三个多肽及其在制备Ⅰ型糖尿病免疫防治疫苗或药物中的应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术三个多肽及其在制备ⅰ型糖尿病免疫防治疫苗或药物中的应用技术领域1.本发明属于免疫识别和治疗技术领域，涉及三个多肽及其在制备ⅰ型糖尿病免疫防治疫苗或药物中的应用。背景技术：[0002]ⅰ型糖尿病(t1d)是一种器官特异性自身免疫性疾病，主要由抗原特异性t细胞攻击破坏胰岛β细胞，导致胰岛素合成绝对不足所致。t1d的发病率逐年递增，发病年龄呈现年轻化，并发症很多，致使儿童及青少年致残甚至早亡，目前尚无治愈方法。近年来研究表明自身反应性cd8+t细胞是参与t1d启动和发展的关键因素。自身反应性cd8+t细胞依赖其t细胞抗原受体(tcr)特异性识别胰岛β细胞表面主要组织相容性复合体i(mhc‑ⅰ)类分子提呈的自身抗原肽而活化，直接破环β细胞。然而早期驱动自身反应性cd8+t细胞活化的自身抗原谱尚未完全解析。所有的有核细胞均表达mhc‑ⅰ类分子，与mhc‑ⅰ类分子结合的所有肽的总和称为mhc‑ⅰ类分子相关肽组(mips)。mips具有高度的复杂性和可塑性，很多因素都可以重塑mips，产生的mhc‑ⅰ类分子相关抗原肽可能成为cd8+t细胞识别及应答的主要靶标。[0003]内质网的主要功能是负责新合成蛋白的转录后修饰，折叠和组装。各种体内外因素都可以干扰内质网的正常功能，引起未折叠蛋白在内质网内大量聚集，激活未折叠蛋白反应，称为内质网应激(ers)。β细胞是内分泌性细胞，拥有非常丰富的内质网系统来折叠，加工新合成的胰岛素，因此对于ers异常敏感。近年来的研究表明：ers是早期t1d发病的重要病理机制。多种环境因素，包括细胞因子，病毒感染，高血糖等均可以诱导β细胞内发生ers，产生系列新生抗原肽，与β细胞内mhc-i类分子结合并呈递至细胞表面被自身反应性cd8+ t细胞识别为“非我”而加以应答，攻击胰岛β细胞，启动胰岛炎及t1d的发生。[0004]引起ers的因素很多，如营养过剩、高血糖，病毒感染、炎症，化学诱导剂等。现代人生活中糖的摄入量普遍增高，各种甜品，含糖饮料为大众所喜欢，尤其是青少年和儿童糖的摄入量更高，有流行病学调查显示，高糖的摄入可以增加儿童易感人群t1d的发病率，但目前仍缺乏充足的实验室证据。因此我们推测高糖的摄入使胰岛素的需求量大大增加，增加胰岛β细胞的负担，诱导病理性ers的发生，产生新的抗原肽参与t1d的发病。对ers诱导的抗原肽及cd8+t细胞免疫识别及活化机制的研究，有助于从全新角度深入理解t1d的发病机制，并可能发现全新的免疫治疗靶点。技术实现要素：[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供三个多肽及其在制备ⅰ型糖尿病免疫防治疫苗或药物中的应用。[0006]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：[0007]1、三个多肽，即多肽syt12291-299、otub258-66或slc35b126-34，它们的氨基酸序列分别如seq id no.1～3所示。[0008]syt12291-299：sylptaerl，如seq id no.1所示；[0009]otub258-66：sylesllgk，如seq id no.2所示；[0010]slc35b126-34：yygilqeki，如seq id no.3所示。[0011]2、前述三个多肽在制备ⅰ型糖尿病免疫防治疫苗或药物中的应用。[0012]3、一种ⅰ型糖尿病免疫防治疫苗或药物，其有效成分为前述三个多肽，即多肽 syt12291-299、otub258-66或slc35b126-34，它们的氨基酸序列分别如seq id no.1～3所示。[0013]本发明的有益效果在于：[0014]本发明利用高糖(hg)和经典ers诱导剂毒胡萝卜素(tg)诱导胰岛β细胞系nit-1 产生ers，高分辨率高通量质谱分析技术鉴定ers态和稳态nit-1细胞mips，生物信息学技术分析比对其差异，选取ers态nit-1细胞特有或表达上调的肽作为候选肽，利用t1d 的模型小鼠nod小鼠，通过一系列体内外生物学实验对候选肽进行筛选，得到三个有良好免疫原性的肽syt12291-299，otub258-66和slc35b126-34。这三个多肽可以被nod小鼠体内 cd8+t细胞识别，可能作为免疫防治t1d的潜在靶标。[0015]1、多肽syt12291-299，otub258-66和slc35b126-34可以特异性刺激nod小鼠脾cd8+t 细胞活化，增殖，产生ifn-γ。[0016]2、多肽syt12291-299，otub258-66和slc35b126-34可作为参与i型糖尿病致病因素中的 cd8+t细胞识别的靶点的应用。[0017]3、多肽syt12291-299，otub258-66和slc35b126-34可作为t1d治疗性肽疫苗核心成分，用于t1d的抗原特异性免疫治疗。[0018]本发明筛选到的三条抗原肽通过特异性激活cd8+t细胞，参与胰岛炎和t1d的发生，进一步研究发现，通过诱导非肥胖糖尿病(nod)小鼠体内肽特异性cd8+t细胞活化，参与t1d的发生发展，通过诱导肽特异性免疫耐受可以降低nod小鼠t1d的发病率，延长 nod小鼠的生存时间，初步显示了该目标肽在t1d的免疫学防治中的意义，具有很好的潜在的临床意义和巨大的社会效益，一旦应用于临床，将大大改善t1d患者的预后。[0019]本发明利用高分辨率高通量质谱分析技术鉴定了胰岛β细胞在稳态和内质网应激(ers) 状态下mhc‑ⅰ类分子相关肽组(mips)的变化，揭示ers可重塑胰岛β细胞mips，产生一些新的自身抗原肽例如syt12291-299，otub258-66，slc35b126-34成为早期驱动cd8+t细胞激活的关键因素，这些具有良好免疫原性的自身抗原肽可能成为人工免疫防治t1d的新靶标。附图说明[0020]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。[0021]图1hg和tg处理增强了nit-1细胞刺激小鼠脾细胞产生ifn-γ的能力，其中a为hg 处理组elispot斑点代表图，b为hg组斑点数量统计图，c为hg组抗h-2抗体阻断后斑点数量统计图；d为tg处理组elispot斑点代表图，e为tg组斑点数量统计图，f为tg 组抗h-2抗体阻断后斑点数量统计图。[0022]图2hg和tg诱导nit-1细胞ers marker表达升高，其中a为qpcr检测nit-1细胞撤离hg 0-24h ers标志物的变化，b为qpcr检测nit-1细胞撤离tg 0-24h ers标志物的变化，c为wb检测nit-1细胞撤离tg 0-12h和撤离hg 0-24h ers标志物的变化。[0023]图3nit-1细胞来源的mips的鉴定，其中a为mhc i分子靶向肽数据库的建立，b为 nit-1细胞来源的mips鉴定的实验流程，c为鉴定到的nc组，hg组和tg组nit-1细胞 mips中肽及其来源蛋白的数量，d为鉴定到的nc组，hg组和tg组nit-1细胞mips中肽的长度分布，e为鉴定到的nc组，hg组和tg组nit-1细胞mips中肽的亲和力分布， f为鉴定到的nc组，hg组和tg组高亲和力肽的锚定基序的测定。[0024]图4hg和tg处理重塑了nit-1细胞mips，产生自身抗原肽，其中a为hg组和nc组 nit-1细胞mips肽(左)和肽的来源蛋白(右)比较，b为tg组和nc组nit-1细胞mips 肽(左)和肽的来源蛋白(右)比较，c为hg组和tg组特有蛋白(左)和表达上调蛋白 (右)比较。[0025]图5间接elispot法筛选候选肽，其中a为各候选肽刺激nod小鼠脾细胞产生ifn‑ꢀγelispot斑点的代表图，b为ifn-γelispot斑点数量统计图。[0026]图6肽特异性cd8+t细胞的增殖实验，其中a为肽syt12291-299和otub258-66刺激nod 小鼠脾细胞增殖的流式代表图，b为增殖率统计图，c为肽slc35b126-34刺激nod小鼠脾细胞增殖的流式代表图，d为增殖率统计图。[0027]图7人工合成肽和nit-1mips来源肽的二级质谱图的比较，其中a为肽syt12291-299， b为otub258-66，c为slc35b126-34。[0028]图8肽特异性免疫干预措施对nod小鼠生存率的影响，其中a为肽syt12291-299特异性免疫干预组小鼠和对照组小鼠生存曲线比较，b为肽otub258-66特异性免疫干预组小鼠和对照组小鼠生存曲线比较。具体实施方式[0029]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。[0030]实施例：[0031]1.nod小鼠β细胞系nit-1细胞ers模型建立及鉴定[0032]用不同浓度的hg和tg刺激nit-1细胞后，和nod小鼠脾细胞共同孵育，elispot 法检测ifn-γ的产生，可以看出hg和tg处理的nit-1细胞刺激小鼠脾细胞产生ifn-γ的能力显著提高，这一效应还可以被mhc-i分子在特异性抗体所阻断，说明其作用是特异性的(图 1)，qpcr和wb从rna和蛋白两个水平检测ers标记物，发现其标记物显著升高(图2) 说明hg和tg刺激nit-1细胞成功建立nit-1细胞的ers模型。[0033]2.稳态和ers态nit-1细胞mips的鉴定[0034]分别收集5×108个稳态和ers态nit-1细胞，溶解在20ml含完全蛋白酶抑制剂的冰冷的蛋白裂解缓冲液中(包含50mm tris ph 8.0，150mm nacl，和体积百分数1％的3-(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基-1-丙磺酸(chaps)，裂解液经过3次离心，收集上清。hitrapnhs-activated hp(ge healthcare)偶联上anti-h2抗体(bio x cell公司)，蛋白裂解液4℃环境下过柱子，循环过夜，亲和柱子依次用下列缓冲液清洗：50mm tris(ph 8.0)，150mm nacl，和体积百分数1％的chaps，50mm tris-hcl(ph 8.0)，150mm nacl，5mm edta；50mmtris-hcl(ph 8.0)，150mm nacl；50mm tris-hcl(ph 8.0)，450mm nacl；50mm tris-hcl(ph 8.0)，得到mhc i-肽复合物。随后mhc i-肽组复合物用4ml 10％的乙酸水溶液洗脱，过3kda 超滤管分离mhc i和肽复合物，分离出来的肽溶液真空冻干，送景杰有限公司做液质联用质谱分析。[0035]从nc组，hg组和tg组分别得到214，219和314个h-2kd限制性的肽，以及198， 203和292个肽来源蛋白蛋白，肽的长度主要以9肽为主，大多数肽为高亲和力的肽，高亲和力的肽显示出mhc-1类分子典型的锚定基序，即p2和p9上的主要锚定残基分别为酪氨酸和亮氨酸，这些都符合小鼠mhc i限制性肽的特征(图3)。[0036]3、ers态nit-1细胞产生的新生抗原肽筛选[0037]生物学信息分析方法比对ers态和稳态nit-1细胞misp的差异，选取hg和tg两种刺激因素都能诱导的ers态特有的20条肽和表达上调的7条肽作为研究对象(图4)，人工合成的这27条肽(杭州中肽生化有限公司)，体外刺激nod小鼠脾细胞，间接elisop法筛选具有免疫原性的肽，结果得到三条目标肽syt12291-299，otub258-66，slc35b126-34能有效刺激nod小鼠脾细胞产生ifn-γ(图5)，肽的信息见表1。细胞增殖实验结果进一步证明该目标肽还能有效刺激nod小鼠体内肽特异性的cd8+t细胞增殖(图6)[0038]表1.三条目标肽信息[0039][0040]4、合成肽二级质谱图与原始肽组中相应肽段二级质谱对比[0041]将nit-1细胞mip中检测到的目标肽syt12291-299，otub258-66，slc35b126-34二级质谱图和在杭州中肽生化有限公司合成的syt12291-299，otub258-66，slc35b126-34肽二级质谱图做对比，发现质谱峰图几乎一致(图7)，证实质谱鉴定结果的可靠性。[0042]5、目标肽诱导的免疫耐受对nod小鼠的保护作用[0043]nod小鼠自3周龄开始用糖水饲喂到6周龄，随机分为3组，分别为syt12291-299组(30μg syt12291-299+30μg poly ic)，otub258-66组(30μg otub258-66+30μg poly ic)和nc组(30μg poly ic)，每组14只。将肽+poly ic或polyic溶入100μl ph＝7.0的pbs中，充分混匀，给nod小鼠背部皮下注射，每周一次，共注射三次，注射完后继续糖水饲喂至25周，自第 12周开始每周测随机血糖，称重，记录各组小鼠发病时间，观察生存曲线。结果发现 syt12291-299组和otub258-66组小鼠t1d的发病率比nc组显著降低，小鼠生存时间显著延长(图8)，说明诱导肽特异性的免疫耐受对nod小鼠有保护作用。[0044]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。









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