一种改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术一种改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用技术领域1.本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用。背景技术：2.d-阿洛酮糖，属于d-果糖的碳-3同分异构体，是一种稀有糖。与常规的单糖相比，它是一种能量很低的单糖，因此在食品工业中通常用作可口的甜味剂或膳食补充剂。d-阿洛酮糖还具有抗氧化、降血糖、降血脂等活性，在工业领域具有广阔的应用前景。目前采用化学合成法生产d-阿洛酮糖难度较大。因为d-阿洛酮糖只存在于自然界中的少数水果中，因此很难提取，常用的生产方式是通过生物转化工艺法生产d-阿洛酮糖，利用一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶(d-tagatose3-epimerase，dtease)催化d-果糖的转化成d-阿洛酮糖[1.hossain,akram et al.“rare sugar d-allulose:potential role and therapeutic monitoring in maintaining obesity and type 2diabetes mellitus.”pharmacology&therapeutics vol.155(2015):49-59.]。然而，由于一些d-阿洛酮糖3-差向异构酶稳定性相对有限，其中大多数不适合工业应用，因此寻找热稳定好的dtease对于d-阿洛酮糖的工业生产非常重要。[0003]来源于解纤维素梭菌的dtease酶是在2011年发现的一种新的dtease，该酶同样具有将d-果糖的转化成d-阿洛酮糖的功能，且与之前物种来源的dtease相比，具有更好的热稳定性，可以在55℃的情况下，发挥活性且半衰期长，因此在d-阿洛酮糖的工业生产上具有广阔的应用前景[2.chan,hsiu-chien et al.“crystal structures of d-psicose3-epimerase from clostridium cellulolyticum h10 and its complex with ketohexose sugars.”protein&cell vol.3,2(2012):123-31.]。技术实现要素：[0004]本发明的目的在于提供了一种改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用，该改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶相比较野生型的dtease酶具有更高热稳定性和纯化产量。[0005]本发明通过以下技术方案来实现上述目的：[0006]本发明提供了一种改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶，该改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶由dtease序列和c端融合的多聚精氨酸标签构成。[0007]进一步改进在于，所述多聚精氨酸标签的多肽序列为rrrrr，改造的dtease酶命名为dtease-5r。[0008]进一步改进在于，所述改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。[0009]本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶。[0010]进一步改进在于，所述多核苷酸的序列如seq id no.2所示。[0011]本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒为含有上述多核苷酸且能够翻译表达出上述改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达载体。[0012]进一步改进在于，所述表达载体为pet-28a载体。[0013]本发明还提供了一种重组工程菌，所述重组工程菌包含上述重组质粒。[0014]进一步改进在于，所述工程菌为大肠杆菌bl21(de3)。[0015]本发明还提供了一种上述改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶在生产d-阿洛酮糖中的应用。[0016]进一步改进在于，利用生物转化工艺法生产d-阿洛酮糖，利用所述改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶催化d-果糖转化成d-阿洛酮糖。[0017]本发明还提供了一种提高dtease纯化产量和热稳定的方法，在野生型dtease的c端融合多聚精氨酸标签。[0018]进一步改进在于，所述野生型dtease来源于解纤维素梭菌。[0019]本发明具有如下有益效果：[0020]本发明提供了一种通过在dtease的c端添加了额外的5个精氨酸，优化改造了原始的dtease的序列，序列改造后明显提高了dtease的产量，产量提高高达5.5倍，这大幅度地降低了生产dtease的成本；其次，序列改造后还提高了dtease的tm值，提高了7摄氏度，大幅度提高了dtease的热稳定性。之前的研究报道已经指出dtease在55℃的情况下，发挥活性且半衰期长，我们通过将dtease的序列优化后，将其tm值提高到了63.5℃，说明改造后的dtease酶在工业生产d-阿洛酮糖的过程中更加耐热，其半衰期也会延长，提高了生产d-阿洛酮糖的效率。附图说明[0021]图1为野生型及改造后dtease蛋白小量表达测试图；[0022]图2为野生型及改造后dtease-5r酶纯化结果图；[0023]图3为改造后改造后dtease-7r和改造后dtease-9r酶纯化结果图[0024]图4为野生型及改造后dtease酶tm值测定图。具体实施方式[0025]下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。[0026]1、材料[0027]本实验所用所有试剂如无特殊说明均为常规试剂，均使用去离子水配制，所使用到的仪器均为实验室常规仪器。[0028]2、方法[0029]2.1野生型及改造后dtease蛋白表达[0030]将野生型dtease(dtease，氨基酸蛋白序列见seq id no.3)和改造后的dtease(dtease-5r)、dtease-7r(氨基酸蛋白序列见seq id no.4)、dtease-9r(氨基酸蛋白序列见seq id no.5)重组质粒(表达载体为pet-28a载体)按照常规分子生物学手段分别转化bl21(de3)大肠杆菌感受态细胞，dtease-5r的氨基酸序列如seq id no.1所示，编码上述dtease-5r的多核苷酸的序列如seq id no.2所示。[0031]挑取单克隆菌斑至5mllb液体培养基中，37℃过夜培养，37℃培养至菌液od600为0.6-0.8时加入0.5mmiptg15℃培养过夜，5000rpm离心收集菌体。用裂解缓冲液50mmtris-hcl(ph7.5),250mmnacl将菌体吹匀后，使用超声破碎仪裂解细胞，裂解后的细胞16000rpm高速离心收集上清，分别取上清和沉淀样品进行sds-page检测，检测结果见图1。根据结果可知dtease-5r、dtease-7r、dtease-9r与dtease在大肠杆菌中均能表达，但dtease-5r表达量比dtease、dtease-7r、dtease-9r更高。[0032]2.2野生型及改造后dtease蛋白纯化及产量比较[0033]为了比较dtease-5r、dtease-7r、dtease-9r和dtease在大肠杆菌中的产量，将四种酶均在1l的bl21菌株中进行表达：将明显表达的菌株接中至50mllb液体培养基中37℃培养过夜，将过夜培养的细菌按1:100的比例接至1llb液体培养基中，37℃培养至菌液od600为0.6-0.8时加入0.5mmiptg15℃培养过夜，5000rpm离心收集菌体。将收集的菌块进行称重，按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(50mmtris-hcl(ph7.5),500mmnacl,5％甘油)，使用高压均质机破碎菌体，16000rpm高速离心收集上清。使用亲和层析hisff富集纯化蛋白，纯化前先用裂解buffer平衡hisff柱，将所有细胞上清挂柱后，用不同梯度的咪唑溶液洗脱，收集不同梯度咪唑洗脱下的蛋白进行sds-page检测，收集纯度较好的蛋白用nanodrop测定蛋白浓度，计算蛋白产量。[0034]根据sds-page结果可知，通过亲和纯化获得了纯度较高的dtease酶、dtease-5r酶、dtease-7r酶和dtease-9r酶。根据nanodrop测定的蛋白浓度计算得到的dtease酶的产量为6.47mg/l，如图2中左图所示，dtease-5r酶的产量为35.5mg/l，如图2中右图所示，dtease-7r酶的产量为20.85mg/l，如图3中左图所示，dtease-9r酶的产量为24.35mg/l，如图3中右图所示。本实施例表明，dtease-5r的产量比常用tev酶产量提高了5.5倍，且与dtease-7r酶和dtease-9r酶相比，dtease-5r的纯度得到了明显的提高。[0035]2.3野生型及改造后dtease酶热稳定性比较[0036]使用微量差示扫描荧光技术(nanodsf)检测蛋白的tm值，具体实验操作如下：[0037]取20μl浓度为0.5mg/ml的dtease酶、dtease-5r酶、dtease-7r酶和dtease-9r酶分别加到384孔实验板中，震荡离心后，将实验板置于取样架上，使用nanodsf毛细管吸样，保证样品充满整个毛细管。将毛细管放入nanodsf仪器中，设置初始温度为20℃，以每分钟升温2.0℃的速度最终上升到90℃终止。仪器将会依照设置好的参数进行升温和实时检测。[0038]tm值测试的结果如图4所示，根据测试的结果可知，dtease酶的tm值为56.5℃，与背景技术中文献报道的55℃接近。dtease-5r酶的tm值为63.4℃，dtease-7r酶的tm值为58.8℃，dtease-9r酶的tm值为59.1℃，其中dtease-5r酶的tm值最高，比dtease酶高7℃。说明本发明提供的dtease-5r酶比原始的dtease具有更高的热稳定性，因此具有更好的应用场景。[0039]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。









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