一种用于对混合体液进行鉴定的复合扩增体系、引物及其试剂盒的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于法医学检测鉴定技术领域，具体涉及一种用于对混合体液进行鉴定的复合扩增体系、引物及其试剂盒。背景技术：2.近十多年来，在法医学领域dna分析技术有助于在罪犯和作案现场之间找到关联证据，缩小嫌犯范围，尽管dna分析方法作为鉴定刑事案件的重要辅助手段已经得到普遍认可，但由于案件形式的多样化，仅靠dna的检验方法已不能满足所有刑事案件的需要。而正确识别现场生物检材的组织来源有助于推断案件的发生过程及现场重建，dna的str分型检测技术可判定常见的生物检材如唾液、血液和精液等的个体来源，但因dna的同一性，依靠现有dna检测试剂盒无法区分来自同一个体的不同体液类型。3.不同组织和体液均含有其独特的蛋白或酶分子。传统的法医物证学主要通过一些酶促反应或免疫学试验检测这些特定蛋白分子，从而筛选和确证各种体液和组织。这些传统鉴定方法通常比较简便、快速，对血痕、精斑等少数体液组织具有较高的特异性和准确性，但亦存在一定局限。首先，部分体液和组织间存在交叉反应，使其特异性降低；其次，传统鉴定方法会对检材造成破坏，且不同组织鉴定方法难以兼容，故需消耗额外的检材，这对量少的生物检材极为不利；再次，因酶蛋白不及dna稳定，致使陈旧或腐败降解检材检测困难。此外，传统方法结果判定大多依赖操作者的水平和经验，增加了人为因素造成误判的风险。4.目前，法医学对组织来源鉴定广泛使用的分子标志主要有信使rna(messenger rna，mrna)、微rna(microrna，mirna)、dna甲基化三种；此外，微生物菌群也可用于体液来源鉴定。因此针对体液斑类型的检测主要有下列几种方法：5.1.微小rna分析法6.微小rna(micrornas，mirnas)是一类内源性的非编码小分子rna，长度范围在16-29nt，平均长度22nt，广泛存在于各种真核细胞中。mirnas通过直接剪切靶mrna，或者通过完全/不完全与靶mrnas3'非翻译区互补结合抑制靶mrna的翻译，从而参与调节细胞生长发育、分化、凋亡、衰老、疾病及肿瘤的发生，被誉为基因表达的“调节器”。现已证实，不同体液和组织间mirnas表达存在差异，致使mirnas成为法医学组织来源鉴定新的分子工具。7.有研究显示，mirnas不仅能抵抗rna酶的降解，而且在加入强酸、强碱或温度极端改变时，其含量和分子结构亦无明显改变，加之mirnas分子很小，因此与采用mrna进行组织/体液鉴定相比，mirnas检测的最大优势是灵敏度和稳定性更高。但应注意的是，mirna的表达是相对表达，其检测依赖rt-pcr，结果难以标准化。8.2.组织差异性甲基化分析法9.大量研究证实，哺乳动物不同组织间存在众多的组织特异性差异甲基化区(tissuespecific differentially methylated regions，tdmrs)，由此赋予各种细胞和组no.1～48所示的引物序列，可同时扩增如下str位点：18.hbb、hba、ppbp、hbd、alas2、ami、prm1、msmb、klk3、semg1、klk2、prm2、htn3、stath、muc7、krt13、krt4、sprr2a、myoz1、hbd1、cyp2b7p、β2-mg、ubc以及pgk；具体位点和扩增引物信息如表1所示：19.表1位点和扩增引物[0020][0021][0022]本发明通过特征标记物的表达趋势和特异性研究，选择的24个位点包含血液的6位点ami、ppbp、alas2、hbd、hbb和hba；精液的6个位点prm1、prm2、msmb、klk3、semg1和klk2；唾液的6个位点htn3、stath、muc7、krt4、krt13和sprr2a；阴道分泌物的3个位点myoz1、hbd1、cyp2b7p；管家基因的3个位点β2-mg、ubc、pgk。这些体液斑位点特异性好，管家基因在各种类型的体液斑中表达稳定。[0023]进一步地，引物对的5’端进行荧光标记，荧光标记分别为fam、hex、tamra和rox。[0024]进一步地，将上述24个位点分为四组，其中，第一组为cyp2b7p、hbd1、myoz1、β2-mg、ubc和pgk，扩增cyp2b7p、hbd1、myoz1、β2-mg、ubc和pgk位点的引物对的荧光标记为fam；[0025]第二组为htn3、stath、muc7、krt4、krt13和sprr2a，扩增htn3、stath、muc7、krt4、krt13和sprr2a位点的引物对的荧光标记为hex；[0026]第三组为prm1、prm2、msmb、klk3、semg1和klk2，扩增prm1、prm2、msmb、klk3、semg1和klk2位点的引物对的荧光标记为tamra；[0027]第四组为ami、ppbp、alas2、hbd、hbb和hba，扩增ami、ppbp、alas2、hbd、hbb和hba位点的引物对的荧光标记为rox。[0028]进一步地，混合体液包括血液、唾液、精液和阴道分泌物中的至少一种。[0029]一种用于扩增上述复合扩增体系的引物组合，引物组合包括如seq id no.1～48所示的序列。[0030]本发明采用四色荧光标记系统，将上述的24个基因座分组并进行荧光标记：fam标记myoz1、hbd1、cyp2b7p、β2-mg、ubc和pgk；hex标记htn3、stath、muc7、krt4、krt13和sprr2a；tamra标记prm1、prm2、msmb、klk3、semg1和klk2；r0x标记ami、ppbp、alas2、hbd、hbb和hba。[0031]同时，在设计mrna引物时，要求引物其中一条至少跨越一个外显子-外显子连接区，以确保引物不会和dna结合，确保mrna产物的特异性。根据筛选位点产物长度构建复合体系，要求不同荧光修饰的位点互相间隔，保证位点间不会互相影响。将所有引物混合进行复合扩增实验，确定无非特异扩增的现象。同时本发明的检测组分中标准物采用orange标记，能够很明确的标记区分出各个位点扩增产物的大小。[0032]一种用于对混合体液进行鉴定的试剂盒，试剂盒包括权利要求5所述的引物组合。[0033]进一步地，还包括缓冲液、模板cdna和taq dna聚合酶。[0034]进一步地，pcr缓冲液成分包括：l0mm的硫酸铵，10mm的氯化钾，50mm的ph8.3的tris-hcl，2mm的镁离子和0.2mm的dntp，taq dna聚合酶用量为2u。[0035]进一步地，扩增体系扩增时的反应条件为：[0036]第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性20秒，第3步59℃退火90秒，第4步：60℃延伸60分钟，重复2至3步28次，最后15℃延伸。[0037]一种对混合体液中str位点进行分析鉴定的方法，采用上述复合扩增系统，或引物组合，或试剂盒检测dna即可。[0038]上述复合扩增系统、引物组合或试剂盒在个体识别、亲权鉴定、群体遗传学分析和/或构建人类dna数据库以及体液鉴定中的用途。[0039]本发明的有益效果：[0040]1、含有24个mrna，涵盖四种体液斑的常见特异标记物和管家基因。信息量大，兼容性好。[0041]2、模板适应范围广，适用于涉及四种体液斑(血液、精液、唾液、阴道分泌物)细胞的物证案件中的法医cdna分析。[0042]3、系统特异性和稳定性好，经过反复验证多次，无非特异扩增产物产生，信号强度稳定。[0043]4、灵敏度高，最低检测限可达0.1ng，通过0.1ng的cdna模板量可以准确判断体液斑类型。附图说明[0044]图1为血液提取cdna扩增图；[0045]图2为精斑提取cdna扩增图；[0046]图3为唾液提取cdna扩增图；[0047]图4为阴道分泌物提取cdna扩增图；[0048]图5为唾液和阴道分泌物1:1混合样本提取cdna扩增图；[0049]图6为血液和精液1:1混合样本提取cdna扩增图；[0050]图7为血液和唾液1:25混合样本提取cdna扩增图；[0051]图8为血液和阴道分泌物1:25混合样本提取cdna扩增图；[0052]图9为精液和唾液1:25混合样本提取cdna扩增图；[0053]图10为精液和阴道分泌物1:25样本提取cdna扩增图；[0054]图11为血液样本提取的0.1ng rna逆转录扩增图；[0055]图12为精液样本提取的0.1ng rna逆转录扩增图；[0056]图13为唾液样本提取的50ng rna逆转录扩增图；[0057]图14为阴道分泌物样本提取的10ng rna逆转录扩增图；[0058]图15为真实案件样本提取cdna扩增图；[0059]图16为真实案件样本提取cdna扩增图。具体实施方式[0060]下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。[0061]实施例1str位点筛选[0062]不同组织间因生理功能差异，其蛋白表达谱亦各不相同，这是利用mrna进行体液/组织鉴定的理论基础。目前大量研究已证实，不同体液或组织均有其特异表达的mrna基因。例如，血液特异性基因sptb、pbgd、glycoa、hba、hbb和alas2等；唾液特异性基因stath和htn3；精液特异性基因prm1和klk3及semg1等；月经血特异性基因mmp7、10和11；皮肤组织基因cdsn、lor、krt9以及阴道分泌物的hbd1、muc4、muc7等。[0063]经大量的文献查询和实验测试最终确定选择出表达量高，特异性好的特征标记物及在各个体液类型中表达稳定的管家基因作为复合扩增体系的位点，包含血液的6位点ami、ppbp、alas2、hbd、hbb和hba；精液的6个位点prm1、prm2、msmb、klk3、semg1和klk2；唾液的6个位点htn3、stath、muc7、krt4、krt13和sprr2a；阴道分泌物的3个位点myoz1、hbd1和cyp2b7p；管家基因的3个位点β2-mg、ubc和pgk。[0064]由此，组合形成了在一个pcr反应体系中扩增24个特异标记物位点。所采用的位点为ami、hbb、hba、ppbp、hbd、alas2、prm1、msmb、klk3、semg1、klk2、prm2、htn3、stath、muc7、krt13、krt4、sprr2a、myoz1、hbd1、cyp2b7p、β2-mg、ubc和pgk。[0065]实施例2引物设计[0066]引物采用primer5和ncbi blast等软件设计而成，设计引物时应尽量确保各引物的tm值在(60±3)℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差10bp以上。设计完成后，用autodimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或者二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。[0067]选用人源体液斑cdna模板，分别用上述24对引物进行单重扩增，将扩增产物置于2.0％的琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果来调整pcr体系及扩增条件以得到24对引物共同的扩增条件。最终期望得到在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带。设计得到的引物序列如seq id no.1～48所示。[0068]实施例3单独检测不同类型体液斑样本[0069]1、单独四种体液斑检测(四种样本来源于公安部物证鉴定中心)[0070]2、rna提取及cdna合成[0071]采用trizol法提取四种体液斑总rna，rna提取完成后，用revertaid first strand cdna synthesis kit(thermo fisher scientific)逆转录试剂盒对总rna进行反转录合成cdna。[0072]3、反应体系：[0073]将各反应试剂(buffer、primer mix、dntp等)振荡混合后按表体积比(模板除外)配成pcr反应混合液，分装9μl于pcr反应管中，最后往各反应管加入1μl模板，离心后进入下一步。反应体系组成见表2。[0074]表2标准扩增反应体系[0075]组分名称体积(μl)无菌去离子水32.5×反应缓冲液4引物混合物2模板cdna1总体积10μl[0076]4、pcr反应程序：[0077]将pcr反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：[0078]第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性20秒，第3步59℃退火90秒，第4步：60℃延伸60分钟，重复2至3步28次，最后15℃延伸。运行结束后将产物置于冰箱4℃保存。[0079]5、毛细管电泳检测[0080]将qd550内标和甲酰胺按比例2.5：100混合，取9μl混合物加到96孔板里，再加入扩增产物样品1μl，混合静置数分钟，离心后放入遗传分析仪3130上，准备检测。[0081]6、数据分析[0082]导入原始数据，在主页面的file菜单选择add sample to project，找到样品文件，选中文件夹，点击add to list，点击add，样品文件即显示在project窗口：选择分析参数。定义analysis method、panel和size standard.。浏览样本电泳的原始数据，任性一样本文件名，在“sample"菜单下选择“raw data”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧(第一个红色的内标峰之前)，以此时窗口左下角x轴上显示的数值作为analysis method分析参数中的起始点；点击绿色分析按钮，出现save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。采用genemapper软件分析得到的数据并生成图谱。[0083]7、实验结果[0084]图1为血液样本扩增，可以检测到血液的6个特征标记物ami、ppbp、alas2、hbd、hbb、hba和管家基因β2-mg；图2为唾液样本扩增，可以检测到唾液的6个特征标记物htn3、stath、muc7、krt4、krt13、sprr2a和管家基因β2-mg；图3为精液样本扩增，可以检测到精液的6个特征标记物prm1、prm2、msmb、klk3、semg1、klk2和管家基因β2-mg、ubc、pgk；图4为阴道分泌液样本扩增，可以检测到阴道分泌液的2特征标记物hbd1、cyp2b7p和管家基因β2-mg、ubc、pgk。[0085]根据图1～4的检测结果可知，本技术设计的引物对来源于单独的四种体液斑类型的样本cdna均能进行良好扩增，检测到对应的特征标记物和管家基因。表明本技术设计的引物具有良好的特异性和准确性。[0086]实施例4检测混合体液斑[0087]1、混合体液斑样本由公安部物证鉴定中心的体液斑样本混合获得[0088]2、体液斑混合样本制备[0089]将公安部物证鉴定中心的体液斑样本按照特定比例混合后即可获得不同类型的体液斑混合样本，具体包括：唾液和阴道分泌物1:1混合样本、血液和精液1:1混合样本、血液和唾液1:25混合样本、血液和阴道分泌物1:25混合样本、精液和唾液1:25混合样本以及精液和阴道分泌物1:25样本。[0090]3、反应体系：[0091]将各反应试剂(buffer、primer mix、dntp等)振荡混合后按表体积比(模板除外)配成pcr反应混合液，分装9μl于pcr反应管中，最后往各反应管加入1μl模板，离心后进入下一步。反应体系组成见表2。[0092]4、pcr反应程序：[0093]将pcr反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：[0094]第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性20秒，第3步59℃退火90秒，第4步：60℃延伸60分钟，重复2至3步28次，最后15℃延伸。运行结束后将产物置于冰箱4℃保存。[0095]5、毛细管电泳检测[0096]将qd550内标和甲酰胺按比例2.5：100混合，取9μl混合物加到96孔板里，再加入扩增产物样品1μl，混合静置数分钟，离心后放入遗传分析仪3130上，准备检测。[0097]6、数据分析[0098]导入原始数据，在主页面的file菜单选择add sample to project，找到样品文件，选中文件夹，点击add to list，点击add，样品文件即显示在project窗口：选择分析参数。定义analysis method、panel和size standard.。浏览样本电泳的原始数据，任性一样引物混合物 2 模板cdna 1 总体积 10μl [0115]3、pcr反应程序[0116]将pcr反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：[0117]第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性20秒，第3步59℃退火90秒，第4步：60℃延伸60分钟，重复2至3步28次，最后15℃延伸。运行结束后将产物置于冰箱4℃保存。[0118]4、毛细管电泳检测[0119]将qd550内标和甲酰胺按比例2.5：100混合，取9μl混合物加到96孔板里，再加入扩增产物样品1μl，混合静置数分钟，离心后放入遗传分析仪3130上，准备检测。[0120]5、数据分析[0121]导入原始数据，在主页面的file菜单选择add sample to project，找到样品文件，选中文件夹，点击add to list，点击add，样品文件即显示在project窗口：选择分析参数。定义analysis method、panel和size standard.。浏览样本电泳的原始数据，任性一样本文件名，在“sample"菜单下选择“raw data”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧(第一个红色的内标峰之前)，以此时窗口左下角x轴上显示的数值作为analysis method分析参数中的起始点；点击绿色分析按钮，出现save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。采用genemapper软件分析得到的数据并生成图谱。[0122]图11为血液样本提取的0.1ng rna逆转录扩增图；图12为精液样本提取的0.1ng rna逆转录扩增图；图13为唾液样本提取的50ng rna逆转录扩增图；图14为阴道分泌物样本提取的10ng rna逆转录扩增图。根据图11～14所记载的检测结果可知，本技术基于所设计的检测引物构建的检测体系的最低检测限可低至0.1ng。[0123]实施例5真实未知样本检测[0124]1、案件样本检测(案件样本来源于公安部物证鉴定中心)。[0125]2、rna提取和cdna合成[0126]采用trizol法提取混合体液斑总rna，rna提取完成后，用revertaid first strand cdna synthesis kit(thermo fisher scientific)逆转录试剂盒对总rna进行反转录合成cdna。[0127]3、反应体系：[0128]将各反应试剂(buffer、primer mix、dntp等)振荡混合后按表体积比(模板除外)配成pcr反应混合液，分装9μl于pcr反应管中，最后往各反应管加入1μl模板，离心后进入下一步。反应体系组成见表2。[0129]4、pcr反应程序：[0130]将pcr反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：[0131]第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性20秒，第3步59℃退火90秒，第4步：60℃延伸60分钟，重复2至3步28次，最后15℃延伸。运行结束后将产物置于冰箱4℃保存。[0132]5、毛细管电泳检测[0133]将qd550内标和甲酰胺按比例2.5：100混合，取9μl混合物加到96孔板里，再加入扩增产物样品1μl，混合静置数分钟，离心后放入遗传分析仪3130上，准备检测。[0134]6、数据分析[0135]导入原始数据，在主页面的file菜单选择add sample to project，找到样品文件，选中文件夹，点击add to list，点击add，样品文件即显示在project窗口：选择分析参数。定义analysis method、panel和size standard.。浏览样本电泳的原始数据，任性一样本文件名，在“sample"菜单下选择“raw data”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧(第一个红色的内标峰之前)，以此时窗口左下角x轴上显示的数值作为analysis method分析参数中的起始点；点击绿色分析按钮，出现save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。采用genemapper软件分析得到的数据并生成图谱。[0136]7、实验结果[0137]图15可以检测到阴道分泌物的特征标记物hbd1，血液的特征标记物ppbp、alas2、hbd、hbb、hba，管家基因β2-mg、ubc、pgk，判断该样本为阴道分泌物和血液的混合物。图16检测到唾液的特征标记物krt4、krt13、sprr2a，管家基因β2-mg，判断该样本为唾液。[0138]根据图15和图16所示的检测结果，表明本技术所设计的扩增体系可用于检测未知体液中的具体组成，可用于检测真实案件样本，并根据结果显示的体液斑对应特征标记物可以确认样本类型。[0139]最后应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。









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