一种检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的引物组、试剂盒及方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及检测技术领域，具体而言涉及一种双重rpa技术检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的引物组、试剂盒及方法。背景技术：2.人们对水产品消费需求的增加带动了水产养殖业的迅速发展，在集约化高密度养殖过程中，由致病菌感染造成的水产养殖动物死亡给水产养殖业造成了严重的经济损失。同时，水产品中的一些致病菌也是重要的人类食源性致病菌，对人类的健康造成严重的威胁。这其中，副溶血弧菌、霍乱弧菌就是两种最常报道的水产类人畜共患致病菌，建立这两种病原体的快速检测技术对于控制疾病的爆发和传播以及保障水产品质量安全具有重要应用价值。3.目前，关于这两种致病性海洋弧菌的分子诊断方法有很多，以单重检测方法居多，如pcr、qpcr、lamp、rpa等，pcr、qpcr需要昂贵的热循环反应仪器，对于很多基层或偏远地区难以满足检测的条件。lamp法作为恒温检测方法可以摆脱变温仪器的依赖，但是lamp法的反应温度较高，约65℃，仍然需要一个精确控温的仪器，此外，lamp法需要设计4-6条引物，引物数量多且设计复杂，多重体系中庞杂的反应体系会大大增加假阳性的发生率。在众多的恒温核酸扩增方法中，重组酶聚合酶等温扩增(rpa)是最具有现场应用潜力的一种，该方法具备反应速度快、操作简单、设备依赖低，对粗样本耐受程度高等众多优势，已经广泛运用到多种病原体的现场快速检测中。4.实时荧光重组酶聚合酶等温扩增技术(real-time rpa)可以通过实时荧光信号读取的方式监测反应进程，缩短了检测时间，扩增产物无需开盖后处理，避免了开盖污染和假阳性的发生。因此，开发一种双重real-time rpa同时检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的试剂盒具有实际应用价值。技术实现要素：5.本发明的目的在于克服现有技术检测方法的不足，建立一种基于双重real-time rpa技术、能够同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法。6.为实现上述目的，本发明提供一种双重rpa技术检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的引物组和探针，它们分别是：7.副溶血性弧菌的gyrb基因的检测引物和探针序列：8.正向引物(vp-f)：5'-cgaagaaagcgaaaacggcaacgtcaggcga-3'9.反向引物(vp-r)：5'-cagataatttctcacccatcgccgattcaacc-3'10.探针序列(vp-p)：ggtttgacagccgttgtttcagtaaaagtgcc[hex-dt][thf][bhq1-dt]tccaaaattctcgagcc-spc3[0011]霍乱弧菌的lolb基因的检测引物和探针序列：[0012]正向引物(vc-f)：5'-atcttcaagctgttcaacgggaatatctaa-3'[0013]反向引物(vc-r)：5'-atcagcgacaatcgttcaactttcaatggc-3'[0014]探针序列(vc-p)：atcaggctttgtgcatcttggtcgcggtaga[fam-dt][thf][bhq1-dt]gatcatcataagtttcg-spc3[0015]本发明提供一种双重real-time rpa技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的试剂盒，含有副溶血性弧菌的gyrb基因检测引物和探针序列和霍乱弧菌的lolb基因的检测引物和探针序列。[0016]优选地，所述试剂盒还含有real-time rpa核酸扩增试剂，包括酶冻干粉、缓冲溶液、醋酸镁和ddh2o。[0017]本发明还提供了一种双重real-time rpa技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法，步骤包括：[0018](1)提取待测样品dna，得到模板dna溶液；[0019](2)配置预混体系：取出一管反应酶冻干粉，依次加入补液缓冲液、ddh2o、vp-f、vp-r、vp-p、vc-f、vc-r和vc-p，配置预混体系后混匀；[0020](3)real-time rpa反应体系：从步骤(2)配置的预混体系取出10～15μl预混和液加入八联管中，然后加入模板dna溶液和醋酸镁；[0021](4)实时荧光pcr检测：将步骤(3)的八联管放入qpcr仪涡旋混匀，继续放入qpcr仪反应，设置荧光检测通道为fam和hex，记录荧光信号。[0022]优选地，步骤(2)中的补液缓冲液、ddh2o、vp-f、vp-r、vp-p、vc-f、vc-r和vc-p的加入量为：[0023][0024][0025]优选地，步骤(3)中取出预混和液的体积为13.25μl，模板dna溶液加入量为1μl，醋酸镁的加入量为0.75μl，醋酸镁的浓度为280mm。[0026]优选地，步骤(3)中，涡旋混匀条件为39℃预热4min，qpcr仪反应条件为39℃反应26min。[0027]本发明的有益效果：该发明的检测方法一次反应中可同时检测副溶血弧菌和霍乱弧菌，减少了测试成本，缩短了检测时间；该方法无需依赖昂贵的热循环仪器，在较低的恒温条件下进行，用目前市场上的便携式荧光检测仪即可完成；本发明中的双重real-time rpa法在反应的过程中通过实时读取两种荧光信号即可判定结果，无需开盖后处理，避免了气溶胶污染和假阳性的发生；操作简单，检测时间短，特异性强、灵敏度较高。[0028]相关定义[0029]dt：为脱氧胸苷核苷酸。【-dt】表示原有的脱氧胸腺核苷酸的化学结构进行了修饰，如fam-dt，就是在脱氧胸腺核苷的化学结构上加了一个荧光素基团。[0030]spc3：一种阻断基团，这一端不能再进行链的延伸。[0031]rehydration buffer：补液缓冲液[0032]ddh2o：双蒸水附图说明[0033]图1双重real-time rpa灵敏度测试(cfu)，a.副溶血弧菌灵敏度测试；b.8次独立副溶血弧菌灵敏度测试灵敏度统计学分析；c.霍乱弧菌灵敏度测试；d.8次独立霍乱弧菌灵敏度测试灵敏度统计学分析；[0034]图2双重real-time rpa特异性验证；a.副溶血弧菌及其它菌株；b.霍乱弧菌及其它菌株。具体实施方案[0035]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。[0036]实验材料：[0037]实验中所涉及到的菌株信息如表1所示。共有40份临床样本供双重real-time rpa的应用研究，包含20份虾样本；15份鱼肉样本；5份贝类样本，所有临床样本由江苏省南通水产研究所收集和惠赠。exo kit购自英国twistdx公司，lightcycler 480ii荧光定量pcr仪购自瑞士罗氏集团。centrifuge 5424r高速冷冻离心机购自德国eppendorf股份公司；手持式高速匀浆机购自上海测博生物科技发展中心；组织、细胞或血液基因组dna提取试剂盒购自天根生物技术有限公司；引物和探针由安徽通用生物系统有限公司合成。[0038]实施例1 dna样本的准备[0039]采用煮沸法提取细菌基因组dna，即取1ml表1中的菌种的菌液以10000rpm离心5min后收集菌体沉淀，用1×pbs洗涤两次后加入200μl ddh2o涡旋重悬，放入100℃沸水浴中煮沸10min后瞬时离心2-3s，所得上清液即含有细菌裂解后的dna。40份临床样本先进行组织研磨成组织匀浆，后用组织、细胞或血液基因组dna提取试剂盒提取样本dna。[0040]实施例2探针修饰[0041]副溶血弧菌和霍乱弧菌检测的靶标基因分别为gyrb基因(genbank accession numbers:am235735)和lolb基因(genbank accession numbers:ap014524)。其中，用于检测副溶血弧菌的探针(vp-p)自5'→3'段第33、34、35位的t、g、a三个碱基分别被hex荧光基团、四氢呋喃(thf)、淬灭基团(bhq-1)所取代。用于检测霍乱弧菌的探针(vc-p)自5'→3'段第32、33、34位的连续三个t碱基分别被fam荧光基团、四氢呋喃(thf)、淬灭基团(bhq-1)所取代。引物和探针由安徽通用生物系统有限公司合成，引物或探针信息见下表。[0042][0043]实施例3双重real-time rpa反应体系[0044]反应操作按照exo kit说明书中进行，取出一管反应酶干粉，依次加入下表所示的试剂，配置预混体系后混匀，预混体系可以进行四次双重反应，每次仅需从中取出13.25μl加入八联管中，然后加入1μl基因组dna模板和0.75μl醋酸镁(280mm)。双重体系中两组正反向引物的终浓度均为208nm，两条探针各自的终浓度为58nm。将八联管放入qpcr仪中39℃预热4min后轻轻涡旋混匀，继续放入qpcr仪中39℃反应26min，设置荧光检测通道为fam(465-510nm)和hex(533-580nm)，每隔1min记录依次荧光信号。[0045][0046]实施例4灵敏度检测[0047]对双重real-time rpa体系的灵敏度进行检测，在反应体系中分别加入不同浓度(104、103、102、101、100cfu/μl)的副溶血弧菌基因组dna模板，结果如图1a所示，结果如图1a和1b所示，表明该方法对副溶血弧菌的检测灵敏度为1.0×102cfu/μl，经过八次独立重复进行统计学分析，该统计学分析采用了probit回归分析，使用的是spss(statistical product service solutions)软件。该体系在95％的情况下对副溶血弧菌的检测灵敏度为99cfu/μl。同样的方法加入不同浓度(104、103、102、101、100cfu/μl)的霍乱弧菌基因组dna模板测试灵敏度并进行统计学分析，如图1c和图1d所示，对霍乱弧菌的检测灵敏度为1.0×101cfu/μl，在95％的情况下对霍乱弧菌的检测灵敏度为37cfu/μl。[0048]实施例5特异性检测[0049]以表1所示所有菌株的基因组dna为模板验证体系的特异性，包含4株副溶血弧菌、3株霍乱弧菌和其它13株常见的水产类致病菌，结果如图2所示。在hex荧光通道中只有4株副溶血弧菌均显示有阳性扩增，其余菌株为阴性。在fam荧光通道中只有3株霍乱弧菌显示有阳性扩增，其余菌株为阴性。说明该方法可以检测出副溶血弧菌和霍乱弧菌及各自的分离株，其它种间菌株的检测呈阴性，说明特异性良好。[0050]表1菌株信息[0051][0052][0053]实施例6实际样本检测[0054]将40份临床样本用试剂盒提取基因组dna，用双重real-time rpa进行检测，同时以qpcr作为对标方法，对比两种方法的检测结果，见表2。数据显示两者检测结果一致，表明本研究建立的方法准确、可靠。[0055]表2临床样本检测结果[0056][0057]









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