一种用于肿瘤原位合成黑色素的工程化细菌及其应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于肿瘤原位合成黑色素的工程化细菌及其应用。背景技术：2.癌症作为目前严重威胁人类生命健康的重大疾病之一，是无数临床和基础研究者难以攻克的难题。由于大部分实体瘤有着乏氧、胞外基质致密、血管异常紊乱、淋巴回流缺失等特点，且肿瘤异质性以及肿瘤组织免疫抑制微环境，均加大了对肿瘤治疗方法的开发难度。研究人员认识到传统化学疗法、放射疗法的毒副作用过强及疗效受肿瘤细胞敏感性限制等问题，迫切需要寻求更加安全有效的肿瘤治疗方法，肿瘤细菌疗法因此进入研究者们的视野。3.肿瘤细菌疗法是研究者们基于细菌可优先在实体瘤中蓄积和增殖这一特性开发出来的一种肿瘤治疗策略，通过表面修饰或基因工程化等手段将细菌改造为低毒性的肿瘤靶向载体，用于递送各种抗肿瘤药物，从而达到靶向抗肿瘤的效果。尽管将细菌作为肿瘤靶向载体来递送药物能够提高抗肿瘤药物的靶向蓄积，在一定程度上增加了肿瘤部位的药物浓度，但载药细菌在肿瘤组织中增殖的同时无法实现所负载药物的增多，随着细菌被机体免疫系统清除，药物也逐渐流失。为解决这一问题，研究者们利用合成生物学技术来定制基因表达产物，设计工程化细菌表达细胞毒性蛋白或免疫调节因子等药物来抑制肿瘤，并通过外部诱导剂来控制表达，使细菌在肿瘤深部乏氧区域增殖的同时不断表达治疗分子，实现肿瘤局部的药物放大，进一步增强治疗效果。4.但是大多数细菌疗法都在临床试验阶段遭遇困难，单一的细菌治疗效果不佳，难以达到有效性和安全性的平衡。技术实现要素：5.针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于肿瘤原位合成黑色素的工程化细菌及其应用，旨在解决单一细菌治疗疗效及安全性低的问题。6.为实现上述目的，本发明提供了一种用于肿瘤原位合成黑色素的工程化细菌，所述工程化细菌是将包含编码酪氨酸酶的基因的温控型表达载体转化到细菌中得到，所述细菌为进入生物体内后能够在肿瘤微环境中蓄积和增殖的细菌，所述工程化细菌能够在肿瘤原位实现黑色素的可控合成。7.优选地，所述编码酪氨酸酶的基因经过密码子优化，其核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示。8.优选地，所述细菌为大肠杆菌nissle 1917，所述温控型表达载体在近红外激光照射下能够启动所述编码酪氨酸酶的基因的表达。9.按照本发明的另一方面，提供了一种上述工程化细菌在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物包括所述工程化细菌。10.优选地，所述抗肿瘤药物还包括能在肿瘤微环境中释放cu2+与酪氨酸的铜纳米颗粒。11.优选地，所述铜纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：将cys-tyr二肽水溶液和naoh溶液的混合液逐滴滴加到cuso4溶液中，滴加的同时不停搅拌，滴加完成后离心、去上清，用乙醇溶解沉淀，真空冷冻干燥得到铜纳米颗粒cunps固体。12.按照本发明的另一方面，提供了一种生产黑色素的方法，包括如下步骤：将上述工程化细菌发酵培养，向发酵液中加入cu2+和l-酪氨酸，在高于42℃温度下诱导培养，合成黑色素。13.优选地，所述在高于42℃温度下诱导培养为在45℃恒温诱导培养至少24h。14.优选地，所述在高于42℃温度下诱导培养为用功率密度为1.5w/cm2的808nm激光照射发酵液至少15min后继续培养。15.优选地，在诱导培养的同时，向发酵液中通入氧气。16.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：17.(1)本发明构建了一种可温控表达酪氨酸酶(tyrosinase，tyr)的工程化细菌。酪氨酸酶(单酚单加氧酶ec1.14.18.1)是一种参与黑色素合成的含铜酶，利用分子氧，该酶催化l-酪氨酸羟基化为l-多巴(甲酚酶活性)，随后氧化为多巴醌(儿茶酚酶活性)，再通过一系列非酶催化的氧化还原反应聚合形成黑色素。黑色素作为光热转换效率高、生物相容性好、安全有效的光热治疗剂，在活体肿瘤治疗中表现出良好的抑瘤效果。利用本发明构建的工程化细菌可将黑色素靶向递送至肿瘤组织，增强对肿瘤细胞的杀伤效果；同时利用温控型表达载体，可从时空上控制工程菌在肿瘤微环境中定殖后再高效表达酪氨酸酶，并合成黑色素，进而增强靶向肿瘤治疗效果；细菌联合光热治疗，一方面可导致肿瘤细胞免疫原性死亡，使肿瘤抗原暴露，协同增强细菌的免疫治疗效果；另一方面，较强的热效应在杀伤肿瘤细胞的同时可将肿瘤组织中的细菌根除，降低细菌在肿瘤组织中过度增殖带来的潜在疗后毒副作用。18.(2)本发明对表达载体上编码酪氨酸酶的基因进行了密码子优化，使其易于在大肠杆菌宿主中表达，提高翻译效率，进而提高酪氨酸酶表达水平。19.(3)大肠杆菌nissle 1917(ecn)是一种革兰氏阴性细菌，具有显著的益生菌特性，ecn不具有致病性，在体内遇血清极易被清除，目前ecn已被授权作为一种药物治疗疾病。本发明构建工程化大肠杆菌nissle 1917，生物安全性高，且ecn具有较强的肿瘤靶向及肿瘤内定殖能力，能有效诱发机体抗肿瘤免疫反应，是一种良好的抗肿瘤细菌药物。本发明工程化细菌中的温控型表达载体在近红外激光照射下能够启动表达，相比于恒温诱导，可大大缩短诱导时间，且抗肿瘤治疗时可操作性更强。20.(4)本发明提供一种包含可温控表达酪氨酸酶的工程菌的药物，该工程菌可在肿瘤组织增殖的同时大量表达酪氨酸酶，通过体内本身存在的或者铜纳米粒cunps为其定点提供的cu2+和底物酪氨酸，进一步氧化酪氨酸合成生物光热剂黑色素，在肿瘤局部实现黑色素的持续积累与放大，用于肿瘤光热联合免疫治疗。本发明采用非致病性的工程菌为载体，可通过外部光照控制启动合成生物相容性良好的黑色素作为治疗药物，具有较高的生物安全性，有望应用于肿瘤的临床治疗当中。21.(5)黑色素(melanin)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内结构复杂多样的生物聚合物色素，具有许多不同的功能，包括保护人类和动物免受紫外线损伤、抗生素功能、体温调节、自由基损伤和一些神经系统参与。本发明提供一种利用工程化细菌发酵生产黑色素的方法，工程菌在高温诱导下表达酪氨酸酶，然后将l-酪氨酸转化为黑色素，并分泌到胞外，该方法成本低廉、工艺简单、产出高，并且微生物生产的黑色素无毒，无害，稳定性好。22.(6)本发明研究了工程化细菌合成黑色素的优化条件，发现光热诱导15min后即可达到恒温诱导24h类似的升温效果，且随着光热诱导时间的增加，工程菌的光热升温效果也随之增强，说明光热诱导具备更高的黑色素产生效率。另外研究发现，工程菌发酵液中氧气含量增加，黑色素产量能大大提高。附图说明23.图1为本发明实施例1构建的pbv220-vs1-6×his质粒图谱。24.图2为本发明实施例2中ecn(a)和mel@ecn-t(b)的tem图像。25.图3为本发明实施例2中ecn-t所合成黑色素的傅里叶变换红外光谱。26.图4为本发明实施例3中不同诱导条件下mel@ecn-t的光热升温曲线。27.图5为本发明实施例3中不同诱导条件下细菌中histag蛋白westernblot检测结果。28.图6为本发明实施例3中不同通气条件下mel@ecn-t的光热升温曲线。29.图7为本发明实施例4中不同浓度mel@ecn-t的光热升温曲线。30.图8为本发明实施例4中od600＝0.8的mel@ecn-t在不同功率密度的近红外光下照射的光热升温曲线。31.图9为本发明实施例4中mel@ecn-t的光热稳定性曲线。32.图10为本发明实施例4中mel@ecn-t的光热转换效率。33.图11为本发明实施例5中不同浓度的mel@ecn-t在808nm激光照射(1.5w·cm-2，5min)下或无激光照射对h22细胞的细胞毒性。34.图12为本发明实施例5中h22细胞与不同浓度的mel@ecn-t共孵育后经808nm激光照射(1.5w·cm-2，5min)或无激光照射的荧光成像，活细胞被calcein-am染成绿色，死细胞被pi染成红色。35.图13为本发明实施例6制备的cunps的tem图像。36.图14为本发明实施例6中cunps的流体力学尺寸分布图。37.图15为本发明实施例6中cunps的x射线光电子能谱分析图。38.图16为本发明实施例6中cunps的x射线衍射图像。39.图17为本发明实施例6中cunps在体外模拟肿瘤微环境中cu2+释放情况。40.图18为本发明实施例7中尾静脉注射ecn和ecn-t溶液后不同时间点小鼠肿瘤组织的荧光成像(a)及其半定量分析(b)。41.图19为本发明实施例7中尾静脉注射ecn-t溶液后不同时间点牺牲小鼠取各主要组织进行涂板计数结果。42.图20为本发明实施例8中不同处理组(pbs组、ecn-t组、ecn-t+cunps组、ecn-t+laser组、ecn-t+cunps+laser组)肿瘤研磨样品的histag蛋白western blot检测结果，以表征肿瘤组织中的酪氨酸酶表达。43.图21为本发明实施例8中不同处理组(pbs组、ecn-t+cunps组、ecn-t+cunps+laser组、ecn-t+cunps+hbo组、ecn-t+cunps+laser+hbo组)肿瘤研磨样品中黑色素的相对含量，以pbs组含量为基准。44.图22为本发明实施例9中ecn-t体内光热联合免疫治疗策略的给药流程图。45.图23为本发明实施例9中h22荷瘤小鼠经不同处理后用808nm laser照射(1.5w·cm-2，5min)时肿瘤组织的升温曲线。46.图24为本发明实施例9中h22荷瘤小鼠经不同处理后肿瘤生长曲线。47.图25为本发明实施例9中h22荷瘤小鼠经不同处理后瘤重。48.图26为本发明实施例9中h22荷瘤小鼠经不同处理后肿瘤图像。49.图27为本发明实施例9中h22荷瘤小鼠经不同处理后肿瘤组织的h&e染色图像。具体实施方式50.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。51.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。52.实施例1工程化大肠杆菌ecn-t的构建53.本实施例提供的工程化大肠杆菌ecn-t构建具体过程如下：54.以含有噬菌体温度敏感基因ci857的pbv220载体作为骨架，引入氨苄青霉素抗性基因，将来源于巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)的酪氨酸酶基因(vs1)与六组氨酸(6×his)标签序列连接在一起，并克隆到pbv220载体中，得到重组质粒pbv220-vs1-6×his，其质粒图谱如图1所示。其中，本发明对vs1基因进行了密码子优化，使其易于在大肠杆菌宿主中表达，得到如序列表中seq id no.1所示的vs1基因。再将质粒pbv220-vs1-6×his通过电击转化法导入到大肠杆菌nissle 1917(ecn)中，电击条件为电压2.5kv、电容25μf、电击时间4ms，使用含100μg·ml-1amp的lb固体平板筛选阳性转化子，挑取平板上长出来的单菌落至液体培养基中培养，提取质粒进行酶切验证，结果表明工程化大肠杆菌ecn/pbv220-vs1-6×his构建成功。对原始菌以及工程菌ecn-t胞内蛋白质表达分析得出，酪氨酸酶基因vs1在工程菌中成功表达。55.在含100μg·ml-1amp的lb固体平板上挑取工程化大肠杆菌单菌落于100μg·ml-1amp的lb液体培养基中培养，待细菌生长一段时间后培养基变浑浊，即获得工程化大肠杆菌ecn-t，可在高于42℃的温度下被诱导高表达酪氨酸酶。56.实施例2利用工程化大肠杆菌ecn-t发酵培养生产黑色素57.选取45℃恒温诱导作为诱导酪氨酸酶表达的条件，在生长到平台期的ecn-t菌液中加入0.2mm硫酸铜(cuso4)、40mg·l-1酪氨酸(tyr)，而后转移到45℃的恒温培养振荡器中培养24h，得到含黑色素的细菌mel@ecn-t。利用透射电子显微镜(tem)观察mel@ecn-t的形貌特征，以ecn为对照，将稀释到一定浓度的样品滴加至碳支持膜铜网上，待样品干燥后，上样至ht7700型透射电子显微镜在100kv电压下进行观测，结果如图2所示。通过tem观察到mel@ecn-t仍保持与野生ecn类似的椭球细菌结构，尺寸也未发生明显变化，且mel@ecn-t内外对比度明显增强，证实了细菌内部大量合成了黑色素疑似物。58.工程菌生产黑色素的提取和纯化：将培养24h的细菌发酵液在7500g下离心15min，去除细菌和碎片。之后用6mol/l hcl将上清液的ph值调节到2.0，静置4h，然后在9000g下离心15min收集沉淀，得到黑色素粗提物。再依次在氯仿、乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂中进行抽提，最后得到的固体物用蒸馏水洗涤四次，9000g离心15min，得到纯化的黑色素。纯化后的黑色素经冻干保存在-20℃。59.工程菌所生产黑色素的验证：根据已报道的微生物来源黑色素的表征方法，通过傅里叶红外光谱ftir对纯化后的黑色素进行验证，如图3，可看出此黑色素光谱具有明显的真黑色素光谱特征。本实施例结果表明，ecn-t可在45℃恒温诱导条件下大量合成黑色素。60.实施例3mel@ecn-t生产黑色素诱导条件的优化61.本实施例探究了不同诱导条件及时间、不同通气条件下的黑色素合成量。62.(1)诱导条件及时间的优化63.除了45℃恒温诱导以外，激光照射也能起到类似的诱导效果，在生长到平台期的ecn/pbv220-vs1-6×his菌液中加入0.2mm cuso4、40mg·l-1tyr后，用功率密度为1.5w/cm2的808nm激光照射菌液，选择不同的照射持续时间，可得到黑色素含量不同的mel@ecn-t。通过光热升温实验来评估各组黑色素含量，根据不同诱导条件将mel@ecn-t分为五组，45℃诱导24h(h-24h)、808nm激光照射(保持菌液温度45℃)分别诱导5min(l-5m)、10min(l-10m)、15min(l-15m)、20min(l-20m)，诱导完成后，以lb为对照，取各组样品1ml，使用808nm近红外激光照射10min，功率密度为1.5w·cm-2，同时利用flir红外热成像仪监测各组光热升温情况。从图4可以看出，随着光热诱导时间的增加，其产生的mel@ecn-t的光热升温效果也随之增强，光热诱导15min后即可达到恒温诱导24h类似的升温效果，表明此时两者黑色素产量接近，这也说明光热诱导具备更高的黑色素产生效率。64.此外，为评估本发明工程菌ecn-t不同诱导条件下表达的酪氨酸酶含量，用western blot分别检测了未诱导、恒温诱导15min(h-15m)、光热诱导15min(l-15m)以及恒温诱导24h(h-24h)的ecn-t中tyr-histag的表达，同时还检测了野生型ecn中histag的表达。结果如图5所示，光热诱导15min的ecn-t样品的histag蛋白条带与恒温诱导24h的ecn-t样品差异较小，都保持在较高的水平。而恒温诱导15min的蛋白条带的强度则显著偏低，仅稍高于未诱导的ecn-t本底表达，表明光热诱导相同时间的ecn-t样品比恒温诱导的样品酪氨酸酶表达量明显提高，甚至光热诱导15min即可达到恒温诱导24h的表达效果。65.本实施例光热升温与western blot结果都表明，光热诱导可大大缩短ecn-t的诱导时间，使在小鼠肿瘤局部光热诱导表达酪氨酸酶成为可能，因此选择光热诱导15min作为后续体内光热治疗策略的诱导条件。66.(2)通气条件的优化67.分别在45℃恒温诱导ecn-t的过程中，往培养瓶中通氧气(o2组)、通氮气(n2组)和不作处理(normal组)，诱导培养24h后，同(1)中操作检测不同组光热升温情况，评估黑色素含量。68.从图6可以看出，随着o2含量的增加，ecn-t合成的黑色素也逐步增加。这表明o2含量的增加可明显促进ecn-t对黑色素的合成。69.实施例4mel@ecn-t的体外光热性能的检测70.为评价mel@ecn-t的体外光热性能，分别取1ml od600为0.1、0.2、0.4、0.8的mel@ecn-t菌液于1.5ml离心管中，以等体积lb为对照，功率密度为1.5w·cm-2，用808nm近红外激光照射10min，监测各组光热升温情况。此外，取4ml od600为0.8的mel@ecn-t菌液分为4组，每组1ml，分别调整功率密度为0.5、0.75、1、1.5w·cm-2，以lb为对照，用808nm近红外激光照射10min，监测各组光热升温情况。71.通过测定不同浓度(以od600反映细菌浓度)以及不同光照功率密度下mel@ecn-t的光热升温曲线(图7和图8)，结果显示，在808nm近红外光照射下，mel@ecn-t菌液温度明显上升，且升温幅度随着浓度以及光照功率密度的增加而不断提升。当光照功率密度为1.5w·cm-2时，在od600分别为0.1、0.2、0.4和0.8时，升温幅度分别为15.1、21、29和40.4℃，而在同样的条件下，lb的温度只升高了3.6℃，这说明菌液温度的升高主要源于用于合成黑色素的mel@ecn-t的光热效应。72.为验证合成黑色素的mel@ecn-t的光热稳定性，取1mlmel@ecn-t菌液，使用808nm近红外激光于1.5w·cm-2的功率下照射10min，待冷却后，再次照射10min，如此反复5次，监测并记录其温度变化情况。如图9所示，每次照射的菌液升温幅度基本保持一致，显示出极其良好的光热稳定性。73.为测定合成黑色素的mel@ecn-t的光热转化效率，先用uv-vis紫外分光光度计测得mel@ecn-t菌液在808nm处的吸光度，再取0.5ml样品于1.5ml离心管中，用808nm近红外激光照射样品，调节功率密度为1.5w·cm-2，使用红外热成像仪监测菌液的温度，每30s记录一次，直到菌液的温度基本不再变化达到稳定。关闭激光器，让菌液自然降温到室温，监测此过程菌液的温度变化，每30s记录一次，完成数据收集后按照文献报道(w.feng et al,adv mater,2019,31(5):1805919)的方法计算mel@ecn-t的光热转换效率，得出其光热转换效率高达58.6％(如图10所示)，远高于一般的无机光热纳米粒子。74.通过本实施例一系列的光热性能评价，证实了本发明mel@ecn-t优异的体外光热性能，可作为肿瘤光热治疗的理想光热剂。75.实施例5mel@ecn-t体外对肿瘤细胞的光热杀伤毒性的检测76.(1)cck-8细胞毒性实验77.利用0.4μmtranswell小室将细菌(上室)与h22肝癌细胞(下室)分隔开以评价mel@ecn-t对细胞的光热杀伤毒性，并通过cck-8检测试剂盒进行具体检测。取对数生长期的h22细胞计数，离心后用新鲜培养基重悬，在24孔板内每孔接种2.0×105个h22细胞，并控制总体积同为1ml。分别在实验组的transwell上室中加入od600为0.125、0.25、0.5的mel@ecn-t菌液300μl，对照组上室加等量的rpmi-1640培养基，每个组设4个平行孔。之后将不光照组放入37℃恒温co2培养箱中孵育6h，而光照组预先孵育2h后用1.5w·cm-2的808nm近红外激光照射5min后，再孵育4h。孵育完成后，吸出细胞于200g离心5min除去上清，pbs洗涤2次后加入1ml培养基重悬，各组分别取100μl加入到96孔板当中，每孔加入10μl cck-8试剂，37℃下孵育至对照组溶液变成橙黄色，用多功能酶标仪检测各组溶液的a450，根据cck-8检测试剂盒说明计算得出细胞存活率。78.如图11所示，在1.5w·cm-2的808nm激光照射下，由于mel@ecn-t良好的光热升温性能，不同浓度的mel@ecn-t与h22细胞共孵育并进行光热处理后，均可对h22细胞造成一定程度的抑制作用，并且随着mel@ecn-t浓度的升高，细胞生长受到的抑制也越强。当mel@ecn-t的od600为0.5时，细菌光热导致细胞存活率降低至43.9％，显著低于control组，而相同浓度mel@ecn-t的非光热组细胞存活率为93.8％，与control组无显著性差异。上述结果表明，本发明mel@ecn-t可对肿瘤细胞造成有效的光热杀伤效果，且在无光热的条件下不会对细胞造成明显损伤，显示出良好的生物相容性。79.(2)calcein-am/pi活死细胞染色实验80.采用calcein-am/pi活死细胞染色试剂盒来评价光热前后h22细胞的活性。同(1)中操作进行mel@ecn-t对h22细胞的光热杀伤实验，获得处理后的各组h22细胞，离心除去上清，并用pbs洗涤2次，之后加入配好的calcein-am、pi混合染液，在37℃下共孵育15min，离心除去染料，洗涤两次后用pbs重悬，滴到洗净的共聚焦皿中，在fv3000激光共聚焦显微镜下观察细胞活死情况。活细胞和死细胞分别被染上绿色荧光(calcein-am)和红色荧光(pi)。81.为了更为直观地观察mel@ecn-t对肿瘤细胞的光热杀伤效果，本实施例通过钙黄绿素乙酰氧基甲基酯(calcein-am)和碘化丙啶(pi)对与不同浓度mel@ecn-t孵育并接受光热处理的h22细胞进行活死染色，研究其中活细胞和死细胞的比例。如图12所示，control组和control+laser组的h22细胞显示出极高的活细胞比例，即单独808nm激光照射不会显著影响h22细胞的活性。mel@ecn-t的非光照组也未观察到死细胞的显著增多，证明mel@ecn-t本身无明显的暗毒性。同时给予mel@ecn-t与808nm激光照射处理组则表现出对h22细胞明显的浓度依赖性光热杀伤作用，当mel@ecn-t的od600为0.5时，光热可对h22细胞造成显著杀伤。82.以上结果共同证明了本发明mel@ecn-t体外对肿瘤细胞的光热杀伤效果显著，是一种出色的光热治疗药物，有助于推进ecn-t治疗策略在动物体内光热抗肿瘤的研究。83.实施例6cunps的制备与表征84.(1)cunps的制备85.ecn-t在光热诱导下黑色素的合成需要cu2+与tyr的参与，因此本实施例构建了一种可在肿瘤部位释放cu2+与cys-tyr的铜纳米颗粒cunps。具体制备方法如下：配制2.5mm的cuso4溶液10ml，再配制浓度为10mm的cys-tyr二肽水溶液和naoh溶液各5ml，将两者混合，利用微量注射泵将混合液逐滴加入到cuso4溶液当中，滴加的同时用搅拌器不停搅拌，反应5min，待混合液滴加完成后，停止反应，10000rpm离心6min，即可得到cunps。去上清后用乙醇溶解，用真空冷冻干燥机冻干得到cunps固体。86.(2)cunps的形貌结构表征87.将(1)中离心收集到的cunps溶解于乙醇中，使用纳米粒度仪在室温下平衡2min后检测cunps的粒径分布。88.利用透射电子显微镜观察cunps的形貌特征，将稀释到一定浓度的cunps样品滴加至碳支持膜铜网上，室温静置直至膜干燥，上样至ht7700型透射电子显微镜在100kv电压下进行观测。89.利用tem对cunps进行观察，如图13所示，cunps呈现出cu内核与cys-tyr二肽配位，二肽之间相互交联的结构，且结构较稳定，cu内核的平均尺寸为80nm左右，进一步通过动态光散射dls测得其平均流体力学直径为222.3±1.4nm(图14)。90.使用axis supra+x射线光电子能谱仪(xps)对cunps固体粉末进行检测，分析cunps中铜离子的价态。x射线光电子能谱结果(图15)显示cunps中的铜离子以二价的形式存在，可用于瘤内释放cu2+，参与ecn-t合成酪氨酸酶。91.使用x’pert3 powder x射线衍射仪(xrd)检测cunps固体粉末的x射线衍射峰，扫描角度：10-70°。分析cunps的晶体结构信息发现，cunps为无定形结构(如图16所示)，且衍射峰的位置与cys-tyr二肽一致，证明了铜纳米粒子对cys-tyr的成功装载。92.(3)评价cunps的cu2+释放能力93.用gsh浓度1mm、h2o2浓度0.1mm、ph＝6.5的pbs来模拟肿瘤氧化还原微环境，以其作为释放介质，将cunps溶液置于透析袋中，与37℃恒温摇床中释放，分别在5、10、15、20、25、30、60、120、240、720min等时间点取5ml外层释放介质，利用电感耦合等离子光谱发生仪(inductive coupled plasma emission spectrometer，icp)测定其中的cu2+，计算得出cunps在体外模拟肿瘤微环境下的cu2+释放量随时间变化情况。94.cunps的cu2+释放结果(图17)表明，在gsh浓度1mm、h2o2浓度0.1mm、ph＝6.5的pbs中，cunps可迅速释放cu2+，30min内可释放49.5％，1h内达到73.2％，证明了cunps在体外模拟肿瘤微环境下出色的cu2+释放能力。95.实施例7ecn-t在小鼠体内不同组织中的蓄积与增殖情况的评估96.(1)小动物活体荧光成像97.为研究ecn-t的肿瘤靶向能力，以ecn为对照，用ir-780荧光染料标记细菌细胞，给h22荷瘤balb/c雄性小鼠(每组3只)尾静脉注射相同剂量的ecn与ecn-t，分别在0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144h等时间点将小鼠麻醉后置于ivis lumina xr小动物活体成像系统中观察ir-780荧光在肿瘤组织中的分布，并进行荧光定量。98.如图18所示，小鼠荧光成像结果中可直接观察到ecn、ecn-t在肿瘤组织的蓄积，证明ecn-t保留了细菌良好的肿瘤靶向性，且ecn-t在注射后72h，肿瘤内的蓄积量达到高点，此后一直维持在较高的水平，这为体内光热治疗时间点的选择提供了重要参考。99.(2)细菌涂板计数100.为研究ecn-t的组织分布以及在肿瘤中的增殖能力，对h22荷瘤balb/c雄性小鼠(每组3只)尾静脉注射约106cfu的ecn-t，分别在1、2、3、7、14天牺牲该时间点组别的小鼠，收集心、肝、脾、肺、肾等主要脏器以及皮下肿瘤，用pbs清洗干净并称重，而后通过组织研磨机进行研磨，再稀释成合适的倍数梯度，吸取100μl样品滴加到预先倒好的含amp固体培养基平板表面，用涂布棒均匀涂抹开，将平板置于37℃恒温培养箱培养24h后，统计各组平板上生长的单菌落个数(cfu)。101.结果如图19所示，ecn-t经静脉注射后可到达体内各大器官，且随着时间流逝ecn-t在各脏器中含量越来越少，体现了机体免疫系统对细菌的清除。与之相反，肿瘤中的ecn-t在初始的3天浓度仍逐渐升高，远超初始注射量106cfu，并且在细菌达到峰值后依然可以持续保持高浓度存在10天以上，这表明ecn-t可在肿瘤免疫抑制微环境中发生免疫逃逸，进而在肿瘤乏氧区域大量繁殖。102.以上结果表明，ecn-t的肿瘤靶向与蓄积能力极强且能在肿瘤局部大量增殖，并于静脉注射后第3天左右细菌种群密度达到峰值，有利于进行下一步肿瘤内部黑色素药物放大的治疗策略。103.实施例8ecn-t瘤内酪氨酸酶和黑色素产量的评估104.(1)western blot分析105.根据ecn-t治疗过程中的不同处理将小鼠分为四组：pbs组、ecn-t组、ecnt+cunps组、ecn-t+laser组、ecn-t+cunps+laser组，治疗完成后处死小鼠收集皮下肿瘤，在pbs中清洗干净并称重，再用组织研磨机进行充分研磨，按肿瘤质量将样品用pbs稀释成20mg·ml-1的肿瘤组织悬液。取20μl肿瘤组织悬液于1.5ml离心管中，加入等体积含1mm pmsf的ripa裂解液冰上裂解30min后，再加10μl 5×loading buffer，置于100℃下煮沸10min至溶液透亮，得到后续western blot的实验样品，用抗histag抗体检测各组肿瘤组织中tyrosinase-histag融合蛋白的含量。106.由于酪氨酸酶的合成与光热诱导和cu2+有关，故控制此两种变量进行实验。如图20所示，同时给予cunps与光热诱导的ecn-t+cunps+laser组肿瘤组织中酪氨酸酶含量显著高于其他组，而仅注射cunps(ecn-t+cunps组)与仅光热诱导(ecn-t+laser组)只能引起ecn-t酪氨酸酶表达量的小幅增加。以上结果表明，当cunps和光热诱导条件同时满足时，富集到肿瘤的ecn-t可原位大量表达酪氨酸酶。107.(2)黑色素检测108.根据ecn-t治疗过程中的不同处理将小鼠分为四组：pbs组、ecn-t+cunps组、ecn-t+cunps+hbo组、ecn-t+cunps+laser组、ecn-t+cunps+laser+hbo组，治疗完成后处死小鼠收集皮下肿瘤，经称重、研磨、稀释后得到相同浓度(20mg·ml-1)的肿瘤组织悬液。将肿瘤组织悬液在60℃下用浓度为1m的naoh处理一夜，离心后将各组溶液上清分至96孔板中，每组100μl，设4个副孔，用紫外-可见分光光度计检测各组样品的a492，评价各组合成黑色素的相对含量。109.将不同处理组肿瘤中黑色素分离后用比色法检测结果如图21所示，同时给予光热诱导与hbo处理的ecn-t+cunps+laser+hbo组肿瘤组织中黑色素含量显著增加，a492是pbs组的3.6倍，而其他组的吸光度相对较低，与pbs组相比均无显著性差异。上述结果表明，在cunps存在下，对肿瘤进行光热诱导与hbo处理可显著提高ecn-t原位合成黑色素的效率。110.实施例9ecn-t光热联合免疫抑瘤效果评价111.(1)小鼠肿瘤光热升温实验112.按照图22所示的给药流程对小鼠进行抑瘤实验：对每只h22荷瘤balb/c雄性小鼠(每组3只)静脉注射约106cfu的ecn-t，待细菌完成肿瘤靶向富集并繁殖3天后，按小鼠体重进行瘤内注射浓度为1mg·kg-1的cunps，可在瘤内释放cu2+和cys-tyr，而后第一次激光照射诱导15min，此后肿瘤区域的ecn-t将大量表达酪氨酸酶，24h后高压氧(hbo)处理1.5h，提高肿瘤局部o2含量，这一过程tyr将在酪氨酸酶催化作用下与o2反应大量合成黑色素，再过24h待黑色素积累到一定量后，对各组小鼠进行第二次激光照射皮下肿瘤(1.5w·cm-2 808nm laser照射10min)，即细菌联合光热治疗(photothermal therapy，ptt)，黑色素发生光热转换。根据ecn-t治疗过程中的不同处理将小鼠分为以下五组：pbs+laser+hbo+ptt组、ecn-t+cunps+ptt组、ecn-t+cunps+laser+ptt组、ecn-t+cunps+hbo+ptt组、ecn-t+cunps+laser+hbo+ptt组，通过flir红外热成像仪监测肿瘤每分钟的温度变化情况，据此绘制肿瘤光热升温曲线。113.如图23所示，随着照射时间的增加，ecn-t+cunps+laser+hbo+ptt组的肿瘤组织升温明显，激光照射10min后其升温幅度达22.3℃，并且肿瘤最终温度达到55℃以上，可对肿瘤细胞造成有效的光热杀伤。而作为对照组的pbs+laser+hbo+ptt组温度仅升高至43℃，表明此功率密度的激光照射对于正常组织是安全可靠的。此外，ecn-t+cunps+ptt组、ecn-t+cunps+laser+ptt组、ecn-t+cunps+hbo+ptt组也表现出不同程度的升温效果，证明在缺少光热诱导以及hbo处理的情况下，ecn-t依然可凭借本底表达在肿瘤部位产生一定量的黑色素。上述结果显示，经ecn-t治疗处理的小鼠肿瘤组织光热效应提升明显，反映了肿瘤局部黑色素的大量合成，证明了本发明ecn-t光热治疗策略对于实现肿瘤局部黑色素药物放大是行之有效的。114.(2)ecn-t光热治疗策略的体内抑瘤效果评价115.将h22荷瘤balb/c雄性小鼠按不同治疗处理分为八个组：pbs组、pbs+laser+hbo+ptt组、ecn-t+cunps组、ecn-t+cunps+ptt组、ecnt+cunps+laser+hbo组、ecn-t+cunps+laser+ptt组、ecn-t+cunps+hbo+ptt组、ecn-t+cunps+laser+hbo+ptt组。第一天对每只h22荷瘤小鼠(每组6只)注射约106cfu的ecn-t，第四天瘤内注射浓度为1mg·kg-1的cunps，2小时后激光照射诱导15min，第五天进行hbo处理1.5h，第六天对各组肿瘤进行808nm激光照射治疗10min，再对小鼠进行14天的培养。治疗期间每天固定时间对小鼠进行称重并用游标卡尺监测肿瘤的长径和短径，利用公式“体积＝1/2×长径×(短径)2”计算得到肿瘤体积，并绘制抑瘤曲线评价ecn-t的光热治疗效果。治疗结束后处死小鼠收集肿瘤，拍照并记录瘤重；而后用4％多聚甲醛固定肿瘤，石蜡包埋切片并进行h&e染色，用光学显微镜观察肿瘤h&e染色切片，考察各组肿瘤组织损伤情况和细胞凋亡状况。116.如图24所示，pbs+laser+hbo+ptt组与pbs组相比，肿瘤生长并未受到明显的抑制，甚至肿瘤体积有所增加，这表明单纯两次激光照射与hbo处理不仅不能抑制肿瘤，反而可能因为hbo的促血管生成作用导致肿瘤恶化。同样ecn-t+cunps组与ecn-t+cunps+ptt组的肿瘤生长趋势也证明只靠ecn-t、cunps以及激光照射对肿瘤生长的影响不明显，而ecn-t+cunps+laser+hbo组结果表明光热诱导与hbo处理能促进肿瘤乏氧区域生成黑色素，而不能对肿瘤生长产生明显抑制作用。而当细菌完成诱导合成黑色素后并进行第二次光热治疗的ecn-t+cunps+laser+hbo+ptt组能够取得良好的肿瘤治疗效果，6只荷瘤小鼠中有5只的肿瘤被完全清除，对肿瘤的抑制率达到99.3％。此外，ecn-t+cunps+laser+ptt组与ecn-t+cunps+hbo+ptt组对肿瘤的抑制率分别为64.6％和59.1％，表明缺少光热诱导或hbo处理ecn-t仍可合成少量黑色素，起到一定的光热治疗效果。117.图25和图26中瘤重数据和肿瘤图像显示的结果同上述肿瘤生长曲线的结果相一致。图27中肿瘤组织的h&e染色结果显示，ecn-t+cunps+laser+hbo+ptt组图像中几乎观察不到肿瘤细胞的存在，而ecn-t+cunps+laser+ptt组与ecn-t+cunps+hbo+ptt组肿瘤细胞也相当稀疏，数量明显低于其他组。以上结果共同表明，ecn-t光热联合免疫治疗策略可对肿瘤细胞造成有效的光热杀伤，引起h22皮下瘤光热消融，甚至达到根除原发肿瘤的效果。118.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。









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