茯苓酸合成的关键基因及应用的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及茯苓酸合成的关键基因及应用。背景技术：2.目前茯苓野生资源濒临枯竭，茯苓酸在茯苓药材中含量低，严重限制了茯苓酸的药用开发。因此，挖掘茯苓酸的生物合成关键酶，将茯苓酸合成与异源表达结合起来，使原本在茯苓等中草药中才能合成的茯苓酸在微生物(如酵母等)中也能合成，具有重要意义。技术实现要素：3.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了茯苓酸合成的关键基因及应用，。4.本发明提出的茯苓酸合成的关键基因，核苷酸序列如seq id no.1所示。5.本发明提出的载体，包含上述茯苓酸合成的关键基因。6.本发明提出的微生物，包含上述载体。7.本发明提出的上述微生物在茯苓酸合成中的应用。8.本发明的有益技术效果：9.茯苓野生资源濒临枯竭，茯苓酸在茯苓药材中含量低等问题，严重限制了茯苓酸的药用开发。本专利发明的基因首次构建了茯苓酸从头合成全路径，挖掘得到的茯苓酸的生物合成关键酶，不仅可以用于茯苓生物育种和代谢调控来提高茯苓药材中茯苓酸含量，同时也将茯苓酸合成与异源表达结合起来，使原本在茯苓等中草药中才能合成的茯苓酸在酵母等微生物中也能合成，可以使茯苓酸的含量大大提高，液体发酵后含量可高达17.632ug/l，并降低其生产成本。附图说明10.图1为本发明提出的pesc-trp、pesc-trp-pccpr、pesc-trp-cyp5035、pesc-trp-cyp5035-pccpr等异源表达载体的构建；11.图2为本发明提出的含pesc-trp、pesc-trp-pccpr、pesc-trp-cyp5035、pesc-trp-cyp5035-pccpr基因的酵母平板图；12.图3为本发明提出的载体中插入基因的pcr验证图；m，marker ladder，1,cyp5035引物pcr检测pesc-trp；2,cyp5035引物pcr检测pesc-trp-pccpr；3,cyp5035引物pcr检测pesc-trp-cyp5035；4,引物cyp5035 pcr检测pesc-trp-cyp5035-pccpr；5,引物pccpr pcr pesc-trp；6,引物pccpr pcr检测pesc-trp-pccpr；7,引物pccpr pcr检测pesc-trp-cyp5035；8,引物pccpr pcr检测pesc-trp-cyp5035-pccpr；13.图4为本发明提出的液质检测含pesc-trp、pesc-trp-pccpr、pesc-trp-cyp5035、pesc-trp-cyp5035-pccpr基因的酵母发酵液中16α-羟基栓菌酸、土莫酸、3-o-乙酰-16α-羟基-栓菌酸、茯苓酸的含量；其中：(a)为不同酵母6h发酵液液质检测，(b)为对不同酵母6h发酵液中16α-羟基栓菌酸、土莫酸、3-o-乙酰-16α-羟基-栓菌酸、茯苓酸的含量对比；14.图5为本发明提出的cyp5035以羊毛甾醇为底物，进行c-16羟基化和c-20甲基羧基化生物合成茯苓酸路径。具体实施方式15.下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。16.实施例117.基于pesc-trp载体质粒转化系统构建18.(1)酶切位点19.如图1所示，pccpr基因通过ecorⅰ和claⅰ插入到pesc-trp载体质粒的gal10启动子之后，cyp5035基因通过bamhⅰ和salⅰ酶切位点插入pesc-trp载体质粒的gal1启动子之后。20.其中pccpr的核苷酸序列如seq id no.2所示；gal10启动子的核苷酸序列如seq id no.3所示；gal1启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示；ecorⅰ的酶切位点的核苷酸序列如seq id no.5所示；claⅰ的酶切位点的核苷酸序列如seq id no.6所示；bamhⅰ的酶切位点的核苷酸序列如seq id no.7所示；salⅰ的酶切位点的核苷酸序列如seq id no.8所示。21.(2)菌种保存22.采用top10菌种。23.冻干状态质粒-20℃甘油菌-80℃24.冻干状态质粒量少，开盖时容易丢失，故开盖前应先进行离心操作，确保质粒沉在管子底部。打开盖子后，加入40ul左右te buffer或ddh2o溶解，充分混匀，然后再次通过离心将液体收集在管子底部。冻干或者液体质粒都保存在-20℃，保存浓度可根据实验调整，尽可能高浓度保存。甘油菌于-80℃下可长期保存，避免反复冻融。25.(3)扩大培养26.使用前不建议使用甘油菌直接大批量接种培养，可以先用接种针蘸取甘油菌，在带有对应抗体的平板上划线，也可以用甘油菌直接涂布复苏，第二天再挑取生长正常的菌落接菌扩大培养。甘油菌开盖后极易污染，使用过程需无菌操作，避免交叉污染。27.实施例228.质粒转化及验证29.(1)感受态的制备30.(a)bt15感受态制备31.将bt15菌种(保存于-80℃)在sd-leu培养基平板上划线，28℃培养2-4天。2-4天后分别挑一单菌落接种到3ml sd-leu液体培养基中，28℃，200rpm，培养过夜；待od600达到0.4-0.5，3000rpm离心5min，弃上清。用1ml y1溶液(coolaber试剂盒)重悬沉淀，3000rpm离心5min，弃上清。加入100uly2(coolaber试剂盒)溶液重悬，按50ul分装于1.5ml管中。32.(b)含有pesc-trp质粒的bt15感受态制备33.将pesc-trp质粒的bt15菌种(保存于-80℃)在sd-trp-leu培养基平板上划线，28℃培养2-4天。2-4天后分别挑一单菌落接种到3ml sd-trp-leu液体培养基中，28℃，200rpm，培养过夜；待od600达到0.4-0.5，3000rpm离心5min，弃上清。用1mly1溶液(coolaber试剂盒)重悬沉淀，3000rpm离心5min，弃上清。加入100uly2(coolaber试剂盒)溶液重悬，按50ul分装于1.5ml管中。34.(2)质粒转化35.(a)pesc-trp转化36.吸取350ul y3溶液(coolaber试剂盒)与10ul pesc-trp载体质粒加入50ul bt15感受态细胞中，反复吹吸沉淀，使酵母细胞完全悬浮于预混液中。30℃的水浴锅中热激60min，每10min混匀一次。12000rpm离心15s，弃上清。加入400ul无菌去离子水重悬菌体，涂sd-trp-leu筛选培养基平板，28℃培养2-4天。37.(b)pesc-trp-pccpr转化38.吸取350ul y3溶液(coolaber试剂盒)与10ul载有关键基因pccpr的pesc-ura载体质粒加入50ul含有pesc-trp质粒的bt15感受态细胞中，反复吹吸沉淀，使酵母细胞完全悬浮于预混液中。30℃的水浴锅中热激60min，每10min混匀一次。12000rpm离心15s，弃上清。加入400ul无菌去离子水重悬菌体，涂sd-trp-ura-leu筛选培养基平板，28℃培养2-4天。39.(c)pesc-trp-cyp5035转化40.吸取350ul y3溶液(coolaber试剂盒)与10ul载有关键基因cyp5035的pesc-trp载体质粒加入50ul bt15感受态细胞中，反复吹吸沉淀，使酵母细胞完全悬浮于预混液中。30℃的水浴锅中热激60min，每10min混匀一次。12000rpm离心15s，弃上清。加入400ul无菌去离子水重悬菌体，涂sd-trp-leu筛选培养基平板，28℃培养2-4天。41.(d)pesc-trp-cyp5035-pccpr转化42.吸取350uly3溶液(coolaber试剂盒)与10ul载有关键基因cyp5035和pccpr的pesc-trp载体质粒加入50ul bt15感受态细胞中，反复吹吸沉淀，使酵母细胞完全悬浮于预混液中。30℃的水浴锅中热激60min，每10min混匀一次。12000rpm离心15s，弃上清。加入400ul无菌去离子水重悬菌体，涂sd-trp-leu筛选培养基平板，28℃培养2-4天。43.(e)培养基44.sd-leu培养基(100ml)：sd-leu 0.8g，葡萄糖2g，分开121℃灭菌20min，灭菌后放凉后混匀，常温保存，固体培养基加2％的琼脂。45.sd-trp-leu培养基(100ml)：sd-trp-leu 0.8g，葡萄糖2g，分开121℃灭菌20min，灭菌后放凉后混匀，常温保存，固体培养基加2％的琼脂。46.sd-trp-ura-leu培养基(100ml)：sd-trp-ura-leu 0.8g，葡萄糖2g，分开121℃灭菌20min，灭菌后放凉后混匀，常温保存，固体培养基加2％的琼脂。47.图2为本发明提出的含pesc-trp、pesc-trp-pccpr、pesc-trp-cyp5035、pesc-trp-cyp5035-pccpr基因的酵母平板图，四种酵母呈白色圆形，湿润，粘稠，易挑起，表面光滑。48.(3)关键基因转化验证49.(a)提取酵母质粒50.于筛选培养基中挑选单一菌落接种到3ml对应液体培养基中，28℃，200rpm，培养过夜。5000rpm，5min离心收集菌体；弃上清，加入480ul buffer se，4.8ulβ-巯基乙醇和20ul lyticase solution(omega试剂盒)，涡旋重悬菌体后于30℃孵育至少30min；5000rpm离心5min，弃上清，加入250ul buffer ypⅰ/rnase a(omega试剂盒)，50mg玻璃珠，最大速度涡旋混匀5min，待玻璃珠沉淀下去后，将上清液转移；加入250ul ypⅱ(omega试剂盒)，轻轻颠倒混匀4-6次至裂解液变澄清，在室温下孵育20min后加入350ul ypⅲ(omega试剂盒)，轻pesc-trp；6,引物pccpr pcr检测pesc-trp-pccpr；7,引物pccpr pcr检测pesc-trp-cyp5035；8,引物pccpr pcr检测pesc-trp-cyp5035-pccpr，cyp5035条带为1683bp，pccpr条带为2211bp结果显示pesc-trp不含有基因cyp5035及pccpr，pesc-trp-pccpr含有基因pccpr，不含有基因cyp5035，pesc-trp-cyp5035含有基因cyp5035，不含有基因pccpr，pesc-trp-cyp5035-pccpr含有基因cyp5035及pccpr，各基因的条带大小符合，且明亮。61.实施例362.发酵产生茯苓酸63.(1)制作发酵液64.(a)pesc-trp、pesc-trp-cyp5035、pesc-trp-cyp5035-pccpr65.分别从sd-trp-leu筛选培养基上挑一单菌落接种至3ml sd-trp-leu液体培养基(葡萄糖2％添加)中，摇床28℃，200rpm，培养过夜；接入100ml sd-trp-leu液体培养基(葡萄糖2％添加)中扩大培养，过夜；分装至50ml离心管，5000rpm离心10min，弃上清，加入适量无菌水重悬沉淀，5000rpm离心5min，弃上清，水洗两次；将离心后的菌接入100ml sd-trp-leu液体培养基(棉子糖、半乳糖2％添加)中进行发酵，分别于6h、24h进行取样。66.(b)pesc-trp-pccpr67.从sd-trp-ura-leu筛选培养基上挑一单菌落接种至3ml sd-trp-ura-leu液体培养基(葡萄糖2％添加)中，摇床28℃，200rpm，培养过夜；接入100ml sd-trp-ura-leu液体培养基(葡萄糖2％添加)中扩大培养，过夜；分装至50ml离心管，5000rpm离心10min，弃上清，加入适量无菌水重悬沉淀，5000rpm离心5min，弃上清，水洗两次；将离心后的菌接入100ml sd-trp-ura-leu液体培养基(棉子糖、半乳糖2％添加)中进行发酵，分别于6h、24h进行取样。68.(c)培养基69.sd-trp-leu培养基(100ml，葡萄糖2％)：sd-trp-leu 0.8g，葡萄糖2g，分开121℃灭菌20min，灭菌后放凉后混匀，常温保存。70.sd-trp-leu培养基(100ml，棉子糖和半乳糖均为2％)：sd-trp-leu 0.8g，棉子糖和半乳糖均为2g，sd-trp-leu(添加80ml无菌水)、20ml无菌水121℃灭菌20min，灭菌放凉后，将棉子糖、半乳糖直接加入无菌水中溶解，过滤除菌，与sd-trp-leu混匀，常温保存。71.sd-trp-ura-leu培养基(100ml，葡萄糖2％)：sd-trp-ura-leu 0.8g，葡萄糖2g，分开121℃灭菌20min，灭菌后放凉后混匀，常温保存。72.sd-trp-ura-leu培养基(100ml，棉子糖和半乳糖均为2％)：sd-trp-ura-leu0.8g，棉子糖和半乳糖均为2g，sd-trp-ura-leu(添加80ml无菌水)、20ml无菌水121℃灭菌20min，灭菌放凉后，将棉子糖、半乳糖直接加入无菌水中溶解，过滤除菌，与sd-trp-ura-leu混匀，常温保存。73.(2)样品处理74.发酵6h，24h进行取样，每次取50ml，留3ml样品测od(600nm)值，剩余样品5000rpm离心10min，上清倒入50ml烧瓶。往上清中加入20ml乙酸乙酯进行萃取，待分层后吸取上层溶液至蒸发皿，至100℃水浴锅上蒸干，蒸干后待稍冷却加入1ml无水乙醇溶解，用1ml针头移取过滤至液质小瓶。沉淀加入4ml无水乙醇，超声20min，静置一会，用1ml针头取部分上清过滤至液质小瓶。75.(3)液质76.液质条件如下：[0077][0078][0079]图4为本发明提出的液质检测含pesc-trp、pesc-trp-pccpr、pesc-trp-cyp5035、pesc-trp-cyp5035-pccpr基因的酵母发酵液中16α-羟基栓菌酸、土莫酸、3-o-乙酰-16α-羟基-栓菌酸、茯苓酸的含量；其中：(a)为不同酵母6h发酵液液质检测，(b)为对不同酵母6h发酵液中16α-羟基栓菌酸、土莫酸、3-o-乙酰-16α-羟基-栓菌酸、茯苓酸的含量对比；结果显示，含pesc-trp、pesc-trp-pccpr、pesc-trp-cyp5035基因的酵母发酵液中不含有16α-羟基栓菌酸、土莫酸、3-o-乙酰-16α-羟基-栓菌酸、茯苓酸等物质，含pesc-trp-cyp5035-pccpr基因的酵母发酵液中含有16α-羟基栓菌酸、土莫酸、3-o-乙酰-16α-羟基-栓菌酸、茯苓酸等物质。[0080]实施例4[0081]bt15发酵扩大培养增大茯苓酸产量[0082]经实施例3可得，含pesc-trp-cyp5035-pccpr基因的酵母发酵液在6h时，茯苓酸产量最大，因此扩大培养6h发酵液，以增大茯苓酸产量。6h发酵液扩大至100l，其余操作均与实施例3一致。利用液相将茯苓酸分离，得到茯苓酸含量可高达17.632ug/l。[0083]图5为本发明提出的cyp5035以羊毛甾醇为底物，进行c-16羟基化和c-20甲基羧基化生物合成茯苓酸路径，lanosterol在cyp5035基因的调控下生成16-hydroxytrametenolic acid(16α-羟基栓菌酸)，继而在smt1(erg6)基因的调控下生成pachymic acid(茯苓酸)。[0084]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，并不能因此而理解为对发明专利范围的限制，以本基因序列为基础进行修改而具有相同功能的序列和实施应用，同样受本专利保护。









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