共同检测RA和PM的引物探针组合物、方法及试剂盒 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术共同检测ra和pm的引物探针组合物、方法及试剂盒技术领域1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种共同检测ra和pm的引物探针组合物、方法及试剂盒。背景技术：2.鸭疫里默氏杆菌(riemerella anatipestifer，ra)是危害肉鸭养殖业的主要病原之一。鸭疫里默氏杆菌病在发病场能持续存在，引起不同批次的鸭感染发病，难于根治；并且耐过鸭常生长不良，增重缓慢，失去饲养价值，给养鸭业造成了严重的经济损失。多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida，pm)是引起多种动物巴氏杆菌病(又称出血性败血症)的病原菌，主要使动物发生出血性败血症或传染性肺炎。禽类中以鸭对多杀性巴氏杆菌最易感，其次是鸡、鹅；畜类中则以猪最常见，其次是牦牛、黄牛、水牛。3.重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)，被称为是可以替代pcr的核酸检测技术，常规pcr必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而rpa反应在常温下即可进行，无需变性，检测速度更快，是一种便携式的快速核酸检测方法，且该技术对硬件设备的要求很低，适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。4.现有技术中，已有单一检测鸭疫里默氏菌或多杀性巴氏杆菌的rpa-lfd方法，以及同时检测鸭疫里默氏菌和多杀性巴氏杆菌的pcr方法，例如，公开号为cn106811541a的发明专利公开了一种基于rpa-lfd方法的现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒，该发明最低可以检测到6拷贝/反应的多杀性巴氏杆菌dna；公开号为cn105886654b的发明专利公开了一种区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法，致病菌为鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌，该发明提供了一种使用一对引物区别鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的pcr方法。5.目前，现有技术中缺乏基于rpa-lfd技术同时检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的方法。技术实现要素：6.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物探针组合物，该引物探针组合物可实现鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的共同rpa-lfd检测，具有特异性强、敏感高等特点。7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：8.用于共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括用于检测鸭疫里默氏杆菌的引物探针组合物1和/或用于检测多杀性巴氏杆菌的的引物探针组合物2；所述引物探针组合1物包括正向引物ra-f、反向引物ra-r和探针ra-p，所述正向引物ra-f的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述反向引物ra-r的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述探针ra-p的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述引物探针组合物2包括正向引物pm-f、反向引物pm-r和探针pm-p，所述正向引物pm-f的核苷酸序列如seq id no：4所示，所述反向引物pm-r的核苷酸序列如seq id no：5所示，所述探针pm-p的核苷酸序列如seq id no：6所示。9.进一步，所述探针ra-p的5′端连接fam，3′端连接c3阻断基团；所述探针pm-p的5′端连接digoxin，3′端连接c3阻断基团；所述探针ra-p的第34位a和第35位t之间插入thf；所述探针pm-p的第31位t和第32位g之间插入thf；所述反向引物ra-r和所述反向引物pm-r的5′端连接biotin。10.本发明的目的之二在于提供一种用于共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的反应体系。11.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：12.用于共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的反应体系，所述反应体系包含目的一所述的引物探针组合物。13.进一步，所述反应体系为50μl，包括29.4μl rehydration buffer、1.0μl ra-f、1.0μl ra-r、1.0μl pm-f、1.0μl pm-r、0.3μl ra-p、0.3μl pm-p、9.5μl ddh2o、2.0μl pmd19-t-ompa、2.0μl pmd19-t-kmt1、2.5μl mgoac、1管nfo kit rpa扩增试剂冷冻干粉。14.本发明的目的之三在于提供一种用于共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的试剂盒。15.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：16.用于共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含目的一所述的引物探针组合物和/或目的二述的反应体系。17.本发明的目的之四在于提供一种利用目的一所述引物探针组合物、目的二所述反应体系和/或目的三所述试剂盒共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的rpa-lfd方法，该方法特异性强，灵敏度高，快速且高效，可满足于大部分临床检测需求。18.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：19.利用所述引物探针组合物、所述反应体系和/或所述试剂盒共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的rpa-lfd方法，包括以下步骤：20.s1：提取待测样品基因组dna；21.s2：以s1所得dna为模板，利用所述引物探针组合物进行扩增，获得反应液；22.s3：采用双标核酸检测试纸条检测s2所得反应液，根据检测结果判定样本中是否含有鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌。23.进一步，s2中，反应温度为25℃-42℃，扩增时间为15 min。24.作为优选，反应温度为37℃。25.本发明所采用的双重rpa-lfd体系在5min即可出现阳性条带，且随着时间的增加检测线更加清晰，结合扩增效率及灵敏度，rpa扩增时间优选为15 min，结合试纸条显色时间，整个双重rpa-lfd体系从核酸扩增到试纸条检测只需要20min左右。26.进一步，所述rpa-lfd方法中，采用ddh2o为阴性对照。27.进一步，s2中，反应体系为50μl，包括29.4μl rehydration buffer、1.0μl ra-f、1.0μl ra-r、1.0μl pm-f、1.0μl pm-r、0.3μl ra-p、0.3μl pm-p、9.5μl ddh2o、2.0μl pmd19-t-ompa、2.0μl pmd19-t-kmt1、2.5μl mgoac、1管nfo kit rpa扩增试剂冷冻干粉。28.进一步，s3具体为：取10μl反应液和190μl ddh2o混合均匀，将双标核酸检测试纸条的样本端插入混合液中进行反应待出现结果后于5 min内读取试验结果。29.进一步，本发明的双重rpa-lfd方法最低检测下限可达102copies/μl。30.进一步，若试纸条上仅质控线显色，表明结果为阴性，样本中不含鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌；若试纸条上质控线和检测线t1同时显色，表明结果为阳性，样本中含有多杀性巴氏杆菌，不含鸭疫里默氏杆菌；若试纸条上质控线和检测线t2同时显色，表明结果为阳性，样本中含有鸭疫里默氏杆菌，不含多杀性巴氏杆菌；若试纸条上质控线、检测线t1和检测线t2同时显色，表明结果为阳性，样本中同时含有多杀性巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌。31.本发明的目的之五在于提供一种目的一所述的引物探针组合物在制备用于检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的试剂盒中的应用。32.本发明的有益效果在于：33.本发明设计了共同检测鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物和nfo探针，并结合lfd技术构建一种可以同时检测出流行于国内养殖场内鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的rpa-lfd试剂盒，该试剂盒具有特异性强、敏感高、快速及高效等特点，且可在常温条件下进行扩增，无需借助pcr及电泳仪等设备，扩增结果可视、易于推广使用。附图说明34.图1为双重rpa-lfd初步建立的结果图，其中，c：质控线；t1：pm；t2：ra；1：pm；2：ra；3：pm+ra；4：nc；35.图2为双重rpa-lfd温度优化结果图，其中，c：质控线；t1：pm；t2：ra；1：nc；2：25℃；3：30℃；4：37℃；5：39℃；6：42℃；36.图3为双重rpa-lfd时间优化的结果图，其中，c：质控线；t1：pm；t2：ra；1：nc；2：5min；3：10min；4：15min；5：20min；6：25min；37.图4为双重rpa-lfd特异性验证的结果图，其中，c：质控线；t1：pm；t2：ra；1：pm+ra；2：pm；3：ra；4：e.coli；5：se；6：staphylococcus；7：gpv；8：dpv；9：mdpv；10：nc；38.图5为双重rpa-lfd灵敏度试验结果图，其中，c：质控线；t1：pm；t2：ra；1～8：107copies/μl-100copies/μl；9：nc；39.图6为双重rpa-lfd临床应用的结果图，其中，c：质控线；t1：pm；t2：ra；1：ra+pm质粒；2-4：pm阳性；5-11：ra阳性；12：阴性对照；40.图7为普通pcr临床应用的结果图，其中，m：2 000 marker；13：pm阳性质粒；14-16：pm阳性样本；17：阴性对照；41.图8为普通pcr临床应用的结果图，其中，m：2 000 marker；18：ra阳性质粒；19-25：ra阳性样本；26：阴性对照。具体实施方式42.下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。43.本发明实施例中，鸭源大肠杆菌(escherichia coli，e.coli)、鸭源沙门菌(salmonella enteriditis，se)、鸭疫里默氏杆菌(riemerella anatipestifer，ra)、禽源巴氏杆菌(pasteurella multocida，pm)、葡萄球菌(staphylococcus)、鹅细小病毒(goose parvovirus，gpv)、鸭瘟病毒(duck plague virus，dpv)、番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus，mdpv)均由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室分离、鉴定并保存；质粒pmd19-t-ompa、pmd19-t-kmt1由课题组前期构建并保存。44.本发明实施例中，nfo购自英国twist dx公司，2×taq pcr master mix、dl plus 2000 dna marker购自vazyme公司，dna提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，dna抽提试剂购自北京索莱宝科技有限公司，质粒小量提取试剂盒购自omega公司，侧流层析试纸条购自北京宝盈同汇公司。45.本发明实施例中，使用质粒提取试剂盒提取质粒pmd19-t-ompa、pmd19-t-kmt1；各菌株及病毒按照细菌及病毒提取试剂盒分别提取基因组dna并保存于-20℃备用。46.本发明实施例1中，所有引物和探针均由上海基因生物技术有限公司(上海)合成。47.实施例1.引物和探针设计48.选择genbank中登录的ra ompa基因序列(登录号：fj 765044)、pm kmt1基因序列(登录号：af016259)保守区域序列作为靶序列。rpa引物和探针由primer 5.0软件设计。用于检测ra的探针5′端用荧光素(fam)标记，用于检测pm的探针5′用地高辛(digoxin)标记，c3阻断基团连接在探针的3′端，可以防止核酸在扩增过程中聚合。此外，在探针序列中引入碱性呋喃(dspacer)以作为nfo的识别位点。鉴定两种细菌的反向引物5′端均用生物素(biotin)标记。双重rpa-lfd引物及探针序列信息如表1所示。49.表1.双重rpa-lfd引物及探针序列信息[0050][0051][0052]实施例2.双重rpa-lfd的初步建立[0053]分别以pmd19-t-ompa、pmd19-t-kmt1质粒为模板，ddh2o作为阴性对照(nc)，采用如表2所示的体系进行扩增。具体步骤如下：[0054]①向含有冻干酶粉的0.2 mlnfo kit反应管中加入rehydration buffer 29.4μl反复进行吹打，使酶粉颗粒完全融化混匀；[0055]②向反应管内分别加入鸭疫里默氏杆菌上下游引物各1μl、0.3μl探针，巴氏杆菌上下游引物各1μl、0.3μl探针；[0056]③向反应管内加入9.0μl ddh2o和两种阳性质粒各2μl；[0057]④向反应管内加入2.5μlmgoac，上下颠倒甩动反应管，使混合物充分混匀；[0058]⑤混匀后，将反应液快速离心数秒，然后立即将反应管放入水浴锅中39℃恒温孵育5min；反应5 min后将反应管取出涡旋离心数秒，再置于水浴锅中继续反应25 min；[0059]⑥反应结束后，立即取出反应管置于冰盒中终止反应。取10μl反应液与190μlddh2o混合均匀；将双标核酸检测试纸条的样本端插入混合液中进行反应待出现结果后于5 min之内读取试验结果。[0060]表2.双重rpa-lfd检测方法的反应体系[0061][0062]为建立双重rpa-lfd检测方法，本实施例分别以质粒pmd19-t-ompa和pmd19-t-kmt1及两种质粒混合基因组dna作为模板进行扩增，扩增结束取10ul反应液加入到190 ul ddh2o中进行稀释，将试纸条浸入稀释液中进行反应待出现结果后于5 min内读取试验结果，结果如图1所示，当单独使用pmd19-t-ompa质粒作为模板时，试纸条上可观察到检测线t2和质控线c显色。当单独使用pmd19-t-kmt1质粒作为模板时，试纸条上可观察到检测线t1和质控线c显色。两种质粒dna同时作为反应模板时，试纸条上可见质控线c、检测线t1、检测线t2同时显色，阴性对照仅质控线显色。该结果表明本实施例建立的双重rpa-lfd方法可同时在一个体系中扩増出两种目标菌株的靶基因。[0063]实施例3.双重rpa-lfd反应条件优化[0064]1.双重rpa-lfd反应温度优化[0065]以质粒pmd19-t-ompa和pmd19-t-kmt1为模板，ddh2o为阴性对照，反应时间为30min；根据表2中双重rpa-lfd反应体系，依次设置不同的反应温度，包括20℃、25℃、30℃、37℃、39℃和42℃，重复试验，根据试纸条检测结果的显色程度，确定该反应体系的最优温度。[0066]结果如图2所示，在25℃-42℃范围内均有阳性结果，表明该检测方法在此温度范围内均可正常扩增，适用于一般温度环境。[0067]2.双重rpa-lfd反应时间优化[0068]以质粒pmd19-t-ompa和pmd19-t-kmt1模板，ddh2o为阴性对照，在双重rpa-lfd在37℃条件下，根据表2中双重rpa-lfd反应体系，以5 min为起始时间，5分钟为一个梯度，设置6组反应时间，分别为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min，重复试验，根据试纸条检测结果的显色程度，确定该反应体系的最优时间。[0069]结果如图3所示，该双重rpa-lfd体系在5min即可出现阳性条带，随着时间的增加检测线更加清晰。结合扩增效率及灵敏度，rpa扩增时间为15 min，结合试纸条显色时间，整个双重rpa-lfd体系从核酸扩增到试纸条检测只需要20min左右。[0070]实施例4.双重rpa-lfd特异性试验[0071]为检验双重rpa-lfd检测方法的特异性，以e.coli、se、ra、pm、staphylococcus、gpv、dpv、mdpv的dna作为反应模板，质粒pmd19-t-ompa和pmd19-t-kmt1为阳性对照，ddh2o为阴性对照，按照建立的双重rpa-lfd检测方法体系(表2)进行试验。试验结果如图4所示，该方法特异性强，除ra与pm检出外，其余模板均未检出。[0072]实施例5.双重rpa-lfd灵敏度测定[0073]为评估双重rpa-lfd的灵敏度，根据拷贝数计算公式：(6.02×1023拷贝数/mol)×质粒浓度(ng/μl)×10-9/(质粒碱基数×660)＝拷贝数(copies)/μl，计算所提取的质粒pmd19-t-ompa和pmd19-t-kmt1拷贝数并稀释至107copies/μl。[0074]对107copies/μl浓度的质粒进行10倍梯度倍比稀释处理，选取8个(107～100copies/μl)浓度质粒为模板，以ddh2o为阴性对照(nc)。在最佳反应温度和时间的条件下进行检测鸭疫里默氏杆菌和巴氏杆菌的灵敏度分析。[0075]本实施例提取两种质粒测其浓度为pmd19-t-ompa(1.83х1011copies/μl)和pmd19-t-kmt1(1.497х1011copies/μl)，将两种质粒稀释到107copies/μl-101copies/μl后均匀混合作为检测对象，结果如图5所示，该双重rpa-lfd方法最低检测下限为102copies/μl，可满足于大部分临床检测需求。[0076]实施例6.双重rpa-lfd临床应用[0077]从多个禽类养殖场采集病料64份，取1g左右组织病料加入少量的pbs，研磨匀浆，4℃、12 000r/min离心5min。按照dna提取流程获得病料的dna作为模板，并采用普通pcr与双重rpa-lfd两种检测方法进行检测。结果如图6-图8所示，双重rpa-lfd检测鸭疫里默氏杆菌阳性率为10.93％(7/64)，多杀性巴氏杆菌阳性率为4.68％(3/64)，普通pcr方法检出鸭疫里默氏杆菌阳性率10.93％(7/64)，多杀性巴氏杆菌阳性率为4.68％(3/64)，表明双重rpa-lfd方法与普通pcr方法结果一致。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!