一种藏药小檗皮的检测引物、检测试剂盒及检测方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种藏药小檗皮的检测引物、检测试剂盒及检测方法。背景技术：2.小檗皮始载于《四部医典》，是藏医临床治疗“京尼萨库”病(糖尿病)及其并发症的常用药。小檗皮目前未被收入《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药分册》标准正文，仅在标准附录中规定其来源为小檗科植物甘肃小檗berberis kansuensis schneid.及其同属多种植物的干燥内皮，其同属植物在我国大约为200种，目前市场、藏医院和藏药厂使用的主流品种为甘肃小檗b.kansuensis schneid.、鲜黄小檗b.diaphana maxim.、匙叶小檗b.vernae schneid.以及刺红珠b.dictyophylla franch.。3.由于小檗皮资源有限，品种多样，且芸香科黄皮树的干燥树皮黄柏phellodendron chinense schneid.与小檗皮的外形相似，经调查发现，市场上出现过以黄柏掺入小檗皮混用的情况，严重影响了药材以及成药的质量和临床疗效，此外，小檗皮作为一种常用药材，在多种藏成药中使用，而藏成药均是由几味甚至几十味药材组成，药材粉碎以后已经不能从外观形态上进行鉴别，多种药材的化合物之间可能互相影响理化鉴定结果，从外形鉴别和理化鉴别可能会存在难点，所以建立一个小檗皮药材以及藏成药中小檗皮的快速鉴定方法具有十分重要的意义。4.因为dna分子不受其他药材的干扰和影响，并且即使存在微量的dna也可以通过pcr扩增检测，以dna条形码、位点特异性pcr为代表的dna分子鉴定技术已经被证明可以有效的应用于中药材以及中成药中原料药的真伪鉴别和定量分析；川贝母、乌梢蛇、蕲蛇、石斛等药材的pcr鉴别法也已被《中国药典》收载。5.中国专利cn201610499262.6，公开一种鉴定小檗皮基原的检测试剂盒，是本发明的发明人的专利，但是在该专利的方法是利用通用引物对待测样品进行扩增和测序，通过手动校正，拼接序列来判断小檗皮的基原品种，所以检测过程耗费时间长，且操作复杂，结果不直观，并且无法检测成药中是否含有小檗皮药材。本发明选择采用位点特异性pcr联合荧光可视化分析技术可对小檗皮药材及其成药中的小檗皮进行检测。检测原理是利用特异性引物对小檗皮特异性dna进行扩增，并在扩增结束后加入荧光染料对扩增产物进行检测，检测结果可以在荧光下通过肉眼进行观测，无需进行测序等复杂操作，可以有效克服现有技术的不足，大幅度缩短检测时间，更加简便快捷的检测出小檗皮主流品种以及成药中是否含有小檗皮，保证药材和成药的用药安全。6.此外，在核酸扩增部分，传统的pcr扩增体系，通常在变性、退火、延伸3个温度点停留一定的时间来达到核酸分子扩增的目的；本发明创造性地省略掉3个温度点的停留时间，通过对扩增体系进行设计和优化，使得反应体系只需要在高低两个温度点之间进行往复升降温就可以保证扩增的顺利进行，由于省略掉3个温度点的停留时间，扩增时间会从原来的1小时以上缩短至20-30分钟，相对于传统的pcr扩增体系，我们将此方法命名为快速核酸扩增方法。技术实现要素：7.为此，本发明提供一种藏药小檗皮的检测引物、检测试剂盒及检测方法，以解决现有检测耗时长，操作复杂等问题。8.本发明上述方法是利用快速核酸扩增方法联合荧光可视化分析技术扩增4种小檗皮主流品种匙叶小檗、鲜黄小檗、甘肃小檗和刺红珠和成药中小檗皮的dna。9.本发明利用快速核酸扩增方法联合荧光可视化分析技术，可以快速、准确、灵敏地鉴别出小檗皮4种主流品种，还可以检测藏成药中的小檗皮，节约核酸扩增时间，降低分析成本，保证了小檗皮药材及其藏成药的质量和临床疗效。10.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：11.根据本发明第一方面提供的一种藏药小檗皮的检测引物，所述正向内引物的碱基序列如seq id no.1所示；反向内引物的碱基序列如seq id no.2所示。12.本发明的快速核酸扩增方法的正向反向引物是以小檗皮4种主流品种its2序列区域为模板设计的特异性引物，其目的条带为112bp；由于小檗属植物的序列相似度极高，该引物可能也可以扩增同属的其他多种小檗皮。13.小檗属植物的序列相似度极高，该引物可能也可以扩增同属的其他多种小檗皮，即也可应用于其他同属小檗皮药材的鉴定。14.根据本发明第二方面提供的一种藏药小檗皮的检测试剂盒，所述试剂盒包括超快速核酸扩增和荧光可视化分析；15.所述超快速核酸扩增利用如权利要求1所述的引物。16.进一步的，所述超快速核酸扩增体系为反应总体系为25μl，包括10×buffer缓冲液2.5μl，10mm dntp 0.5μl，引物各1μl，easytaq 0.5μl，dna 5μl，加灭菌水补足25μl。17.进一步的，所述超快速核酸扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性0s，55℃复性0s，35个循环。18.根据本发明第三方面提供的一种藏药小檗皮的检测方法，包括：19.步骤一，提取待测样品的dna；20.步骤二，利用超快速核酸扩增进行待测样品的快速核酸扩增；21.步骤三，对步骤二的扩增产物进行荧光可视化分析。22.进一步的，所述步骤三中，荧光可视化分析方法为凝胶电泳检测和荧光可视化检测。23.作为示例，分析方法具体为取各pcr产物5μl，与1μl 6×dna上样缓冲液混合后点样，在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像仪下观察；向pcr产物中，加入1μl 500×sybr greenι型荧光染料，混匀，在365nm紫外光下观察。24.进一步的，所述荧光可视化检测即在快速核酸扩增后的扩增产物中加入500×sybr greenι型荧光染料，并在365nm紫外光下观察。25.根据本发明第四方面提供的一种藏药小檗皮的检测方法在主流品种小檗皮以及藏成药中小檗皮检测中的应用。26.本发明采用的小檗皮品种，为我国使用的小檗皮主流品种匙叶小檗、鲜黄小檗、甘肃小檗和刺红珠；藏成药为八味小檗皮胶囊、八味小檗皮散和四味姜黄汤散。27.本发明具有如下优点：28.本发明的检测方法采用了超快速核酸扩增联合荧光可视化分析技术，可在30分钟左右完成扩增以及检测，大幅度减少了药材的检测时间。29.本发明提供的试剂盒和方法，可以准确、有效的鉴别小檗皮的4种主流品种匙叶小檗、鲜黄小檗、甘肃小檗和刺红珠与常见的混淆品黄柏，还可以检测成药中是否含有小檗皮，采用快速核酸扩增技术和荧光可视化技术，操作简单，扩增和检测时间短，30分钟即可完成扩增和检测过程，高效快速且准确，为小檗皮主流品种和成药的检测提供可靠依据。附图说明30.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。31.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。32.图1为本发明实验例1提供的一种检测试剂盒的特异性验证图，其中nc为阴性对照，1为常见混淆品黄柏，2为匙叶小檗，3为鲜黄小檗，4为甘肃小檗，5为刺红珠，m为marker。33.图2为本发明实验例1提供的一种小檗皮检测试剂盒的灵敏度性验证图，样品为4种小檗皮混合dna提取液，其中nc为阴性对照，1为1×104pg/μl，2为1×103pg/μl，3为100pg/μl，4为50pg/μl，5为25pg/μl，6为10pg/μl，7为1pg/μl，m为marker。34.图3为本发明实验例2提供的试剂盒对小檗皮药材的适用性验证图，其中nc为阴性对照，1-13、15-16为4种小檗皮主流品种，14为中药材黄柏，m为marker。35.图4为本发明实验例3提供的藏成药中小檗皮检测验证图，其中nc为阴性对照，1为八味小檗皮胶囊，2为八味小檗皮散，3为四味姜黄汤散，m为marker。具体实施方式36.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。37.一、材料38.1.药材39.本研究建立方法时所用的4批小檗皮基原植物，由成都中医药大学范刚教授鉴定为甘肃小檗berberis kansuensis schneid.、鲜黄小檗berberis diaphana maxim.、匙叶小檗berberis vernae schneid.以及刺红珠berberis dictyophylla franch.，基原植物信息见表1。40.表1基原植物信息表[0041][0042]2.试剂[0043]easytaq dna聚合酶(北京全式金生物技术有限公司)。2000bp dna分子量标准marker、琼脂糖、10mm dntp mixture solution和50x tae缓冲液(生工生物工程(上海)股份有限公司)，goldviewι型核酸染料(北京索莱宝科技有限公司)。sybr greenι核酸染料(invitrogen)。植物组dna提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司)。[0044]3.仪器[0045]基因扩增仪lifetouch(杭州博日科技股份有限公司)，电泳仪电源dyy-6c型(北京六一生物科技有限公司)，凝胶电泳成像系统jy04s-3c型(北京君意东方电泳设备有限公司)，台式微量高速离心机h1650-k(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，zf-90型多功能暗箱式紫外透射仪(上海宝山顾村电光仪器厂)。[0046]实施例1[0047]本实施例提供一种小檗皮检测试剂盒及检测方法的建立。[0048]1.小檗皮药材dna提取[0049]取小檗皮基原植物样品适量，研磨均匀后分别置于1.5ml离心管中，采用植物dna提取试剂盒的步骤提取样品的dna，利用超微量紫外可见分光光度计测定dna提取液的浓度和纯度。dna提取液置于-20℃保存备用。[0050]2.its2测序[0051]将小檗皮基原植物的dna提取液用its2序列的通用引物s2f，如seq idno.3所示(5’‑atgcgatacttggtgtgaat-3’)和s3r如seq id no.4所示(5’‑gacgcttctccagactacaat-3’)进行pcr扩增。[0052]反应总体系为25μl，包括10×buffer缓冲液2.5μl，10mm dntp 0.5μl，引物各1μl，easytaq 0.5μl，dna提取液1μl，加灭菌水补足25μl。藏成药扩增体系总体积仍为25μl，其中将dna提取液增加至2μl。pcr反应条件为：95℃预变性90s；95℃变性10s，55℃复性10s，72℃延伸45s，30个循环。将pcr产物送至测序公司进行双向测序。[0053]3.特异性引物设计[0054]利用lasergene软件中megalign软件对测序得到的4种小檗皮的its2序列进行分析，找出小檗皮的稳定差异变异位点，采用pirmer permier 5.0软件设计出能够扩增4种小檗皮药材的特异性引物：正向内引如物seq id no.1xbpa-f(5’‑cctaaatgatggcctcga-3’)和反向内引物如seq id no.2xbpa-r(5’‑acaagggtttgtacagct-3’)，引物扩增后片段大小为112bp。同时经过blast发现，小檗属植物的序列相似度极高，本实验设计的引物可能也可以扩增同属的其他多种小檗皮，即也可应用于其他同属小檗皮药材的鉴定。[0055]4.快速核酸扩增反应[0056]快速核酸扩增反应总体系为25μl，包括10×buffer缓冲液2.5μl，10mm dntp 0.5μl，引物各1μl，easytaq 0.5μl，dna 5μl，加灭菌水补足25μl。快速核酸扩增反应条件：95℃预变性30s；95℃变性0s，55℃复性0s，35个循环。[0057]反应结束后取各pcr产物5μl，与1μl 6×dna上样缓冲液混合后点样，在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，200v电压下电泳8min，在凝胶成像仪下观察，向pcr产物中，加入1μl 500×sybr greenι型荧光染料，混匀，在365nm紫外光下观察。[0058]实验例1[0059]特异性和灵敏度检测。[0060]1.试剂盒及方法的特异性检测[0061]利用上述方法对我国使用的4个主流品种匙叶小檗、鲜黄小檗、甘肃小檗、刺红珠以及常见的混淆品黄柏的基因组dna进行凝胶电泳扩增和荧光显色，从而考察鉴别体系的特异性，结果见图1。[0062]小檗皮的4个主流品种在112bp处可以出现清晰明亮的特异性条带，黄柏不出现条带，在荧光分析图中，只有4种小檗皮发出绿色荧光，黄柏不出现荧光。[0063]结果表明小檗皮快速核酸扩增和荧光鉴别体系特异性良好，可以明确区分小檗皮及常见混淆品黄柏。[0064]2.试剂盒及方法的灵敏度检测[0065]将等量的4种小檗皮dna提取液充分混匀，稀释成不同浓度的提取液，利用小檗皮特异性引物分别对质量浓度为1pg/μl～1×104pg/μl的混合小檗皮dna提取液进行快速核酸扩增和荧光检测，如图2所示。[0066]当模板浓度为100pg/μl～1×104pg/μl时，凝胶电泳图中出现清晰条带，荧光分析图中出现绿色荧光，当dna模板浓度达到10pg/μl时，有较暗条带产生，荧光分析图中也出现较浅的绿色荧光。[0067]所以该体系灵敏度高，可以检测10pg/μl的dna模板。[0068]实验例2[0069]本实验例利用实施例1的试剂盒和方法检测待测小檗皮样品。[0070]从市场中收集了16批用于检测的小檗皮样品。对待测小檗皮药材进行dna提取，按照发明试剂盒及方法对其进行检测，确定该方法的适用性。[0071]表2实验待测药材信息[0072][0073][0074]结果如图3，除14号样本外，其余15个样本在电泳图中均出现明显清晰的扩增条带，在荧光分析图中，除14样本外，其余15个样本也出现明显的绿色荧光。将所有样本的基因组dna利用its2通用引物进行扩增，将得到的pcr产物进行测序，测序结果显示14号样本在genbank blast网站上进行比对分析，测序结果与数据库中黄柏序列(mn966484.1)一致，判断14号样本为黄柏样本。其余扩增产物经测序进一步验证无误，确定分别为小檗皮4种主流品种。[0075]所以本试剂盒及方法对待测小檗皮的检测结果符合预期，满足检测要求。[0076]实验例3[0077]本实验例利用实施例1的试剂盒和方法检测藏成药中的小檗皮。[0078]购买3种含有小檗皮的藏成药，提取藏成药的dna，按照发明试剂盒及方法对其进行检测，确定该方法可用于检测藏成药中小檗皮的检测。[0079]表3藏成药材料信息[0080][0081]结果见图4，3种藏成药均可以稳定的扩增出112bp条带，条带明显清晰，在荧光分析图中，可以看出3种藏成药均出现明显的绿色荧光。[0082]说明八味小檗皮胶囊、八味小檗皮散和四味姜黄汤散3种藏成药均含有小檗皮原药材。本发明试剂盒可以对八味小檗皮胶囊、八味小檗皮散和四味姜黄汤散3种藏成药中的小檗皮进行准确快速的鉴别。[0083]综上所述，本发明试剂盒可以准确检测小檗皮4种主流品种，检测快速高效、准确、特异性好，灵敏度高，应用前景广泛。[0084]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。[0085][0086]









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