一种罗伊氏乳杆菌检测用引物、试剂盒和应用的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于检测技术领域，具体是涉及一种罗伊氏乳杆菌检测用引物、试剂盒和应用。背景技术：2.铁不仅参与机体血红蛋白与肌红蛋白合成、调控机体糖脂代谢、维持线粒体氧化供能，同时还在干细胞增殖分化和机体免疫调节方面发挥着关键作用。适时、适量地补充铁，对提升母仔猪的免疫机能和生长性能十分关键。3.传统的缺铁监测和低效的补铁剂导致错过最佳的时间窗口，胎仔猪铁营养得不到有效补充，组织器官发育和生长受限，通常表现为弱仔数增加、平均初生体重和窝重下降，直至影响出生后的生长、发育和经济性能。母猪缺铁早期的监测和诊断，能为母猪拓宽补铁的时间窗口，及时、高效地补铁可有效防止胎仔猪发育不良和生长受限，提升母仔猪的健康度和生产性能。4.开发和应用早期监测和诊断技术，能更早发现母猪营养性铁缺乏，再加上及时给予高产母猪高效的补铁产品，把握补铁的时间窗口，及时补充胎仔猪的铁营养需求，可有效防止胎仔猪发育不良和生长受限，提升仔猪的初生体重和窝重，降低弱仔猪频率，提升母仔猪的健康度和生长性能。5.目前国内外尚缺乏缺铁监测的早期诊断产品。国内外现用于缺铁诊断的产品包括血清铁、血红蛋白(hgb)、转铁蛋白、不饱和铁结合力(uibc)等指标的检测试剂盒或试纸。(1)其中，血清铁、uibc和转铁蛋白的检测需要高昂的仪器设备和试剂盒。(2)hgb的检测虽有手持式的设备，但指标本身对“缺铁”的反应较为滞后，导致母猪补铁不及时，影响母猪的生产性能。(3)以上检测需要针对性的有创采集血液样本，繁琐程度和造成的动物应激不适宜于猪场全群条件下的监测。6.血清铁等指标的检测需要专业设备和复杂操作。目前多采用化学比色法检测血清铁，包括亚铁嗪比色法、双联吡啶比色法、菲洛嗪比色法；转铁蛋白检测是利用抗转铁蛋白血清与待检测的转铁蛋白结合形成抗原抗体复合物，其光吸收和散射浊度增加，与标准曲线比较，可计算出转铁蛋白含量；uibc测定是通过还原显色检测缓冲液同血清反应前后铁离子浓度变化来计算血清uibc水平。以上均需要配套分光光度仪或全自动生化仪进行测量，并且步骤较为繁琐。7.hgb等指标对“缺铁”的反应较为滞后。铁的吸收与代谢受机体铁稳态系统的精密调控，铁的缺乏极具隐蔽性。机体缺铁时，首先会通过降低肝脏hepcidin的表达，促使肝脏、脾脏等组织中的铁释放出来，用于血红素和红细胞生成，维持机体血清铁和血红蛋白(hgb)等指标的衡定。当机体持续缺铁数周后，血清铁和hgb水平显著下降，表现出铁缺乏的临床症状，需经过2-3周持续补铁才能恢复。8.血清铁、hgb、转铁蛋白、uibc等方法是对血清的直接检测，需要采集全群的血清，不仅操作繁琐，同时也极易造成动物应激，引起生产性能下降等结果，不适宜于猪场全群条件下的监测应用场景。技术实现要素：9.本发明要解决的技术问题是提供一种罗伊氏乳杆菌检测用引物、试剂盒和应用，灵敏度高，特异性好，精密度高，可以有效的检测母猪早期营养性缺铁。10.本发明的内容包括一种罗伊氏乳杆菌检测用引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为5’‑aagcaccctgatccgcaat-3’(seq id no.1)，下游引物的序列为5’‑aatttgccgcgcttcgtct-3’(seq id no.2)。11.本发明提供一种罗伊氏乳杆菌检测用试剂盒，包括荧光反应液a、荧光反应液b、内标、阴性对照、核酸释放剂和定量参考品，所述荧光反应液b中含有所述的引物。12.本发明采用罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)gyrb基因的荧光pcr定量检测方法，可对样本品中生物靶标进行检测和定量，从而为母猪妊娠期营养性缺铁评估提供简便易行方法。13.所述荧光反应液b中还含有引物探针，所述引物探针的序列为5’‑cacgaacagcgactgaccatgtct-3’(seq id no.3)，所述5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团；14.所述荧光反应液b中还含有内标引物和内标探针，所述内标引物包括内标上游引物和内标下游引物，内标上游引物的序列为5’‑cgcttggataacgaccta-3’(seq id no.4)，内标下游引物的序列为5’‑cagcaccacatactttcag-3’(seq id no.5)，内标探针的序列为5’‑tcctctaagccactgtccacacc-3’(seq id no.6)，所述5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。15.还含有内标重组质粒，编号puc-ipc，工作浓度为106copies/ml。该重组质粒含有一段随机的内标序列，核苷酸长度455bp，核苷酸序列为：16.ctggagactgagggttgacgcgcattcgtcattgaacgcagacacggctgagagaacatggagcgactgcactgcacttggtcgatctgattaggagtggggtttatgcccgcggcttatccccctatccttgcgacacgggagaagacagattgtcatcgatttcgcaagccatgatatgtttggcccgaccaaccgcgtttttctcgcgcttggataacgacctatggtgtggacagtggcttagaggacatgacacgacgggctgaaagtatgtggtgctggggcccttagatagctgcatagttggaccgctaggaattatatcaattcgagatctccagccgacaaagtaggctcctaactaacagggtccaaaggtttatcaccggtccttactctttgcgggacctttctacccatacaatatcgtcctccgatgatggatcacggag(seq id no.7)。17.所述报告荧光基团为fam或hex，淬灭荧光基团为bhq1。18.所述荧光反应液a：1250μl/管，1管/盒。包括pcr-buffer、dntps、热启动taq酶与ung酶，所述pcr-buffer中tris-hcl浓度为125～200mm，高于常用的10mm的浓度，这样pcr反应才不受碱性核酸释放剂的影响，这也是该试剂盒核酸免提取得以实现的核心内容。19.所述dntps包括datp、dutp、dgtp、dctp四种脱氧核糖核苷，其中使用dutp代替了一般常用的dttp，这样扩增条带为带有u碱基的dna。这种双链结构在ung酶存在时会被水解，因此可以减少扩增产物(pcr的主要污染源)残留的污染。20.热启动taq酶在荧光反应液a中的终浓度为0.2～0.3u/μl，该酶需在月95℃活化才能行使扩增活性。21.ung酶全称尿嘧啶-n-糖基化酶，能选择性水解断裂含有u碱基的dna中的尿嘧啶糖苷键，进而消除扩增产物残留、气溶胶污染等，该酶最佳活性温度为50摄氏度，95摄氏度失活，同热启动taq酶共同实现抑制假阳性的效果。22.荧光反应液b：650μl/管，1管/盒。上游引物和下游引物的浓度为500～750nm，引物探针的浓度为250～500nm；内标引物、内标探针的浓度分别为250～500nm。23.所述内标中含有重组质粒puc-ipc，将puc-ipc稀释至工作浓度为106copies/ml，作为内标。所述阴性对照为te缓冲溶液，所述核酸释放剂包括25～100mm的naoh、1～5％peg6000、0.5～1mm edta，该核酸释放剂中naoh可以有效的裂解细胞或病毒，释放出内容物并使之变性失活，非离子型去垢剂peg6000进一步分散蛋白与核酸，edta能有效的抑制核酸酶对dna的水解。24.定量参考品中克隆质粒puc-lr-gyrb的浓度为1.37×107～1.37×104copies/ml，在此范围内呈线性相关，相关系数r2＝0.99，在此线性扩增范围内，扩增效率为94％以上。25.本发明提供一种所述的试剂盒在制备检测母猪营养性缺铁制剂中的应用。检测方法包括如下步骤，26.将内标加入样本中，在85℃～95℃加热一段时间后，离心，取上清，加入pcr-mix，所述pcr-mix为荧光反应液a、荧光反应液b的混合液，得待测样本；将阴性对照、定量参考品、待测样本分别进行扩增，测量ct值，判断母猪是否营养性缺铁。27.扩增的循环参数设定如下：[0028][0029]本发明的有益效果是，本发明旨在开发一种早期监测和诊断技术，能更早发现母猪营养性铁缺乏，再加上及时给予高产母猪高效的补铁产品，把握补铁的时间窗口，及时补充胎仔猪的铁营养需求，可有效防止胎仔猪发育不良和生长受限，提升仔猪的初生体重和窝重，降低弱仔猪频率，提升母仔猪的健康度和生长性能。该技术的应用，能使得母猪缺铁“看得见”，母猪铁营养“补得上”，胎仔猪生长“跟得上”，实现精准化和个性化母仔猪铁缺乏防控，显著提升养殖户经济收益，产品具有较好的市场前景，为母猪铁营养精准调控提供技术支撑。[0030]本技术方案通过早期缺铁母猪生物样本中的生物标示物检测入手，建立的生猪“早期缺铁”监测和诊断方法，比传统监测“血清铁”、“血红蛋白”等指标更早、更灵敏、更准确地反应猪群的铁营养状态。[0031]本技术方案基于成熟的荧光定量pcr技术平台，一般猪场实验室相关设备和技术人员配套成熟，能很快的承担起该方案的检测工作。[0032]该技术方案已优化开发成试剂盒产品，标准化、规范化了采样、处理、检测、分析等流程，方便使用。[0033]本试剂盒采用核酸免提取、内标监控、标准曲线定量等技术，实现更简便、更精准的检测。[0034]本技术方案检测样本并非血清样本，为自然粪便样本，全群采集方便，不造成动物应激，方便在临床一线推广应用。附图说明[0035]图1为本发明的1-f,1-r引物的扩增曲线。[0036]图2为本发明的2-f,2-r引物的扩增曲线。[0037]图3为本发明的3-f,3-r引物的扩增曲线。[0038]图4为本发明的引物探针1-p,1-f,1-r的扩增曲线。[0039]图5为本发明的引物探针2-p,2-f,2-r的扩增曲线。[0040]图6为本发明的引物探针3-p,3-f,3-r的扩增曲线。[0041]图7为本发明的无内标体系的扩增曲线。[0042]图8为本发明添加内标ipc01的扩增曲线。[0043]图9为本发明添加内标ipc03的扩增曲线。[0044]图10为本发明添加内标ipc05的扩增曲线。[0045]图11为本发明的线性扩增曲线及标准曲线。具体实施方式[0046]实施例1[0047]一种检测方法，关键步骤如下。[0048](1)样本采集：使用植绒拭子粘取母猪新鲜排泄的粪便样品，置入加入有5ml核酸释放剂的样品管中，混合均匀。[0049](2)内标设立：每管样品管中加入10μl内标。[0050](3)核酸释放：将样品管置于金属浴或水浴条件下，85℃～95℃加热10min后，短暂离心后，取上清用于后续pcr检测。[0051]扩增试剂配制：取出包装盒中各组分，室温放置，待其彻底溶解后，震荡混匀备用；按比例(荧光反应液a 25μl/反应+荧光反应液b15μl/反应)取相应量的试剂，充分混匀成pcr-mix，瞬时离心，向每个反应管中分别加入40μl pcr-mix。[0052](4)加样：取10μl阴性对照/定量参考品/待测样本分别加入对应pcr反应孔，盖上管盖，混匀短暂离心，转移至扩增区。[0053](5)上机扩增：将pcr反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、定量参考品及待测样本名称；选择fam通道检测罗伊氏乳杆菌核酸；选择hex通道检测内标；设置反应体系为50μl；循环参数设定如下：[0054][0055]设置完毕，保存文件，运行反应程序。[0056](6)质量控制：阴性对照hex通道ct值≤35，fam通道无ct值或典型扩增曲线；定量参考品a～dfam通道检测均为阳性，且标准曲线相关系数r2≥0.98。[0057](7)结果判定：待测样本hex通道ct值≤35，否则需要重新检测。根据仪器计算值报告相应的定量测定结果，根据测定值范围进一步做出母猪营养性缺铁评估。[0058]实施例2[0059]经宏基因组研究表明，母猪妊娠期营养性缺铁指标同约翰逊乳杆菌(lactobacillusjohsonii)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)、栖瘤胃普雷沃氏菌(protella ruminicola)等特征性肠道菌群含量水平密切相关，可通过特征菌种含量作为指示。细菌16s rrna、gyrb、reca、pepc、gdh等基因常用来进行种属的鉴定和细菌检测，在本研究中，我们建立了一种罗伊氏乳酸杆菌gyrb基因的荧光pcr定量检测方法，可对样本品中生物靶标进行检测和定量，从而为母猪妊娠期营养性缺铁评估提供简便易行方法。[0060]1材料与方法[0061]1.1试剂与仪器[0062]hotstart taq酶(5u/μl)购自于天根生化科技有限公司；depc处理水购自于上海生物工程有限公司；引物、探针、序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成；2×pcr buffer(含mg2+、dntp等)自配。[0063]eppendorf biophotometer d30核酸蛋白测定仪；宏石slan-96s荧光定量pcr仪；abi7500荧光定量pcr仪。[0064]1.2样品与处理[0065]阳性质粒：根据ncbi中罗伊氏乳杆菌atcc 53608株gyrb基因全长序列，合成克隆质粒puc-lr-gyrb。使用核酸蛋白测定仪对puc-lr-gyrb质粒浓度进行测定，根据实际浓度测定值，用te缓冲溶液将puc-lr-gyrb依次稀释至约109～100copies/ml等梯度浓度。[0066]内标质粒：合成含随机内标序列的克隆质粒puc-ipc。使用核酸蛋白测定仪对puc-ipc质粒浓度进行测定，根据实际浓度测定值，用te将puc-ipc稀释至约106copies/ml。[0067]特异性测试质粒：鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)gyrb克隆质粒puc-lrh-gyrb；约氏乳杆菌(lactobacillus johsonii)gyrb克隆质粒puc-lj-gyrb；格氏乳杆菌(lactobacillusgasseri)gyrb克隆质粒puc-lg-gyrb；植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)gyrb克隆质粒puc-lp-gyrb；阴道乳杆菌(lactobacillus vaginalis)gyrb克隆质粒puc-lv-gyrb；詹氏乳杆菌(lactobacillus jensenii)gyrb克隆质粒puc-lje-gyrb；栖瘤胃普雷沃氏菌(protellaruminicola)gyrb克隆质粒puc-pr-gyrb。[0068]1.3引物探针体系测试[0069]通过生物信息学分析比对ncbi中登陆的43株lactobacillus reuteri基因组gyrb基因序列信息，选取种内保守、种间特异区域的序列，使用oligo 7软件设计多组特异性的引物与探针。根据随机内标序列设计多组内标引物与探针。具体序列信息见表1。使用染料法、探针法荧光pcr试验测试各组gyrb引物探针对靶标基因的扩增性能，并筛选最佳匹配的内标体系。[0070]表1供测试引物探针序列信息[0071][0072][0073]1.4线性扩增试验[0074]配制反应体系，分别加入1.37×107copies/ml～1.37×102copies/ml浓度(1:10稀释)的puc-lr-gyrb阳性质粒进行扩增。扩增结束后，根据扩增标准曲线确定线性扩增范围。[0075]1.5分析灵敏度试验[0076]配制反应体系，分别加入2.74×103copies/ml、1.37×103copies/ml、685copies/ml的阳性质粒进行扩增，每个浓度重复21次，根据检出率(≥95％)确定最低检测限(分析灵敏度)。并根据最低检测限检出的ct值计算阴阳性判定区间(灰区)。[0077]1.6精密度试验[0078]配制反应体系，分别加入1.37×107、1.37×105、1.37×103copies/ml浓度的阳性质粒进行扩增，每个浓度重复10次，根据检测ct值计算变异系数(cv值)。[0079]1.7特异性试验[0080]配制反应体系，分别加入7份特异性测试质粒(经te稀释至适合浓度)进行扩增，同时设立阳性对照(puc-lr-gyrb)、阴性对照(te溶液)根据检测结果分析本方法的特异性。[0081]2结果与分析[0082]2.1引物探针体系筛选[0083]2.1.1 gyrb扩增引物筛选[0084]使用染料法测试3组引物扩增模板。根据不同浓度模板的检测ct值，结合扩增曲线形态，结果表明3组引物扩增效率均较好。(图1-3)[0085]扩增体系：2×pcr buffer 25μl，f/r引物(40μm)各0.5μl，hotstart taq酶(5u/μl)0.5μl，evegreen染料1μl，模板5μl，ddh2o补足至25μl。荧光pcr扩增程序如下：95℃2分，1循环；95℃15秒，60℃30秒(读取荧光)，50循环。唯一标示10-7、10-8代表模板浓度为1.37×105copies/ml、1.37×104copies/ml。[0086]2.1.2 gyrb探针筛选[0087]在引物筛选结果的基础上，加入各组特异性探针，通过探针法荧光pcr试验评估探针的匹配性。根据低浓度模板的检测ct值，结合扩增曲线形态，优选第3组引物探针(3-lr-f-991、3-lr-r-1128、3-lr-p-u1049)。(图4-6)。[0088]扩增体系：2×pcr buffer 25μl，f/r引物(40μm)各0.5μl，probe(20μm)0.25μl，hotstart taq酶(5u/μl)0.5μl，模板5μl，ddh2o补足至25μl。荧光pcr扩增程序如下：95℃2分，1循环；95℃15秒，60℃30秒(读取荧光)，50循环。模板浓度为1.37×103copies/ml。唯一标示e代表染料法扩增结果，p代表探针法扩增结果。[0089]2.1.3内标体系筛选[0090]在引物、探针筛选结果的基础上，添加不同的内标体系(ipc01、ipc03、ipc05)，测试各组同无内标组扩增性能差异，结果表明ipc01、ipc03内标体系对主通道的扩增影响较小，且自身曲线形态稳定，故优选两者作为配套内标监测体系。(图7-10)[0091]扩增体系：2×pcr buffer 25μl，3-f/3-r引物(40μm)各0.5μl，3-p(20μm)0.25μl，ipc01/ipc03/ipc05内标体系，hotstart taq酶(5u/μl)0.5μl，模板5μl，ddh2o补足至25μl。荧光pcr扩增程序如下：95℃2分，1循环；95℃15秒，60℃30秒(读取荧光)，50循环。模板浓度为1.37×106copies/ml～1.37×103copies/ml。[0092]2.2线性扩增范围[0093]如图11所示，本方法对1.37×107～1.37×102copies/ml的梯度模板扩增正常。其中1.37×107～1.37×103copies/ml范围内呈线性相关，相关系数r2＝0.99，在此线性扩增范围内，扩增效率为94％以上。结合以上结果，可将此方法的定量范围确定在1.37×107～1.37×104copies/ml。[0094]2.3分析灵敏度[0095]精密度试验结果显示(表2)，2.74×103copies/ml模板(13.7copies/反应)的检出率为100％，1.37×103copies/ml模板(6.85copies/反应)的检出率为100％，6.85×102copies/ml模板(3.43copies/反应)的检出率为81.0％。1.37×103copies/ml为最低检测限(lod)，根据1.37×103copies/ml模板重复检测的ct值计算出最低检测限对应灰区ct值范围为33.74(取33)至39.61(取40)，即ct值≤33判定阳性，33＜ct值＜40判定可疑，ct值≥40或无ct值显示(noct)判定阴性，可以样本通过多次复检确定。[0096]表2分析灵敏度测定结果[0097][0098][0099]2.4精密度[0100]经高、中、低浓度模板检测，精密度试验结果显示(表3)，本方法检测精密度(cv值)为1.56～3.24％，具有较好的检测重复性。[0101]表3精密度测试结果[0102][0103]2.5特异性[0104]特异性试验结果(表4)显示，7份特异性质粒样品在内标检出前提下，lactobacillusreuteri-gyrb均未检出，表明本方法不会与上述7种肠道菌群发生交叉反应。[0105]表4特异性试验结果[0106][0107]所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本技术的保护范围限于这些例子；在本技术的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本技术中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。[0108]本技术中一个或多个实施例旨在涵盖落入本技术的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本技术中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。









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