“血糖增加(increasing blood glucose)”等术语应理解为与较早时间相比，在受试者血液中循环的葡萄糖更多。51.术语“高血糖症(hyperglycaemia)”和“高血糖(hyperglycaemic)”等是指受试者的血糖水平高于健康受试者的正常血糖范围。同样，术语“低血糖症(hypoglycaemia)”或“低血糖(hypoglycaemic)”等是指受试者的血糖水平低于健康受试者的正常血糖范围。52.如本文所使用的，术语“量子点”是指平均大小分布大约小于20nm的纳米颗粒材料。此类量子点通常表现出的光学特性和/或电子特性还与由相同材料形成但大小较大的颗粒的光学特性和/或电子特性不同。53.如本文所使用的，术语“缀合物”是指两种或更多种物质和/或结构相缔合的排列。例如，本发明的量子点可以与胰岛素蛋白链相缔合，以形成量子点-胰岛素缀合物。此类缔合可以采取任何合适的化学形式，只要发现两个或更多个缀合元素非常接近。54.如本文所使用的，术语“聚合物”是指通过将单体与共价键连接而形成的分子或大分子。单体可以相同或者可以不同。单体可以形成重复单体亚基(例如，聚乙烯)，或者所述单体可以具有非重复序列(例如，蛋白质)。术语“聚合物”应理解为涵盖合成来源和生物来源两者的聚合物。55.如本文所使用的，术语“生物聚合物”是指生物来源的聚合物链，其中聚合物由生物系统产生，和/或聚合物链由具有生物来源的单体部分形成。56.如本文所使用的，术语“肽”或“多肽”是指通过肽键在序列上连接的短氨基酸链，通常长度介于约2个与约50个氨基酸之间。如本文所使用的，术语“蛋白质”是指长度比肽长的氨基酸链，即在序列上有约51个氨基酸或更多个。57.参考本发明的组合物的施用，术语“口服”是指递送到施用有组合物的受试者的口中，期望所述组合物的大部分(如果不是全部的话)在胃肠道中被吸收。在本发明的上下文中，术语“口服”并不旨在是指通过粘膜的透皮吸收。58.如本文所使用的，术语“施用(administration)”或其变体，包含但不限于“施用(administer)”或“施用(administering)”是指向受试者提供治疗性组合物。59.如本文所使用的，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“疗法(therapy)”、“治疗性(therapeutic)”等是指施用组合物以改善受试者的不良医学病状或减轻其症状。因此，在本发明的上下文中，施用“治疗性缀合物”的效果涵盖减轻i型糖尿病的症状中的至少一种症状，如降低高血糖受试者的血糖，其可以作为治愈性疗法或防治性疗法施用。60.如本文所使用的，术语“受试者”是指任何要治疗的人或非人动物。因此，本发明的组合物可以适于人治疗，并且还可以适于非人动物的兽医治疗，包含伴侣动物，如猫和狗或农场动物，如猪、马、羊和牛。61.如本文所使用的，术语“流体动力学直径”是指当缀合物分散于水中时，靠近表面的水分子的排列程度。其被定义为完美的固体球体的直径，当所述球体分散于水中时，表现出的流体动力学摩擦与缀合物的流体动力学相同。换句话说，由于本文所描述的缀合物的表面具有静电电荷，因此与表面相邻的水分子将通过静电力排列并与表面缔合，以为颗粒提供基本上确定的水层外壳，并且因此其流体动力学直径相当于未发生此类水缔合的固体颗粒的直径。62.如本文所使用的，术语“包括(comprising)”意指“包含(including)”。单词“包括(comprising)”的变体，如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”具有相应变化的含义。如本文所使用的，术语“包含(including)”和“包括(comprising)”具有非排他性。如本文所使用的，术语“包含”和“包括”并不意味着指定的一个或多个整数表示整体的主要部分。63.如本文所使用的，术语“基本上包括”意指“排除有意添加的其它另外的组分”，或“仅旨在存在以下所陈述的元素”。在限定的组合物或装置中，非有意存在的另外的组分成分是可接受的。具体实施方式64.本发明涉及一种向有需要的受试者提供治疗性肽和蛋白质的组合物。所述组合物可以用于一种治疗受试者的内源性肽产生不足的方法，或者一种用于向受试者提供治疗性外源性肽或蛋白质的方法。受试者可能患有因至少一种内源性肽水平不足引起的病状，并且需要接受替代疗法。受试者内源性蛋白质产生不足的病状的一个众所周知的非限制性实例是i型糖尿病。因此，在一个实施例中，本发明涉及降低受试者的血糖，并且还涉及一种用于降低受试者的血糖的方法。受试者可能患有i型糖尿病或ii型糖尿病，在这种情况下，受试者无法产生胰岛素，并且因此需要接受疗法以维持正常的血糖水平。受试者可能是高血糖患者，并且需要施用处理剂量的胰岛素来降低其血糖水平。受试者可能患有因至少一种内源性肽水平不足引起的另一种病状，并且需要接受替代疗法，其中一个实例是i型糖尿病。受试者可能患有需要递送治疗性外源性肽或蛋白质的病状，例如：用于治疗糖尿病性肾脏学、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(nash)和肾纤维化的pdgf受体β调节剂；用于治疗乳糜泻和其它胃肠疾病的glp-2受体激动剂；或用于治疗炎性肠病(ibd)和溃疡性结肠炎的整合素α-4/β-7拮抗剂。本发明的组合物可以有利地将治疗性内源性或外源性肽和蛋白质直接递送到受病状影响的器官或细胞，和/或递送到能够释放肽或蛋白质的器官，其过程类似于用于分配内源性肽和蛋白质的自然过程。65.在一个实施例中，本发明的组合物包括胰岛素与量子点的缀合物。发明人惊奇地发现，此类缀合物在口服施用和通过肠壁吸收之后可以进入受试者的循环系统。然后，量子点通过门静脉循环将胰岛素递送到肝细胞，在所述门静脉循环中胰岛素激活胰岛素受体，然后肝细胞通过胞吞作用吸收缀合物，以进行随后的代谢并通过胆汁的排泄。正如下文将更详细地描述以及参考部分实例，胰岛素(作为适于替代疗法的内源性蛋白质的实例)可以有效地口服施用于受试者，以降低血糖水平，然而技术人员应意识到，本文所例示的此类组合物和方法可以扩展到其它合适的治疗性肽，具体地从肝施用中受益的肽。66.胰岛素67.胰岛素是一种由健康受试者胰腺中的β或朗格汉斯胰岛细胞(islet of langerhans)产生和分泌的肽激素。在健康受试者中，胰岛素分泌通常响应于受试者的血糖水平的升高而发生，其作用是使受试者的细胞从血液系统中吸收葡萄糖，其中过量的葡萄糖聚合并储存在肝和肌肉中作为糖原，或者转化为脂肪酸以用于储存在脂肪组织中作为脂肪。68.从结构上看，胰岛素是两个肽链通过二硫键连接而成的二聚体，本文的二聚体是指胰岛素分子。正如技术人员所理解的那样，所得四级结构对于胰岛素与嵌入在细胞膜的胰岛素受体结合的活性非常重要，其中任何二硫键的破坏或肽链的裂解都可能导致活性减少或没有活性。由于胰岛素施用是目前可用于治疗i型糖尿病的唯一疗法，并且也是患有ii型糖尿病的人的主要治疗选项，因此，以维持胰岛素分子的四级结构的完整性的方式施用胰岛素非常重要。69.通常，目前用于人类治疗的胰岛素是利用重组dna技术产生的人胰岛素。来自其它物种的胰岛素，如来自猪的胰岛素先前也用于治疗人。然而，物种之间的氨基酸序列和所得的胰岛素结构略有不同。例如，猪来源胰岛素相较于人来源序列相差一个氨基酸残基，并且牛来源胰岛素相较于人来源序列相差三个氨基酸残基。这些细微差异意味着，使用从另一种物种采集的胰岛素不太可能像使用同一物种的细胞产生的胰岛素那样有效。然而，跨物种施用在疗法中可以仍然是有效的。例如，在重组dna技术可用之前，由于两个氨基酸序列相近，经常从猪身上采集胰岛素以用于人疗法。胰岛素衍生物还可具有不同的活性长度。例如，胰岛素可用作长效类似物(如甘精胰岛素或地特胰岛素)、中效类似物(如鱼精蛋白锌胰岛素或中性鱼精蛋白胰岛素)或者速效类似物(如门冬胰岛素、赖脯胰岛素或葡萄糖胰岛素)。70.因此，本发明不限于使用任何特定氨基酸序列或来源物种的胰岛素分子。“来源物种”意指本文中使用的胰岛素与由所述来源物种的健康成员自然产生的胰岛素具有相同的序列。“来源物种”不必与受试者物种相同。胰岛素可以具有与受试者物种的天然序列相同或类似的序列，或者可以是具有有效治疗受试者的四级蛋白质结构的不同物种。氨基酸序列优选地是天然的(即，由受试者物种的细胞产生)，但也可以是经化学修饰，只要任何此类修饰不会对受试者施用胰岛素后的功效产生显著影响。71.本发明中使用的胰岛素可以通过任何适当的方法产生。例如，其可以通过使用重组dna技术来制备、收集和纯化，或者可以从动物或经培养的表达胰岛素的哺乳动物细胞集合中采集，或者可以通过化学合成来制备。其可以作为一种盐来产生。其在本文中可以用作药学上可接受的胰岛素盐。其可以是一种长效、中效或短效的胰岛素衍生物。72.量子点73.本发明中使用的缀合物包括在本文中称为量子点的纳米颗粒。根据定义，量子点是一种直径至多约50-100nm的大小相对较小的纳米颗粒，并且其显示出与由相同物质形成但大小较大的颗粒或整体材料的电子特性和/或光学特性相比不同的电子特性和/或光学特性(或“光电”特性，如本文中可互换使用)。量子点的可以观察到的光学特性的实例是光致发光，由此电磁光谱中的紫外部分的波长被量子点吸收，将电子激发到更高能级，然后降级为较低能量的电子壳，释放出作为电磁光谱可见部分的波长而被观察到的能量量子。量子点的可以观察到的电子特性的实例是超导性。量子点的这些光电特性可以取决于粒度和其构造中使用的材料。在本发明的上下文中，在用合适的成像技术施用包括这些缀合物的组合物后，量子点的光电特性可以用于诊断性地确定缀合物在受试者不同组织中的位置。74.量子点可以由任何合适的材料形成。“合适的”意指量子点必须包括一种材料或多种材料，所述材料能够形成足够小以被表征为量子点的颗粒，其显示出量子点特性的光电特性，并且能够在天然材料表面上或在官能化后与蛋白质缔合。“官能化”意指表面在化学反应后发生变化。由于用于对受试者进行治疗性施用，因此本发明的量子点还必须对所述受试者无毒并且耐受性良好。由于所述量子点用于治疗慢性病状，因此其必须在疗法后不久被基本上消除(即不积聚在受试者的身体、组织或细胞中)。在这点上，“基本上消除”可能意味着在给定时间内，所施用的超过约75％的量子点从受试者体内消除。优选地，约75％的量子点将在施用后48小时内、24小时内或12小时内从受试者体内消除。75.所述量子点可以是由单一材料形成的核型量子点，如锌或银等非重金属的硫属化物(例如，硒化物、硫化物或碲化物)。所述量子点可以由包括ag2s、zns或任何其它合适材料或由其组成的材料形成。所述量子点可以由ag2s形成，这被认为对哺乳动物无毒。所述量子点可以是由两种不同材料形成的核壳型量子点，由此将一层更高带隙的超导材料涂覆在核上。壳层必须由无毒材料组成。核壳型量子点的常见实例是施涂在包括zns的核上的由cdse组成的壳层，尽管由于镉(一种已知的有毒重金属)的存在，此层材料不适合在本发明中使用。所述量子点可以是合金量子点，由此通过合金化组合两种或更多种半导体材料。合金量子点可能会产生不同于组成材料中的任一种的整体特性的特性。量子点可以是结晶的。任何这些类型的量子点都可以适用于本发明。76.众所周知，可以使用若干种不同的方法来产生、制造或制备量子点。本发明的量子点可以通过目前已知的任何合适的方法来产生或可以开发。例如，所述量子点可以通过胶体合成、等离子体合成、自组装或电化学组装来产生。77.在纳米材料领域，就平均粒度而言，与纳米颗粒不同，量子点的可接受大小上限似乎存在一些分歧。在此领域的一些已发表文献中，量子点被定义为小于20nm；在其它文献中，量子点被定义为小于50nm；并且在又其它文献中，量子点被定义为介于1nm与100nm之间。本发明的量子点在本文中通常被定义为直径小于20nm的颗粒。因此，本文所公开的每个量子点的直径可以介于约1nm与约20nm之间，或者其可以介于约1nm与5nm、5nm与10nm、10nm与20nm、5nm与15nm、1nm与15nm或5nm与20nm之间，例如，其直径可以为约1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm或20nm。正如下文将更详细讨论的那样，此大小上限是由于穿过肠壁吸收和肝的肝细胞内吞作用的过程中固有的限制，这被认为是参与本发明提供的治疗效果的步骤，而不是对材料本身的任何固有限制。因此，大于20nm、至多50nm或至多100nm的量子点，例如，平均直径至多20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、50nm或100nm的量子点可以适用于本发明。78.量子点可以是任何合适的形状。其可以是球形的或大部分是球形的。其可以是不规则的形状。量子点群体可以均具有统一的形状，或者任何群体中可能存在多于一种形状。79.硫化银量子点80.在一个实施例中，本发明的量子点可以由ag2s组成或包括其。在纳米颗粒领域，由ag2s组成的量子点是众所周知的。其对哺乳动物的毒性很低或无毒性，并且还可能具有近红外荧光。通常，其通过使用产生具有疏水性涂层的ag2s量子点的自组装方法制备，然而本发明的ag2s量子点可以通过任何合适的方法制备。此类疏水性ag2s量子点通常被官能化以具有亲水性涂层。此官能化可以通过使用任何适当的方法来执行，以获得亲水性涂层。在一个实例中，所使用的亲水性试剂可以是含巯基或硫醇的试剂，当其在合适的条件下与疏水性量子点一起温育时，所述试剂会在ag2s量子点上产生亲水性表面化学。ag2s量子点的表面可以完全或基本上被极性官能团覆盖，例如羧基、羟基、硫醇或氨基官能团。在ag2s量子点上形成亲水性表面的官能化通常发生在极性溶剂中。然后，所得亲水性ag2s量子点通常是稳定的，不会聚集在一起，并且可以与胰岛素缔合以形成适于疗法的缀合物。81.量子点—胰岛素缀合物82.本发明包含治疗性缀合物的用途。本文所提及的所有缀合物都是在量子点与至少一种胰岛素分子之间形成的稳定缔合物。标准缀合化学可以用于将胰岛素分子与量子点的表面缀合。在一个此类实例中，可以通过以下步骤形成治疗性缀合物：使合适的量子点(其可以是亲水的或疏水的)与偶联剂和胰岛素在溶剂中接触；以及然后温育混合物以形成粗治疗性量子点缀合物。这三种试剂的接触可以同时发生，由此将所有试剂一起添加并温育，或者其可以顺序地发生，由此将三种试剂中的两种一起添加，例如量子点和偶联剂，并且然后在添加第三种试剂之前完成反应。然后可以通过任何合适的方法任选地纯化粗治疗性量子点缀合物以去除未经反应的试剂。一种此类方法可以是固态纯化方法，由此进行用合适的溶剂洗涤并且然后过滤的若干个循环。另一种方法可以是通过离心将缀合物与溶剂分离，并且然后将一部分用于组合物中。83.偶联剂可以用于在与量子点表面结合的极性官能团和缀合的胰岛素分子之间形成酰胺接头基团或酯接头基团，尽管本领域技术人员将理解在量子点表面与胰岛素之间可以形成多于一个键。在一个实例中，量子点可以被官能化，使得在其表面上呈现羧基，其可以通过酰胺或酯接头基团与胰岛素的羧基或氨基连接。已知且可以使用的偶联剂包含苯并三唑基氧基三(二甲氨基)六氟磷酸鏻(bop)、碳二亚胺，如二环己基碳二亚胺(dcc)、二异丙基碳二亚胺(dic)和1-(3-二甲基-氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-氢琥珀酰胺和磺基-n-羟基琥珀酰胺(nhs)，尽管可以使用任何合适的偶联剂。84.如胰岛素等蛋白质可能对环境条件敏感，如温度、剪切力、ph、盐浓度和溶剂。根据蛋白质的不同，一些条件可能会对蛋白质的结构造成无法弥补的损害，在某些情况下会导致变性，使其失效。因此，在形成量子点缀合物时，应仔细考虑处理条件，以确保胰岛素在与量子点缀合后仍然有效。85.发生偶联反应的溶剂可以是极性的，或者可以是非极性的，这取决于量子点表面的化学和所涉及的试剂。溶剂可以是水。溶剂可以是质子极性有机溶剂，如甲醇、乙醇、丁醇或丙醇。溶剂可以是非质子极性有机溶剂，如丙酮、乙腈或n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。86.当溶剂是水时，可以添加或存在盐以接近生物渗透压并维持胰岛素分子的完整性。缀合反应可以在盐水环境中进行，由此盐水是存在如nacl和kcl等溶解盐的水。盐水环境可以估计血浆渗透压介于约300与312mosm/l之间。还可以将缓冲液添加到水或盐水中，以确保反应混合物的ph值不会在缀合反应期间导致胰岛素变性。缓冲液可以将生物ph维持介于约ph 6与约ph 8之间。缓冲液可以是例如磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液或任何其它合适的缓冲液。在有机溶剂相中通常不需要缓冲液，因为通常不存在水合氢离子，因此ph不是一个因素。87.在包含胰岛素作为试剂的任何步骤中，反应发生的温度可能是温和的。所述温度可以介于约1℃或约40℃之间，或者所述温度可以介于1℃与20℃、10℃与30℃、5℃与35℃、20℃与40℃、15℃与25℃或25℃与35℃之间，例如，所述温度可以为1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。所述温度可以是室温。温度可以在整个反应过程中一致，其中最高温度与最低温度之间的变化介于1到5℃之间，或者其可能在整个反应过程中变化，如在冷却梯度的加热梯度上。预期最低温度高于约1℃，并且最高温度低于约40℃，以避免可能因冷冻(在低渗透水溶剂中)或热诱导的变性分别对胰岛素造成的损害。如果反应按顺序进行，仅包含量子点和偶联剂的反应步骤可以在更高的温度下发生，如介于1℃与100℃之间、或介于10℃与50℃、25℃与75℃、15℃与85℃、35℃与65℃、70℃与90℃或50℃与100℃之间，例如，所述反应步骤可以在1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃下发生。88.反应中的每个反应步骤可以在介于约5分钟与约10小时之间、或介于约5分钟与5小时、1小时与6小时、2小时与8小时、5小时与10小时或30分钟与3小时之间，例如，5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时的时间内发生。可以放置足够长的时间以确保试剂完全或基本上完全反应。89.生物聚合物90.如下文更详细描述的，量子点-胰岛素缀合物还可以包括聚合物。聚合物可以是合成聚合物或者其可以是生物聚合物。此生物聚合物可以应用于量子点-胰岛素缀合物，使得缀合物至少部分地涂覆在生物聚合物中，或者生物聚合物可以与胰岛素一起分散在融合物(amalgam)层中。缀合物可以完全被生物聚合物涂覆，或者其可以基本上被生物聚合物涂覆。这种包括生物聚合物的外层可以起到保护胰岛素的作用，无论是通过延长保质期或者通过形成物理屏障和减少施用后的降解。如果通过吞咽口服施用，其可以允许或促进跨膜，如跨肠膜吸收，或者如果作为喷雾剂施用，则其可以跨鼻膜吸收。其可以允许在施用后被受试者吸收后被期望的细胞类型靶向吸收。生物聚合物的作用可以适于上述作用中的任何一种或多种。91.取决于期望的效果，生物聚合物层可以包括任何合适的生物聚合物。例如，如果期望的效果是作为物理屏障，则生物聚合物必须能够在缀合物周围形成不透水，并且可能不透气的层。92.例如，如明胶、肝素等生物聚合物，或者甚至不存在生物聚合物涂层，可能导致缀合物的流体动力学直径相对较小，并且因此显示出通过网格蛋白介导的内吞作用将缀合物内吞到肝细胞中的偏好。进一步地，某些生物聚合物可以保护胰岛素-qd缀合物免受酸性环境和胃肠道消化酶的影响。例如，生物聚合物，如壳聚糖或半乳糖或葡萄糖、或这些的组合可以保护缀合物免受胃肠道ph和消化酶的影响。这些生物聚合物虽然因其阻隔特性而被选择，但也可能影响缀合物的流体动力学半径，并且因此潜在地影响肝细胞对这些经涂覆的缀合物的吸收。可以通过ftir分析具有或不具有生物聚合物涂层的qd的表面化学，以确定存在哪些基团(参见图2)。93.可以通过任何合适的工艺将生物聚合物层施涂到缀合物上。举例来说，在一种此类方法中，生物聚合物连接可以通过在qd上的羧酸基与生物聚合物上的伯胺基之间形成酰胺桥来进行。例如，此反应可以在存在n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或其水溶性类似物(硫代-nhs)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)的情况下进行。此反应需要改变ph值，其可以通过添加hcl和naoh溶液来促进。任选地，此方法还可以使用另外的接头，如己二酸二酰肼。94.在不包含在其表面处与水分子进行相互作用的情况下，生物聚合物层的厚度可以介于约5nm与约25nm之间，如介于约5nm与10nm、10nm与20nm、15nm与约25nm或12nm与17nm之间，例如，约5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm或25nm。在具有或没有生物聚合物涂层的情况下，所得缀合物的流体动力学直径可以介于约10nm与约100nm之间，如介于约10nm与50nm之间，或介于20nm与40nm、25nm与75nm、50nm与100nm、30nm与80nm、40nm与60nm或60nm与100nm之间，例如约10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm或100nm。95.疗法96.本文所描述的缀合物，包括量子点和胰岛素，任选地进一步包括生物聚合物，可以用于治疗有需要的受试者的i型糖尿病或ii型糖尿病。如上文所描述的，胰岛素是胰岛素依赖型糖尿病最有效的疗法。这些缀合物已由发明人专门开发作为用于在需要时，如在高血糖事件期间以治疗方式，或在用餐前或用餐期间或醒来时防治性地为糖尿病受试者提供胰岛素的疗法。97.不受理论束缚，据信这些量子点-胰岛素缀合物与细胞表面结合并被受试者身体的细胞，优选地肝并且更优选地肝细胞吞噬，其中胰岛素可以用于降低受试者的血糖。虽然量子点-胰岛素缀合物偏向靶向肝，但其也可能存在于其它器官中，如口服施用后不久的小肠或肾、脾和胰腺。量子点-胰岛素缀合物特异性靶向肝细胞，由此减少全身性高胰岛素血症和相关副作用。可以设想，这些缀合物可以通过使得缀合物进入受试者的血流并与代谢缀合物并释放胰岛素的细胞接触的任何合适的方式施用于受试者。例如，缀合物可以通过皮下注射施用，类似于本领域已知的普通胰岛素施用途径，但口服施用是优选地。98.口服施用99.用于递送这些缀合物的一种特别有利和令人惊讶的施用途径是通过口服施用。胰岛素的口服剂型将避免已知的皮下注射胰岛素(和其它蛋白质和肽)的问题，如受试者依从性差以及在常见注射部位处形成瘢痕组织使得另外的注射变得困难。预期口服剂型的组合物将增加依从性并减少与皮下施用有关的不想要的副作用。“口服施用”意指受试者通过吞咽包括缀合物的组合物以在胃肠道中吸收而不是通过如舌下粘膜等口腔膜吸收来口服组合物。100.用于口服给药胰岛素的组合物包括量子点-胰岛素缀合物，任选地具有生物聚合物涂层。组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂，如稀释剂(例如，乳糖、糊精、硅酸盐、镁盐或钙盐)、粘合剂(例如，淀粉、纤维素、纤维素衍生物或糖醇)、崩解剂(例如，淀粉、纤维素衍生物或藻酸盐)、助流剂(例如，胶态无水二氧化硅和其它二氧化硅化合物)、防腐剂(例如，苯甲酸钠、edta、山梨酸或对羟基苯甲酸酯)、抗氧化剂(例如，bha、bht、生育酚乙酸酯)和润滑剂(例如，硬脂酸和其盐)。口服剂型可以是任何合适的物理形式，例如片剂、胶囊、粉末、悬浮液或溶液。如下文在实例3中所示，量子点和胰岛素的缀合物能够向受试者的血流提供活性胰岛素，如口服施用后对测得的血糖的影响所证明的那样，无需添加另外的保护性赋形剂。因此，不受理论束缚，据信胰岛素与量子点的缀合破坏了消化道中蛋白酶和酸的作用，从而减少了胰岛素在吸收前的降解，导致向受试者的肝递送活性胰岛素。可以设想，相同的保护作用将应用于与量子点缀合的其它蛋白质和肽。101.可以设想，合适的药物组合物将缀合物递送到受试者的肠道，所述缀合物从所述肠道穿过小肠的内腔被吸收并进入到小肠的毛细血管中。因此，包括量子点、胰岛素和任选地生物聚合物的缀合物的流体动力学大小应足够小以允许从肠快速吸收缀合物并且使所述缀合物进入到肠毛细血管中。102.由于小肠毛细血管的血液直接进入肝以进行首过代谢，因此口服施用以及因此肠吸收途径比其它吸收或施用方法，如注射或透皮施用更有利和优越。有利地，缀合物优选地在肝中代谢，而不是在受试者的任何其它细胞或器官中代谢。这是因为肝在维持葡萄糖水平方面发挥着若干重要作用，包含作为胰高血糖素的储存器和脂肪生成的部位(即从过量葡萄糖中制造脂肪酸)。进一步地，与目前优选的疗法的活性形式胰岛素的肠胃外施用相比，从肝释放的胰岛素更接近地表示健康受试者中胰岛素的自然释放。103.口服施用胰岛素的另一个优点是当与量子点缀合并任选地涂覆在生物聚合物中时，可以通过生物聚合物进一步保护胰岛素免受消化道的苛刻条件的影响，和/或通过肠壁的吸收可能会得到改善，这取决于生物聚合物的特性。104.口服施用的另一个优点是可以抑制或限制缀合物进入受试者的全身系统。如实例1所示，本文所描述的大多数未经涂覆的量子点在施用后迅速吸收并在肝中积聚，然后通过胆汁排泄消除，由此避免进入受试者的全身循环系统。本文还示出，生物聚合物涂层在应用时可能影响缀合物在受试者中的分布，从而进一步增加肝的吸收和积聚。105.糖尿病的治疗106.本发明的缀合物可以用于治疗受试者的糖尿病的方法，特别是参考实例4(胰岛素)或实例6(利拉鲁肽)的方法。治疗可以是治愈性的并且可以包含施用胰岛素以降低可能是高血糖症的受试者的血糖。治疗可以是预防性的或防治性的，因为糖尿病受试者在施用时可能具有正常的血糖水平，但可以预期受试者在施用缀合物之后不久就会出现高血糖症。例如，缀合物可以在预期会增加受试者的血糖水平的食物之前或与所述食物一起口服，特别是在食物富含碳水化合物的情况下。要治疗的糖尿病可以是i型糖尿病，或者可以是ii型糖尿病。107.治疗可以包含施用包括本发明的缀合物的组合物，由此在通过肝代谢缀合物之后将胰岛素释放到受试者的血流中。“代谢”意指在细胞中发生缀合物的裂解以形成至少一个胰岛素分子和量子点，其中胰岛素被释放到血流中并且量子点通过胆管系统排泄。施用可以通过任何合适的途径，如肠胃外施用，例如皮下注射，或者可以通过口服施用，或者可以通过透皮施用。优选地，施用途径是通过口服施用。组合物可以包含药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂适用于并因此取决于施用途径。例如，用于口服施用的合适的赋形剂可能不适合肠胃外施用。108.由缀合物提供的胰岛素或利拉鲁肽的剂量可以与常规肠胃外疗法提供的胰岛素或利拉鲁肽的剂量相同或更高。对于人类来说，胰岛素的标准剂量是1个国际单位(iu)，其被定义为0.0347mg。施用于受试者的胰岛素剂量可以介于约0.1iu/kg与约100iu/kg之间，或者其可以介于0.1iu/kg与15iu/kg、0.5iu/kg与20iu/kg、1iu/kg与10iu/kg、5iu/kg与25iu/kg、15iu/kg与30iu/kg、20iu/kg与50iu/kg、25iu/kg与75iu/kg、40iu/kg与80iu/kg、30iu/kg与70iu/kg、10iu/kg与90iu/kg、1iu/kg与99iu/kg或2.5iu/kg与12iu/kg之间，例如，约0.1iu/kg、0.2iu/kg、0.3iu/kg、0.4iu/kg、0.5iu/kg、0.6iu/kg、0.7iu/kg、0.8iu/kg、0.9iu/kg、1iu/kg、1.5iu/kg、2iu/kg、2.5iu/kg、3iu/kg、4iu/kg、5iu/kg、6iu/kg、7iu/kg、8iu/kg、9iu/kg、10iu/kg、11iu/kg、12iu/kg、13iu/kg、14iu/kg、15iu/kg、16iu/kg、17iu/kg、18iu/kg、19iu/kg、20iu/kg、21iu/kg、22iu/kg、23iu/kg、24iu/kg、25iu/kg、26iu/kg、27iu/kg、28iu/kg、29iu/kg、30iu/kg、35iu/kg、40iu/kg、45iu/kg、50iu/kg、55iu/kg、60iu/kg、65iu/kg、70iu/kg、75iu/kg、80iu/kg、85iu/kg、90iu/kg、95iu/kg或100iu/kg。施用于受试者的利拉鲁肽剂量可以介于100μg/kg与约3000μg/kg之间，或者其可以介于约200μg/kg与约2500μg/kg之间，或者其可以介于约1250μg/kg与2500μg/kg之间，例如约100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1000μg/kg、1050μg/kg、1100μg/kg、1150μg/kg、1200μg/kg、1250μg/kg、1300μg/kg、1350μg/kg、1400μg/kg、1450μg/kg、1500μg/kg、1550μg/kg、1600μg/kg、1650μg/kg、1700μg/kg、1750μg/kg、1800μg/kg、1850μg/kg、1900μg/kg、1950μg/kg、2000μg/kg、2050μg/kg、2100μg/kg、2150μg/kg、2200μg/kg、2250μg/kg、2300μg/kg、2350μg/kg、2400μg/kg、2450μg/kg、2500μg/kg、2550μg/kg、2600μg/kg、2650μg/kg、2700μg/kg、2750μg/kg、2800μg/kg、2850μg/kg、2900μg/kg、2950μg/kg或3000μg/kg。达到治疗效果所需的口服qd-胰岛素缀合物的剂量可以与达到皮下胰岛素(sc-胰岛素)治疗效果所需的剂量相同或更高。sc-胰岛素与口服qd-胰岛素的处理剂量的比率可以介于约1:1与约1:50之间，或者其可以介于约1:5与约1:40之间，或介于约1:10与1:25之间，或者其可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49或者1:50。109.施用本文所描述的缀合物的期望的治疗效果是降低受试者的血糖。这种治疗效果可以在施用后不久明显，如施用后约5分钟到约90分钟，或施用后约5到30分钟、10到25分钟、10到15分钟、15到45分钟、20到50分钟、30到90分钟、40到80分钟、10到75分钟、60到90分钟、50到85分钟或30到60分钟，例如，施用后5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟或90分钟。这种治疗效果可以是长效的或短效的。“短效”意指在受试者中观察到治疗性降血糖效果在施用后持续至多约2小时，或施用后持续至多约1.5小时，或施用后持续至多约1小时。“长效”意指在受试者中观察到治疗性降血糖效果在施用后持续约2小时到约8小时、如施用后持续2小时到4小时、4小时到8小时或3小时到6小时，例如，约2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、6小时、7小时或8小时。可观察活性的长度可能受若干因素的影响，例如组合物和/或厚度或生物聚合物涂层、缀合物的流体动力学直径、一天中的施用时间、所施用的组合物的赋形剂或这些因素的组合。110.其它治疗性蛋白质和肽111.在上述描述和下文提供的实例中，胰岛素已被用于证明基于蛋白质或基于肽的治疗剂与本发明的量子点连接的有效性，以提供在口服施用于受试者时维持有效性的基于蛋白质或肽的治疗剂的剂型。然而，技术人员将容易地预期，通过使用本文所描述的相同技术，其它在治疗上有效但不能口服生物利用的蛋白质或肽也可能适合与量子点缀合以用于口服施用。具体地，蛋白质和肽当直接递送到受试者的肝、小肠、胰腺、肾或其它胃肠道器官时有效但目前不能口服生物利用，所述蛋白质和肽也可以使用本发明以口服剂型递送到受试者。112.适于与本文所描述的量子点缀合的蛋白质和肽可以是任何治疗活性的蛋白质或肽，大小至多约30千道尔顿(kda)，例如，所述蛋白质或肽的大小可以为约或至多1kda、2kda、3kda、4kda、5kda、6kda、7kda、8kda、9kda、10kda、11kda、12kda、13kda、14kda、15kda、16kda、17kda、18kda、19kda、20kda、21kda、22kda、23kda、24kda、25kda、26kda、27kda、28kda、29kda或30kda。为了通过edc/nhs将蛋白质或肽附着到qd表面，其还需要可用的伯胺基。如本文所描述的，供口服施用的这种大小的且包括适于与量子点缀合的伯胺的蛋白质和肽的非限制性实例可以是例如：胰岛素(例如，51个氨基酸；约6kda)和其类似物或衍生物；生长激素(例如，191个氨基酸；约22kda)；胰高血糖素样肽-1(glp-1)激动剂，如利拉鲁肽(30个氨基酸；约4kda)和艾塞那肽(39个氨基酸；约4kda)；胰高血糖素样肽-2(glp-2)激动剂，如阿普拉鲁肽(33个氨基酸；约4kda)；血小板源性生长因子(pdgf)β受体调节剂，如bot191(fibroferon)(约9kda)；或整合素α-4/β-7拮抗剂，如pn-10943；加压素；白介素(大小小于30kda)；脑啡肽；内啡肽；等。上述这些治疗有效的蛋白质和肽可以用于治疗i型糖尿病或ii型糖尿病(胰岛素和glp-1激动剂)；肥胖症(利拉鲁肽)；生长激素缺乏症，特别是在老年受试者中(生长激素)；糖尿病性肾病、肝纤维化、nash或肾纤维化(bot 191)；乳糜泻和其它胃肠疾病(阿普拉鲁肽)；或炎性肠病或溃疡性结肠炎(pn-10943)。上述肽和蛋白质只是目前不能口服生物利用但对能够自我口服施用的受试者将是有利的治疗剂的实例。113.实例114.参考以下实例可以更好地理解本文所公开的本发明，所述实例并非旨在构成限制。115.实例1-形成量子点-胰岛素缀合物的方法116.ag2s量子点的制备过程如图1所示。基本上，二乙基二硫代氨基甲酸银与1-十二烷硫醇混合并在200℃下温育1小时以产生可溶于环己烷的qd。所产生的qd的表征示出由658nm激发产生的1175nm近红外发射(图1b)和指示表面上的c-h键的ftir光谱表明(图1c)。为了产生水溶性qd，然后进行相转移反应，其中qd与3-巯基丙酸在丙酮/环己烷中在室温下温育1小时(图1e)。对这些水溶性qd的另外的ftir分析示出指示表面上的羧酸基的键，蛋白质或肽可以与所述键缀合(图1f)。117.使用edc/nhs进行qd和胰岛素的缀合，然后将壳聚糖与半乳糖或葡萄糖生物聚合物组装。qd在室温下与edc和nhs在混合条件下在ph 5-6下温育1小时。然后使用naco3缓冲液或naoh将ph值改变为ph 9-10。然后在混合条件下将胰岛素添加到溶液中并温育4-6小时。然后将溶液在水中透析(3500或10000kda截留管)2小时、4小时和过夜(16小时)。将溶液和壳聚糖与半乳糖或葡萄糖生物聚合物在室温下混合0.5-4小时。然后将溶液在水中透析(3500或10000kda截留管)2小时、4小时和过夜(16小时)。118.壳聚糖与半乳糖或葡萄糖生物聚合物由壳聚糖与半乳糖或葡萄糖的混合物产生(比率可以为1:1000到1000:1[比率为1:2])。使用1％乙酸在70℃下制备壳聚糖持续1-4小时并过滤(1um过滤器)。壳聚糖与半乳糖或葡萄糖之间的连接通过经1-2小时从70℃逐渐控制冷却到20℃而发生。使用乙醇溶液(50-100％)和离心(壳聚糖与半乳糖或葡萄糖生物聚合物形成凝胶，而未经缀合的材料溶解于乙醇中)对材料进行纯化。[0119]上述方法描述了qd和胰岛素的缀合，然而可以设想，在此实例中可以使用任何治疗性蛋白质或肽来替代胰岛素，以产生用于治疗一系列疾病的治疗性qd缀合物。[0120]实例2-胰岛素-量子点缀合物的摄取[0121]放射性标记的胰岛素和量子点的缀合物以如上文所描述的方法产生，尽管使用放射性标记的胰岛素替代天然胰岛素。然后向两组健康啮齿动物口服施用一剂缀合物或等效的放射性标记的未结合的胰岛素。然后在施用后30分钟监测放射性分布。[0122]与30分钟后发现约1％的未结合放射性标记的胰岛素相比，在口服施用后30分钟，在啮齿动物的肝中发现大约50％的放射性标记。这表明本发明的缀合物能够比在没有缀合的情况下更有效地通过口服途径向肝提供胰岛素，并且缀合在维持消化道中的胰岛素有效性方面具有保护作用。[0123]然而，qd-胰岛素缀合物在肝中积聚的偏好不是胰岛素的功能，而是涂覆有生物聚合物的qd的特征。这在图3中得到了证明，由此将没有与蛋白质缀合的3h标记的qd口服施用于小鼠模型中，导致施用后30分钟积聚在肝中约60％。换句话说，任何可以与ag2s qd缀合的蛋白质或肽都可以在口服施用后递送到肝。[0124]实例3-用口服剂量的缀合物进行的葡萄糖耐量测试[0125]获得了30只没有糖尿病症状的健康啮齿动物群体，并将划分为六个治疗组：一组5只啮齿动物在葡萄糖强饲之前30分钟通过腹膜内注射接受2iu/kg胰岛素；一组在葡萄糖强饲之前30分钟通过口服强饲接受100iu/kg胰岛素；一组5只啮齿动物在葡萄糖强饲之前30分钟被给予相当于100iu/kg胰岛素的量子点-胰岛素结合物的剂量；一组5只啮齿动物在葡萄糖强饲之前30分钟被给予相当于10iu/kg胰岛素的量子点-胰岛素缀合物的剂量，并且一组五只啮齿动物被仅给予葡萄糖强饲。然后在葡萄糖强饲后90分钟内监测所有啮齿动物的血糖。[0126]如图4所示，对照组中未接受疗法的啮齿动物在接受葡萄糖15分钟后血糖水平迅速升高，其中在研究过程中逐渐降低。相比之下，腹膜内注射组或量子点胰岛素组给予的2iu/kg胰岛素均未记录到血糖水平的峰值，表明腹膜内注射胰岛素(当前的优选的疗法)和本发明的量子点-胰岛素缀合物两者均对降低血糖有效。[0127]最令人惊讶的是，口服施用的缀合物显示出与注射的胰岛素相同(如果不是更好的话)的降血糖效果。这表明本发明的量子点缀合物能够通过口服施用将胰岛素递送到受试者的血流，并且胰岛素以能够影响接受口服剂型的胰岛素的受试者的血糖水平的有效状态被吸收。[0128]对没有糖尿病症状的健康啮齿动物进行了另外的研究，比较了在葡萄糖耐量测试(ogtt)之前30分钟的盐水皮下注射(对照)、皮下注射胰岛素(sc-ins，2iu/kg)或口服强饲口服胰岛素(qd-ins，20iu/kg)。如图5所示，口服qd胰岛素疗法在降低小鼠血糖水平方面与注射胰岛素一样有效。[0129]还使用放射性标记的胰岛素研究了qd-胰岛素缀合物的药效动力学。三只小鼠治疗组禁食4小时，然后以2iu/kg剂量给予口服强饲胰岛素(口服ins)、皮下注射胰岛素(sc-ins)或口服强饲qd-胰岛素缀合物(qd-ins)。如图6所示，在30分钟之后，口服施用的疗法主要定位于小肠，而皮下注射的胰岛素则存在于肝和血液中。然而，在2小时之后，虽然口服胰岛素仍定位于肠中，但sc-ins和qd-ins两者的约50％的放射性标记胰岛素定位于肝中。事实上，sc-ins与qd-ins之间的胰岛素分布几乎相同。这表明口服qd-肽缀合物施用在施用之后产生模拟侵入性皮下施用的生物分布。[0130]实例4-糖尿病小鼠模型中的胰岛素耐量测试[0131]上述实例证明了口服qd-胰岛素缀合物对健康小鼠模型的降葡萄糖效果。在nod/scid小鼠模型上也进行了类似的实验，这证明i型糖尿病会随着血糖浓度的增加而发展。使用用accu-chek performa试纸的手持式血糖仪测量血糖。在尾部剪断后通过尾静脉采样收集血液。在皮下(sc)胰岛素注射(0.1、1或2iu/kg)或强饲qd-胰岛素缀合物(10iu/kg、20iu/kg、30iu/kg、40iu/kg、50iu/kg、75iu/kg或100iu/kg)后-15分钟、0分钟、15分钟、30分钟、45分钟和60分钟时收集血糖。如图8所示，在糖尿病模型中，qd-胰岛素剂量比sc-胰岛素剂量高约25倍导致类似的葡萄糖降低。[0132]实例5-形成量子点-利拉鲁肽缀合物的方法[0133]与上述胰岛素类似，利拉鲁肽通过edc/nhs偶联与qd缀合(参见实例1)。在重度搅拌的情况下，将1mm ag2s qd与1mm edc和1mm nhs在反应小瓶中混合1小时。随后，使用0.5m naco3将ph值更改至9.0，并向溶液中添加1-10mm的利拉鲁肽。将溶液混合过夜并转移到10,000mwco的透析管中，并用1ml溶液/1l mq在黑暗中在4℃下透析2小时、4小时、16小时。聚合物与qd-利拉鲁肽的连接也使用与上文实例1的方法相同的方法进行。[0134]实例6-利拉鲁肽的口服葡萄糖耐量测试[0135]在c57/bl6小鼠中禁食4小时后进行ogtt(参见图10)。使用用accu-chek performa试纸的手持式血糖仪测量血糖。在尾部剪断后通过尾静脉采样收集血液。在口服团注2g/kg葡萄糖溶液前30分钟、前15分钟、口服团注2g/kg葡萄糖溶液后0分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟和90分钟收集血糖。在时间为-120分钟时，向小鼠给予皮下(sc)利拉鲁肽注射液(250ug/kg于盐水中)、强饲qd-利拉鲁肽-cs/gs(2500ug/kg于水中)或不对小鼠进行处理。基于利拉鲁肽治疗对个体ogtt实验的曲线下面积(auc)的影响确定药效动力学。对于药效动力学测量结果，sc-利拉鲁肽和qd-利拉鲁肽的影响是相对于auc的减少而确定的。[0136]实例7-其它疗法[0137]上文提供的实例涉及胰岛素和利拉鲁肽的缀合物，部分原因是易于测量这些治疗剂对血糖浓度的治疗活性。换句话说，胰岛素提供了很好的“概念证明”模型，以确定在此类缀合物中口服施用的蛋白质和肽受到保护，并且在吸收和肝转运后仍然可行或能够赋予治疗效果。然而，如果与ag2s qd缀合并涂覆在生物聚合物中，预期其它蛋白质或肽也将是可行的。[0138]为了确定其它蛋白质或肽在缀合和口服递送到肝之后是否治疗有效，本领域技术人员将能够(1)设计测定，(2)用质谱法测量靶标治疗性肽或蛋白质或血液组分的生理作用，或(3)对肽或蛋白质进行放射性标记，以确定肽或蛋白质是否被递送到最具治疗意义的器官(如肝、胰腺或小肠)，以及施用之后多长时间发生这种情况。例如，如果肽或蛋白质旨在治疗与炎症相关的病状(例如，乳糜泻或炎性肠病)，则可以测量与炎症相关的血液标志物(例如，il-1β、il-6、il-8(mip-2)、ifnγ、tfnα等)。[0139]一个实例包含在乳糜泻小鼠模型中比较口服施用包括ag2s qd和阿普拉鲁肽(或其它glp-2激动剂)的缀合物与皮下注射相同治疗性肽，这类似于上述比较研究。在施用glp-2激动剂之后，经处理的小鼠可以口服强饲谷蛋白并比较各种血液标志物，如ttg-iga。[0140]另一个实例包含将人生长激素的皮下注射与所施用的处理剂量的作为qd和人生长激素的缀合物进行比较，这类似于上述比较研究。人生长激素可以通过用于测定激素的血液水平的众所周知的测定来直接测量。还可以通过测量血液中的igf-1(胰岛素生长因子-1)和/或通过观察和比较经处理的受试者与未处理受试者(如小鼠)的生长情况来确定所施用的激素的有效性。[0141]基于对特定疾病过程和蛋白质或肽的预期治疗效果的了解，技术人员将能够开发用于测量其它治疗性肽和蛋白质的效果的测定。









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